Bioinformatica
Corso di Laurea Specialistica in Informatica
RNA non codificanti ed
RNA regolatori
29/04/2011
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
Piccoli RNA non codificanti
• Gli RNA non codificanti (ncRNA) giocano un ruolo
fondamentale nei sistemi biologici complessi, pur
non codificando alcuna proteina.
• Tra i ncRNA maggiormente caratterizzati troviamo i
tRNA (RNA transfer) e gli rRNA (RNA ribosomiali).
• Recenti studi hanno però rivelato diverse altre classi
di ncRNA, aventi funzioni catalitiche e strutturali.
• Questi RNA sono componenti essenziali di complessi
riboproteici (RNP), all’interno dei quali svolgono il
ruolo di guida e riconoscimento di sequenze
nucleotidiche target attraverso il meccanismo di
complementarità delle basi.
Alcuni tipi di ncRNA
• tRNA (RNA transfer): adattatori per la
conversione del codice genetico a triplette
nel codice amminoacidico delle proteine.
• rRNA (RNA ribosomiali): il cuore
dell’apparato traduzionale all’interno del
quale svolgono sia funzione strutturale che
catalitica (formazione del legame peptidico).
• snRNA (Piccoli RNA nucleari): sono
componenti critici dello spliceosoma e
svolgono un ruolo importantissimo nella
maturazione degli mRNA.
Alcuni tipi di ncRNA
• snoRNA (Piccoli RNA nucleolari): sono
implicati nel processamento e nella
maturazione degli RNA ribosomali e di altri
tipi di RNA, aumentandone l’attività.
• miRNA e siRNA: sono piccoli RNA in grado di
regolare l’espressione genica a livello posttrascrizionale, silenziando specifiche molecole
di mRNA.
• piRNA: sono coinvolti nel silenziamento
trascrizionale dei retrotrasposoni nelle cellule
germinali.
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
Regolazione genica post-trascrizionale
• L’espressione genica può essere regolata a livello posttrascrizionale.
• Non è detto che tutto l’mRNA che viene trascritto a
partire da un certo gene venga utilizzato per sintetizzare
la relativa proteina.
Trascrizione
Traduzione
RNA regolatore
• La regolazione post-trascrizionale dell’espressione
avviene per mezzo di molecole di RNA regolatore.
genica
• L’RNA regolatore è una molecola di RNA in grado di legarsi ad
una molecola di mRNA impedendone la traduzione.
• L’RNA regolatore riconosce il suo bersaglio in base al principio
di appaiamento complementare delle basi.
• Gli RNA regolatori sono solitamente piccole molecole di RNA
con una certa struttura secondaria, ma con una regione a
singolo filamento complementare ad una regione a singolo
filamento dell’mRNA bersaglio.
• Nella regolazione basata su small RNA è importante anche la
struttura secondaria della molecola di RNA target.
RNA regolatore e inibizione della
traduzione
• L’appaiamento di una molecola di RNA
regolatore ad una regione a singolo
filamento di mRNA può provocare:
– L’inibizione
della
traduzione
senza
distruzione della molecola di mRNA
– La degradazione della molecola di mRNA
• In entrambi i casi si ha il “silenziamento”
del gene, il cui effetto è la mancata
produzione della proteina corrispondente.
• Perché un RNA regolatore possa legarsi ad
una molecola di mRNA bersaglio:
– La regione di legame sul bersaglio deve
essere accessibile, ovvero meno stabile
(deve contenere una regione, anche piccola,
a singolo filamento).
– Il legame con l’RNA regolatore deve essere
energeticamente favorevole.
Accessibile
Non accessibile
RNA antisenso
• Un gene antisenso codifica per un RNA la cui sequenza è
complementare a quella di un RNA bersaglio:
Target RNA
5’-AGGACTACCGACTAGCATA-3’
3’-TCCTGATGGCTGATCGTAT-5’
Antisense RNA
• A volte il gene antisenso si trova sul filamento opposto a quello
del gene bersaglio, pertanto i due RNA saranno perfettamente
complementari.
• Altre volte gli RNA antisenso vengono trascritti da altre regioni
del genoma, per cui si potrebbe avere una parziale
complementarità delle loro basi.
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
I microRNA
• I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA in
grado di regolare negativamente l’espressione di
geni target a livello post-trascrizionale.
• Sono dei piccoli RNA antisenso che mostrano
complementarità parziale (quasi sempre) o totale
(più raramente) delle loro basi rispetto a quelle dei
loro mRNA bersaglio.
• I miRNA sono in grado di impedire la traduzione dei
loro
target
preservandone
la
stabilità
o
provocandone la distruzione.
• Un miRNA può avere più target ed uno stesso mRNA
può essere target di diversi miRNA.
I microRNA (2)
• I miRNA sono trascritti da particolari
sequenze genomiche (geni miRNA) situate di
solito in regioni intergeniche o negli introni di
altri geni.
• Molti miRNA sono altamente conservati, in
specie anche molto lontane tra loro (Es.
Caenorhabditis elegans e Homo sapiens).
• Sono presenti anche nei virus, probabilmente
come meccanismo di autoregolazione e di
interferenza con le cellule ospiti, ma non nei
batteri.
I geni miRNA
• I geni miRNA hanno sequenze tali da generare trascritti di RNA
con struttura a forcina (hairpin):
loop
GGCCUGUUCCCCGAGACUAUUGAUCUCGGGGAACAGGCC
CUA
GGCCUGUUCCCCGAGA
A
CCGGACAAGGGGCUCU
A
UGA
• Si parla di strutture di tipo STEM-LOOP. I due bracci dello STEM
possono non essere totalmente complementari:
Biogenesi dei miRNA
• I trascritti primari dei geni
miRNA sono chiamati primiRNA.
• I pri-miRNA vengono
tagliati da un enzima
chiamato Drosha in
molecole più piccole, a
doppio filamento,
chiamate pre-miRNA.
• I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma e tagliati in RNA
doppio filamento più piccoli da un altro enzima chiamato Dicer.
• Uno dei due filamenti contiene il miRNA maturo, lungo
solitamente tra i 19 e i 25 nucleotidi, che viene incorporato in
un complesso proteico chiamato RISC.
miRNA
• I miRNA nei RISC sono in grado di legarsi a siti
specifici di mRNA provocandone il silenziamento:
• L’appaiamento della sequenza del miRNA con il suo
sito bersaglio non è perfetto, ma può contenere
bulge e loop.
• Dalle
coppie
miRNA/target
individuate
sperimentalmente emergono alcune regolarità nelle
modalità di appaiamento.
Osservazioni sulle modalità di
appaiamento
• La regione iniziale (5’) del miRNA è chiamata seed e
sembra essere la regione più importante nel
silenziamento.
• E’ lunga solitamente tra i 7 e i 10 nucleotidi, ma
esistono casi di seed più corti o più lunghi.
• Tale regione è solitamente appaiata in modo
perfettamente complementare al suo target:
• Il primo nucleotide del miRNA non è determinante e
può non essere appaiato.
Osservazioni sulle modalità di
appaiamento
• La regione a valle del seed contiene solitamente un bulge
o un loop:
• La regione 3’ del miRNA mostra solitamente una
complementarità imperfetta al suo target.
• Le coppie G:U nella regione del seed sembrano essere
sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse,
mentre sono abbastanza comuni nella regione 3’.
• Infine, le regioni di legame dei miRNA si trovano nella
regione 3’ UTR degli mRNA bersaglio.
Funzioni dei miRNA
• I miRNA svolgono un ruolo centrale nel controllo di numerosi
processi fisiologici:
– Sviluppo
– Differenziamento cellulare
– Apoptosi
• Aberrazioni nella loro espressione (mancanza, sotto o sovra
espressione) sono correlate a diversi tipi di patologie:
– Cancro
– Malattie neurodegenerative
– Malattie cardiache
• Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è
fondamentale nella comprensione dei processi biologici, dei
fenotipi patologici e, di conseguenza, nel design di terapie
innovative.
Un problema bionformatico: la ricerca dei
geni miRNA
• Ad oggi, nell’uomo, sono stati individuati più di 1400
miRNA.
• Sono noti miRNA in molti altri eucarioti e nei virus.
• La ricerca di nuovi geni miRNA è uno dei compiti
principali della bioinformatica nello studio della
regolazione genica post-trascrizionale.
• Data una sequenza genomica ci si chiede se essa
contiene uno o più geni miRNA.
• Come
nella
gene
prediction,
è
importante
individuare regolarità nelle sequenze dei geni miRNA
e nei dintorni, al fine di stabilire regole per la
predizione.
• Ad oggi la regola principale è la forma di stem-loop
assunta dal trascritto primario (pri-miRNA).
Ricerca di geni miRNA
• I tool per la predizione di geni miRNA si
basano dunque sulla ricerca di sequenze in
grado di assumere la forma di stem loop
qualora venissero trascritte in RNA.
• Ogni sequenza di questo tipo contiene quindi
due sottosequenze (quasi) complementari,
l’una in senso opposto all’altra (stem)
separate da una regione “loop”:
loop
GGCCUGUUCCCCGAGACUAUUGAUCUCGGGGAACAGGCC
CUA
GGCCUGUUCCCCGAGA
A
CCGGACAAGGGGCUCU
A
UGA
Ricerca di geni miRNA (2)
• Uno dei problemi principali nella ricerca di
geni miRNA è la presenza di un numero
elevato di potenziali hairpins nei genomi
eucariotici.
• Il problema quindi è l’identificazione degli
hairpin corretti.
• Occorre quindi trovare dei buoni filtri per la
riduzione dello spazio di ricerca.
Ricerca di geni miRNA: Approcci basati
sulla riduzione dello spazio di ricerca
• Conservazione
– miRScan
Trova potenziali hairpin in un genoma ed utilizza
BLAST per trovare omologhi in un’altra specie.
– miRFinder
Confronta sequenze intergeniche di due diversi
genomi (es. Arabidopsis e Riso) e utilizza una
serie di regole empiriche per selezionare gli
hairpin più probabili.
La conservazione tra le specie può ridurre
significativamente il numero di hairpin, ma
taglia fuori tutti i geni miRNA specie-specifici.
Ricerca di geni miRNA: Approcci basati
sulla riduzione dello spazio di ricerca (2)
• Match intragenomici
– miMatcher
Questo tool si basa sul fatto che un miRNA
possiede almeno un target nel genoma. Dato un
possibile target, vengono ricercati match perfetti
con i possibili hairpin individuati nel genoma.
Questo approccio è però praticabile solamente
nelle piante, nelle quali la complementarità tra
miRNA e target è totale, a differenza degli animali
nei quali la complementarità è parziale.
Ricerca di geni miRNA: Approcci dedicati Classificazione degli hairpin
• Molti metodi per la ricerca di geni miRNA si
basano su caratteristiche termodinamiche e
osservazioni empiriche.
• Gli hairpin vengono individuati attraverso
tool per la predizione della struttura
secondaria dell’RNA (Es. Mfold) e classificati
in base all’energia libera.
• Una volta individuati gli hairpin
termodinamicamente più favorevoli, vi sono
due possibili approcci per la classificazione:
– Metodi basati su regole empiriche
– Metodi di machine learning
Ricerca di geni miRNA: Approcci dedicati Metodi basati su regole empiriche
• Questi metodi si basano su tutte le
caratteristiche osservate nei pre-miRNA noti.
• Esempi di regole:
– Non più di un nucleotide ogni 20 può essere
spaiato.
– Almeno 16 delle basi nel miRNA maturo devono
essere appaiate.
– Il contenuto di nucleotidi G e C (indice di
maggiore stabilità) deve essere tra il 30% e il
70%.
Ricerca di geni miRNA: Approcci dedicati Metodi di Machine Learning
• Nei metodi di machine learning, le regole vengono
estratte e verificate automaticamente a partire da
esempi (pre-miRNA validati sperimentalmente).
• Approcci tipici:
– HMM (Hidden Markov Models)
– SVM (Support Vector Machines)
• Questi metodi ricevono in input un hairpin, lo
analizzano e restituiscono in output un valore 1 o 0,
a seconda che l’hairpin abbia le caratteristiche di un
miRNA o meno.
• I modelli vengono addestrati utilizzando set di
hairpin già classificati.
miRBase
• miRBase è la banca dati ufficiale dei miRNA:
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/
• Contiene le sequenze dei miRNA maturi e
degli stem-loop precursori, oltre a riferimenti
bibliografici ed informazione sui target.
miRBase
• Cliccando su Browse si può
database organizzato per specie:
sfogliare
l’intero
miRBase
• Per ogni miRNA sono riportati:
Lo stem-loop…
…ed il miRNA maturo
Un problema bioinformatico: la ricerca di
target per i miRNA
• Sebbene si conoscano più di 1400 miRNA nell’uomo
(e molti altri in altre specie), solo per il 10% di essi
è stato individuato almeno un target.
• Problema:
– Dato un miRNA, determinare i suoi possibili mRNA target
• Esistono numerosi tool su web che offrono servizi di
predizione di target per miRNA:
–
–
–
–
TargetScan
PicTar
miRanda
…
• Molti di essi offrono dei database di predizioni già
effettuate da consultare.
Un tool di predizione di target: miRanda
• miRanda è il tool per la predizione di target per
miRNA sviluppato al Memorial Sloan-Kettering
Cancer Center (New York).
• La prima versione (1993) è stata utilizzata per
determinare target per miRNA in Drosophila
melanogaster.
• I concetti base dell’algoritmo di miRanda sono:
- Appaiamento delle sequenze miRNA/Target
- Valutazione termodinamica dei duplex predetti
- Analisi della conservazione dei siti di legame
• Così come le sequenze dei miRNA, anche i loro siti di
legame sui target sono spesso conservati: questo
tipo di informazione è alla base del filtro di miRanda.
L’algoritmo di miRanda
(a) (b) Si considerano le
sequenze dei miRNA e
dei 3’ UTR dei trascritti
di Drosophila.
(c1) miRNA e UTR vengono
allineati
per
complementarità.
Appaiamenti ammessi:
- A:U
- G:C
- G:U
Requisito fondamentale
di
un
buon
appaiamento:
- Alta complementarità
nella regione del seed.
(c2) Viene valutata la struttura secondaria (predetta) dei duplex ottenuti:
minore è l’energia libera, più stabile è il legame.
(d) Viene effettuata l’analisi di conservazione, confrontando i siti di legame dei
trascritti con gli UTR degli ortologhi in Drosophila pseudoobscura e
Anopheles Gambiae (mediante allineamento). I target con siti conservati
vengono ordinati per energia e memorizzati nel database.
MicroRNA.org
• Il web-server di miRanda si trova all’indirizzo:
http://www.microrna.org
• Qui è possibile accedere alle predizioni effettuate per
uomo, topo e ratto.
miRanda
• E’ possibile effettuare la ricerca per miRNA (Es. miR15a):
• E’ possibile effettuare la ricerca per target (Es. Bcl2):
miRanda – Ricerca per miRNA
• Cerchiamo i target predetti per il miRNA miR-15a in Homo
sapiens:
• Cliccando su “view targets” si ottiene l’elenco dei target, con i
dettagli degli appaiamenti:
miRanda – Ricerca per target
• Cerchiamo i miRNA per i quali il gene Bcl-2 è un target predetto:
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
I siRNA
• I siRNA sono piccole molecole di RNA simili ai
miRNA.
• Non sono codificati da sequenze genomiche ma
derivano da altre molecole di RNA più grandi, spesso
di origine esogena (es. virus).
• Come i miRNA vengono tagliati dal Dicer ed
incorporati nel RISC.
• Si appaiano con complementarità totale a siti
specifici sui loro target (in CDS o UTR)
provocandone la degradazione.
siRNA ed RNA Interference
• I siRNA sono le principali molecole utilizzate nell’RNA
Interference (RNAi) artificiale.
• I siRNA vengono disegnati ad hoc sulla base del sito
di legame scelto sul trascritto da silenziare ed hanno
generalmente complementarità totale al loro target.
• Le molecole di siRNA vengono solitamente introdotte
nelle
cellule
mediante
vettori
virali,
virus
ingegnerizzati che trasportano l’informazione per la
codifica dei siRNA nel loro genoma.
• Un uso tipico dell’RNAi è il knock-out artificiale dei
geni, ovvero il silenziamento dell’espressione di uno
più geni per studiarne gli effetti e le conseguenze e
di conseguenza le funzioni svolte.
RNA interference
• Premio Nobel 2006 per la Medicina
Craig Mello ed Andrew Fire