Coltivazione dei virus
animali
in vitro: colture cellulari
in vivo: sistemi animali
1
Colture cellulari
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rappresentano il metodo di elezione
per la coltivazione dei virus animali
coltivazione del virus su larga scala
infezione sincrona
condizioni chimico-fisiche standard
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2
Colture cellulari
condizioni chimico-fisiche
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• Condizioni chimiche
-
terreno di coltura chimicamente definito: soluzione isotonica di
sali, glucosio, vitamine, aminoacidi, pH 7.3 (H2CO3/CO2),
addizionato con siero per fornire fattori di crescita.
• Condizioni fisiche
-
temperatura di 37°C
3
COLTIVAZIONE DI VIRUS SU LINEE CELLULARI
- Linee di cellule primarie
5-10 cicli di subcoltivazione
- Linee di cellule diploidi da tessuto embrionale
cicli di 40-50 generazioni
- Linee cellulari permanenti*
crescono in monostrato o in sospensione
producono tumori solidi negli animali
* - Trasformazione spontanea
- Trasformazione con virus oncogeni
- Linee tumorali
Non utilizzabili per produrre vaccini
4
Colture cellulari
Cellule in monostrato
crescono su superfici solide
(plastica, vetro).
Sono le più usate in
virologia.
Cellule in sospensione
5
Colture cellulari
•La maggior parte delle cellule in coltura replica ogni 24-48 ore e deve essere subcoltivata ogni 3-4 giorni.
•Le cellule in sospensione sono diluite in nuovo terreno di coltura
•Le cellule in monostrato devono essere rimosse dalle superfici di crescita con enzimi
proteolitici (tripsina) e sostanze chelanti ( EDTA).
Tripsina/EDTA
6
Cappa a flusso laminare
biohazard
sterilità
sicurezza
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7
INFEZIONI VIRALI
Sospensione virale
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1 h a 37°C
cellule permissive
cellule non permissive
mancano di un fattore
necessario per la
crescita del virus
Produzione di virus
infettante
cellule resistenti
non hanno recettori
o un fattore essenziale
per l’espressione del genoma
C.P.E.
8
Animali da laboratorio
Storicamente il primo metodo per studiare la propagazione dei virus.
– Svantaggi - 1) costoso, 2) non omogeneo, 3) porta alla generazione di
mutanti virali, 4) problemi etici,
– Vantaggi - 1) fornisce informazioni sui meccanismi patogenetici del
virus, 2) alcuni virus possono essere studiati solo in vivo,
9
10
Titolazione virale
• La quantità del virus è detta titolo (il titolo virale può cambiare
a seconda del metodo usato)
• Il titolo è la misura della concentrazione del virus e viene
espressa in unità/ml
• Può essere rilevata mediate vari saggi - saggio delle placche,
saggio di formazione di foci di trasformazione, saggio di
diluizione limite, saggio di emoagglutinazione
.
11
Misurazione diretta del numero di virioni
Microscopia Elettronica
La sospensione virale è posta su un retino
per ME e colorato.
L’inclusione di una quantità conosciuta di
sfere di latex permette la quantizzazione
del virus
sfere di latex
poxvirus (a
forma di mattone
e leggermente
più piccoli)
12
Particelle virali vs. virioni infettanti
• Non tutte le particelle virali sono infettanti. In molti casi la maggior
parte dei virioni non è infettante
• il rappoto tra il n° totale di particelle virali e i virioni infettanti è
definito come rapporto particelle/PFU
13
From Principles of Virology , Flint et al ASM press
CICLO UNICO di REPLICAZIONE
“One-Step” growth
VIRUS
BATTERI
Number
of viable
bacteria
inoculated
Amount of virus inoculated
Time
Replication in
progress
Production of
infective virus
Lag phase
Time
Exponential
growth
Latency
14
CURVA DI CRESCITA
Infectious virus/cell
1.000
Intracellular virus
100
Latent
period
Eclipse period
Extracellular virus
10
Late phase
Early phase
Yield
per
cell
1
0
0
2
5
Genome
replication
8
10
16
20
30
Time (hours)
p.i.
Virus
Release
Assembly
Virus
15
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-Penetrazione • Tutti i virus devono attraversare il doppio strato lipidico (i virus
delle piante e dei batteri devono attraversare anche la parete
cellulare).
• La presenza o l’assenza dell’ involucro virale determina una
notevole differenza nel meccanismo di penetrazione
16
- Adsorbimento virale primo evento del ciclo di replicazione virale
Riconoscimento della cellula target
da parte di proteine virali (VAP)
VAP = Virus Attachment Proteins
interazione elettrostatica - seguita da interazione idrofobica localizzata
• - limita l’infezione a specifici tipi di cellule (cellule permissive)
• determina il tropismo del virus
– Tropismo tissutale - es.: rosolia (cellule epidermiche) . morbillo
(ghiandole salivari)
– Tropismo di specie - es.:. influenza (cellule di mammifero e di uccelli),
poliovirus (cellule di primati)
17
regione di adesione
VAP
Famiglia
Virus
VAP
Picornaviridae
Reoviridae
Rhabdoviridae
Orthomyxoviridae
Paramyxoviridae
Retroviridae
Adenoviridae
Herpesviridae
Rhinovirus
Rotavirus
VSV
Influenza A
Sendai
HIV
Adenovirus
HSV
VP1
VP7
G protein
HA
HN
gp120
Fiber protein
gC - gD
(HA di Orthomyxoviru
18
Recettori di VIRUS ANIMALI
Virus
Recettore
funzione
Influenza virus
acido sialico
Usato anche da
Reo- e corona- virus
carboidrato
Virus del Morbillo
CD46 e SLAM
Usato anche da
HHV6
proteina di superficie
dei linfociti B e T
Poliovirus
tipo molecolare
Pvr
proteina simile a Ig
Rhinovirus
ICAM-1
adesione intercellulare
proteina simile a Ig
Virus della Rabbia
recettore per
acetilcolina
proteina neuronale
19
ENDOCITOSI
• Semliki Forest virus (SFV), un togavirus rappresenta il primo
esempio di penetrazione per endocitosi
•Studi di microscopia elettronica (1980) dimostravano che il
virus penetra mediante vescicole - oggi note come vescicole
ricoperte di clatrina o CCV)
A. Helenius20
Endosomi e virus
•
Gli endosomi sono utilizzati
dalla cellula per l’assunzione di
nutrienti e fattori di crescita
•
Una caratteristica degli
endosomi è la loro progressiva
acidificazione - dovuta
all’azione di H+/ATPasi
vacuolari
•I virus utilizzano questo meccanismo
cellulare per:
•penetrazione
•spoliazione
• per i virus gli endosomi inoltre
assicurano:
–trasporto citosolico mediante il
sistema dei microfilamenti e dei
microtubuli
–specifico ambiente ionico e stato
redox
–lipidi per la fusione
(penetrazione)
From Cell Biology, Pollard and Earnshaw, Saunders
21
in alcuni casi sono richieste
interazioni con più proteine
Adsorbimento
e penetrazione
di Adenovirus
corecettore
22
Penetrazione di
Adenovirus
• entrata mediante endocitosi
clatrina-dipendente
• l’abbassamento
del
pH
determina la perdita delle
fibre e lisi della membrana
degli endosomi da parte della
preteine della base dei
pentoni
From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press
23
Reovirus
•
Raro esempio di virus che richiede la
fusione degli endosomi con i lisosomi
•
I Reovirus hanno un doppio capside,
stabile a pH bassi (virus gastrointestinali; rotavirus)
•
Le proteasi lisosomiali degradano il
capside esterno - formazione della
particella subvirale
•
Le fasi successive del processo di
penetrazione non sono ancora del tutto
conosciute
24
From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press
Picornaviridae
penetrano per endocitosi
in maniera pH indipendente
l’interazione con il
recettore determina
cambi conformazionali
nella struttura del virione
- perdita della VP4 e
formazione della
particella A (meno densa
e più rilassata)
From Principles of Virology, Flint et al,
ASM Press
25
•
Le particelle A sono idrofobiche e possono formare un
poro sulla membrana endosomiale o citoplasmatica della cellula
ospite.
From Principles
of Virology,
Flint et al, ASM
Press
26
Meccanismi di penetrazione: FUSIONE
• 1) Fusione sulla plasmamembrana (pH-indipenden
• 2) Fusione negli endosomi (pH-dipendente)
1
2
27
PARAMYXOVIRIDAE
Struttura dei virioni
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PARAMYXOVIRUS
28
Meccanismo di Fusione dei Paramyxovirus
29
PENETRAZIONE VIRALE
due recettori sono meglio di uno
Glicoproteina gp120
Glicoproteina gp41
adsorbimento
entrata
HIV
Recettore = CD4 (linfociti T)
+
Co-recettori = CXCR4 o CCR5 (recettori di
chemiochine)
30
* Fusina usata come recettore da alcuni isolati di HIV-2
MECCANISMO DI FUSIONE DI HIV
•
In seguito al riconoscimento del recettore CD4, avviene un cambio
conformazionale nella proteina gp120 che causa l’esposizione di un
peptide fusogeno presente nella proteina gp41.
gp120 di HIV
riconosce il
recettore CD4 e il
co-recettore (CCR5
o CXCR4)
From Principles of
Virology, Flint et al, ASM
Press
31
Penetrazione di
Herpesvirus
•
Riconoscimento dei recettori eparansolfato da parte
della gC.
•
Successivo adsorbimento della glicoproteina gD ad un
co-recettore specifico
Molecole co-recettoriali
–
HveA
–
HveB
–
HveC
–
HveD
TNF-R
Nectin2
Nectin1
PVR
•
Fusione dell’involucro virale con la
plasmamembrana mediato da gB in
associazione con il complesso gH-gL.
•
Penetrazione del nucleocapside virale
32
FUSIONE pH-DIPENDENTE
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Virus influenzale
33
FUSIONE SULLA MEMBRANA ENDOSOMIALE
Il cambio di pH nell’endosoma ha un ruolo importante per la fusione
del virus influenzale.
Infatti, il virus presenta sul suo involucro la proteina M2 che a pH acido
forma un canale ionico che permette l’acidificazione del virione, e
promuove cambi conformazionali della proteina HA ed il distacco di M1
dai complessi M1/RNP
Sostanze che bloccano la proteina M2 inibiscono la penetrazione del
virus influenzale - amantadina (altamente specifica per i canali ionici
M2 virali, non ha effetto sui canali cellulari H+/ATPasi)
34
Fusione del virus influenzale
Cambio conformazionale di HA
estensione peptide fusogeno
pH neutro
pH acido
Virus
Rotazione
C-D 180
a. Monomero HA0 (550 aa) in presenza di proteasi = subunita’ HA1 (VAP) +
HA2 (Fusione), legate da legami S-S.
N-term di HA2 = peptide fusogeno (20 aa)
b. Struttura del dominio solubile di HA2 a pH neutro
c. Struttura del dominio solubile di HA2 a pH acido
Box A-C-D = a-eliche
35
virus a
RNA
Retrovirus e
virus a
DNA
( Poxvirus)
(ecc.
virus influenzali)
ecc.
nucleo
citoplasma
36
REPLICAZIONE DEI VIRUS a DNA
Tutti
i virus eucariotici a DNA replicano nel nucleo
•eccezione: poxvirus
VANTAGGI
• utilizzo di enzimi cellulari per la trascrizione
degli mRNA virali



RNA polimerasi II
Attivatori e co-attivatori trascrizionali
Enzimi per la sintesi del cap e per il processamento (splicing)
dei trascritti
• utilizzo di enzimi cellulari per la replicazione
del genoma

DNA polimerasi ed enzimi associati (girasi, ATPasi, elicasi,
primasi, RNasi, enzimi di riparo, ligasi)
37
Il trasporto citoplasmatico
Adenovirus
Herpesvirus
•I capsidi (o nucleocapsidi) si legano al citoscheletro e
utilizzano proteine dinamiche associate ai microtubuli (i.e.
dineina) per facilitare il loro trasporto intracellulare
38
Importo nucleare
Il nucleo della cellula è circondato da un doppio strato
lipidico - la membrana nucleare.
un’ulteriore barriera per il processo di infezione
• La membrana nucleare è fornita di canali di trasporto
- i pori nucleari
From Flint et al Principles of Virology ASM Press
39
Penetrazione nel nucleo
Trasporto del capside virale fino ai pori nucleari grazie alla
presenza di sequenze NLS in proteine capsidiche
Parvovirus
penetrazione
diretta del virus
Adenovirus
legame del capside al poro nucleare
“uncoating” finale del capside
• il DNA è “iniettato” nel nucleoplasma
capsidi vuoti di Virus Herpes
Simplex ai pori nucleari
40
Parvovirus
QuickT
im e™eun d
ecompr e
ssore TIFF (Noncompr esso) sononecessa
r i pe
r visualizzar equest'im magin
e.
•
•
•
•
Esempio di entrata diretta nel nucleo
Piccolo virus a ssDNA a simmetria icosaedrica (diametro 18-26 nm)
Penetrazione mediata endocitosi pH-dipendente
Il capside è formato da VP1, VP2 e VP3
•
VP1 contiene una sequenza di segnale di localizzazione nucleare (NLS)
•
La sequenza NLS si lega a recettori dei PORI NUCLEARI
(carioferine o importine) che permettono l’entrata diretta
del virus nel nucleo dove avviene la spoliazione
41
Uncoating di
Adenovirus
•
Trasporto mediato da dineina
•
Presenza di sequenze NLS in
proteine del capside (100 nm)
•
I capsidi vengono trasportati fino ai
pori.
ma………la massima grandezza
funzionale del poro nucleare è di 26
nm
•
Il capside si lega al poro nucleare,
subisce il disassemblaggio finale e il
DNA viene “iniettato” nel nucleo.
From Principles of Virology, Flint et al, ASM Press
42
Herpesvirus
presenza di sequenze NLS nelle proteine che formano il capside
il capside virale viene trasportato ai pori nucleari
• si lega al poro nucleare e subisce “uncoating”
finale
• il DNA è “iniettato” nel nucleoplasma.
Notare i capsidi vuoti
ai pori nucleari
From Whittaker Trends Microbiol 6: 178
43
Uncoating di Virus Influenzale
L’evento chiave per la spoliazione dei genomi del virus
influenzale è la dissociazione pH-dipendente tra la proteina di
matrice M1 ed i complessi RNP.
- I complessi RNP sono sufficientemente piccoli per traslocare
attraverso i pori nucleari.
- La nucleoproteina (NP) contiene sequenze NLS
44
From Whittaker Exp. Rev. Mol. Med. 8 February, http://wwwermm.cbcu.cam.ac.uk/01002447h.htm