Costanti di ionizzazione
MODALITA’ DI PREPARAZIONE DI
SOLUZIONI TAMPONE
Esempio: calcolare il pH di una soluzione tampone che contiene
CH3COOH 0,10 M e CH3COONa (acetato di sodio) 0,20 M.
Ka dell’acido acetico = 1.7 x 10-5
In soluzione acquosa il sale acetato di sodio si dissocia come segue:
CH3COONa(s)  CH3COO-(aq) + Na+(aq)
per cui la concentrazione CH3COO- (la base) in soluzione risulta
pari a 0.20 M
Il pKa dell’acido acetico è:
pK a  log1,7  10-5  4,77
Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ottiene:

[CH 3COO ]
pH  pK a + log
[CH3 COOH]
4.77 + log
pH= 4.77 + log 2  4.77 + 0.30  5.07
0.20
0.10
Esempio: calcolare il pH di una soluzione tampone che contiene NH3
0.10 M e NH4Cl 0.20 M.
Kb di NH3 = 1.8 x 10-5
In soluzione acquosa il sale cloruro di ammonio si dissocia come
segue:
NH4Cl(s)  NH4+(aq) + Cl-(aq)
per cui la concentrazione di NH4+ (l’acido) in soluzione risulta pari
a 0.20M
Sapendo che Kw= Ka x Kb → Ka= Kw/Kb
Ka = 1.0 x 10-14/1.8 x 10-5 = 5.6 x 10-10
il pKa è 9,25
Si applica poi l’equazione di Henderson-Hasselbalch:
[NH 3 ]
0.1
9.25 + log
pH  pK a + log
+
[NH 4 ]
0.2
pH= 9.25 + log 0.5  9.25  0.30  8.95
Esempio: calcolare il rapporto fra la concentrazione di acido
acetico e di ione acetato necessari per preparare una soluzione
tampone a pH 4,9.
pKa dell’acido acetico = 4,77
Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ha:
[base]
pH  pK a + log
[acido]
[CH 3COO  ]
4,9  4,77 + log
[CH 3COOH]
[CH 3COO  ]
log
 4,9  4,77  0,13
[CH 3COOH]
[CH 3COO  ]
 100,13  1,35 [CH 3COO  ]  1,35  [CH 3COOH]
[CH 3COOH]
Ciò vuol dire che per ogni mole di acido acetico è necessario
aggiungere 1,35 moli di acetato di sodio
Esempio: calcolare il pH e la M della soluzione tampone preparata
miscelando 20ml di NaOH 0,2M e 50ml di CH3COOH 0,1M
moli NaOH = 0,02L x 0,2mol/L = 4·10-3 moli
moli CH3COOH= 0,05L x 0,1mol/L = 5 ·10-3moli
CH3COOH +NaOH  CH3COO- + Na+ + H2O
(5mmol) (4mmol) (4mmol) (4mmol) (4mmol)
(5-4=1mmol)
Volume finale = 70ml
[CH3COOH] = 1/70 = 0,014 M
[CH3COO-] = 4/70 = 0,057 M
Applicando l’equazione di Henderson-Hasselbalch si ottiene:
[base]
pH  pK a + log
[acido]
0,057
pH  4,77 + log
0,014
-
[CH 3COO ]
=
+
pH 4,77 log
[CH 3COOH]
pH= 4,77+ 0.6 = 5,37
La M del tampone preparato è:
M = 5 mmoli (4 mmol CH3COO- +1 mmol CH3COOH)/70 ml = 0,0714M
Procedure di preparazione di una soluzione tampone
Una soluzione tampone è sempre costituita da un acido debole HA e dalla sua
base coniugata A- oppure da una base debole B e dal suo acido coniugato B+.
Le soluzioni tampone possono essere preparate in vari modi:
I campioni da separare in SDS-PAGE vengono prima fatti bollire per 5 minuti in un
tampone (sample buffer) contenente SDS e β-mercaptoetanolo
E’ stato dimostrato empiricamente che affinchè tutte le proteine siano rivestite
uniformemente con SDS è sufficiente una concentrazione di SDS dello 0,1%
(peso/vol)
L’SDS è aggiunto nel sample buffer, nello stacking gel e nel resolving gel
Il sample buffer contiene anche un colorante tracciante ionizzabile (blu di
bromofenolo), il quale consente di seguire l’andamento della corsa elettroforetica
Sono presenti inoltre saccarosio e glicerolo, i quali hanno la funzione di rendere
più densa la soluzione del campione, consentendo di stratificare senza problemi il
campione sul fondo del pozzetto di caricamento del gel dove è presente il
tampone di corsa
Il blu di bromofenolo, essendo una molecola molto piccola, non subisce alcun
effetto frizionale per cui rappresenta il fronte del gel
L’elettroforesi termina, e dunque viene tolta la corrente, quando il blu di
bromofenolo raggiunge il fondo del gel
•
Il gel di separazione, generalmente lungo 10 cm, è polimerizzato all’interno di due
lastrine di vetro, separate tra loro da due spaziatori di Teflon spessi 1,5 mm
•
Lo stacking gel è versato sopra il gel di risoluzione e vi si inserisce un pettine per
formare i pozzetti per il caricamento dei campioni
•
Lo stacking gel è generalmente lungo 1 cm