Eredita’ X-linked Lezione 9 By NA Affetti entrambi i sessi, piu’ spesso le femmine anche se meno gravemente dei maschi per effetto dell’inattivazione X-linked dominante I figli di una donna affetta hanno il 50% di essere affetti, indipendentemente dal sesso Un maschio affetto avra’ tutte le figlie affette e tutti i figli sani By NA X-linked recessiva ? Lo stato di portatrice della madre e’ certo se ha fratelli o parenti maschi affetti Affetti quasi esclusivamente maschi I genitori di solito sono sani,la madre anche se portatrice puo’ essere asintomatica ? ? By NA ? ? ? Mosaicismo germinale Le femmine possono essere affette: 1. se il padre e’ affetto e la madre eterozigote 2. se l’inattivazione del cromosoma X non e’ casuale X inattivo By NA Inattivazione del cromosoma X Nel 1966 Mary Lyon formulo’ l’ipotesi che oggi porta il suo nome (lyonizzazione), per spiegare alcuni fenomeni osservati nelle cellule di mammifero di sesso femminile Si erano accumulate alcune osservazioni: Nei nuclei delle femmine e’ presente una masserella condensata che corrisponde al numero delle X meno 1 Lo stesso fenomeno si osserva nei maschi XXY, ma non nelle femmine X0 Marcando con timidina triziata nella tarda fase S si osserva la presenza di un cromosoma fortemente marcato che per dimensioni ed aspetto corrisponde al cromosoma X solo nelle cellule con almeno 2 cromosomi X. By NA Inattivazione del cromosoma X Altre osservazioni ottenute da Mary Lyon nei sui esperimenti sui topi: Femmine eterozigoti per 2 loci che determinano il colore del pelo e che mappano sul cromosoma X presentano mantello a chiazze (anche il gatto ha questo tipo di fenotipo) e non un colore uniforme anche se intermedio rispetto ai due colori. Il fenotipo e’ diverso se si osserva una eterozigote in cis o in trans: in cis: le macchie sono composte dei due colori in trans: le macchie sono o di un colore o dell’altro. By NA Esperimenti di Mary Lyon nei topi Femmine omozigoti BrBr/GrGr pelo a macchie Femmine doppio eterozigoti BrC/GrC in trans pelo a macchie By NA Femmine doppio eterozigoti BrC/GrC in cis macchie di due colori Mary Lyon Ipotesi di Mary Lyon: Uno dei due cromosomi X presenti nella linea somatica femminile, viene precocemente inattivato durante lo sviluppo embrionale. L’inattivazione e’ casuale. Come risultato la femmina e’ un mosaico di cellule funzionalmente emizigoti per uno o l’altro dei cromosomi X. By NA G6PD-HPRT Donna eterozigote G6PD+/- By NA Donna eterozigote HPRT+/- Cellule di donna eterozigote G6PD+/Coltura originaria Coltura di singolo clone Coltura di singolo clone Direzione migrazione Lenta Veloce By NA G6PD Inattivazione del cromosoma X L’inattivazione del cromosoma X avviene intorno al 15mo-16mo giorno dell’embriogenesi (l’embrione e’ composto di circa 5000 cellule). Una volta che un cromosoma X (materno o paterno) e’ stato inattivato lo sara’ in tutte le popolazioni cellulari che derivano da quella cellula. La casualita’ dell’inattivazione e’ tipica dei mammiferi: nei marsupiali viene inattivato preferenzialmente il cromosoma paterno. Nel topo le cellule del trofoblasto inattivano il cromosoma X paterno per una ragione tuttora ignota. La casualita’ viene meno in presenza di X riarrangiate By NA Zigote 15mo-16mo giorno Xmat Xpat Inattivazione del cromosoma X schema Inattivazione casuale Come avviene l’inattivazione e come viene mantenuta? By NA L’ inattivazione domande Vengono inattivati tutti i geni della X? No, inizialmente si riteneva che l’inattivazione coinvolgesse tutto il cromosoma, oggi sappiamo che non vengono inattivati i geni della regione pseudoautosomica : i geni di questa regione hanno un omologo sul cromosoma Y Non vengono inattivati geni che hanno pseudogeni sul cromosoma Y, e altri geni per i quali non si conosce la ragione. Comunque il cromosoma X risulta inattivato al 90% C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia l’inattivazione ? Come avviene e come si mantiene l’inattivazione? By NA Universita’ di Bari L’ inattivazione domande C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia l’inattivazione ? Si, la regione Xq13. In questa regione e’ presente il centro di inattivazione Xic che agisce in cis . E’ stato individuato un locus Xist che sembra essere il gene che controlla il processo di inattivazione. La mappatura di Xic e il clonaggio di Xist sono stati resi possibili grazie allo studio dei riarrangiamenti del cromosoma X in cui l’inattivazione non casuale: l’inattivazione dipende dal tipo di riarrangiamento By NA L’ inattivazione le traslocazioni X/Autosoma Xic agisce in cis: il frammento fisicamente separato non puo’ inattivarsi due copie Xp attive parte autosoma inattiva morte della cellula Inattivazione casuale dell’X X X/A By NA A/X A un cromosoma X attivo due autosomi attivi questo clone e’ l’unico che si ritrova L’ inattivazione X(isop), X(isoq) e X(del) Isocromosoma X del braccio corto non si ritrova mai Isocromosoma delezione del delezione del braccio lungo sempre inattivato se la delezione non coinvolge Xq13 del braccio lungo braccio corto sempre inattivato sempre inattivato (Sindrome di Turner) (Sindrome di Turner) (Sindrome di Turner) By NA L’ inattivazione Come avviene e si mantiene l’inattivazione? Il clonaggio di Xist (X-inactive specific transcript) non ha chiarito completamente il meccanismo: il prodotto di questo gene (15Kb) non ha ORF, si ritiene che appartenga alla classe dei geni il cui prodotto funzionale non e’ una proteina, ma un mRNA. Viene trascritto solo dal cromosoma inattivo, e’ espresso nel nucleo, promuove il processo di inattivazione rimodellando la cromatina attraverso l’ipoacetilazione degli istoni e la metilazione dei geni. Dall’inattivazione deriva l’eterocromatizzazione (corpo di Barr e la replica tardiva del cromosoma X inattivato By NA L’ inattivazione Come avviene e si mantiene l’inattivazione? Si ritiene che l’inattivazione venga ottenuta metilando le isole CpG. I geni presenti sul cromosoma inattivato sono ipermetilati se confrontati con gli omologhi dell’altro cromosoma o del cromosoma X del maschio. Ricordare che le isole CpG sono presenti al 5’ dei geni e si ritiene che rappresentino il sito di inizio della trascrizione. Una volta che la metilazione e’ avvenuta al momento di duplicare il DNA la citosina metilata verra’ riconosciuta come tale dall’enzima che metilera’ la citosina dell’elica neosintetizzata, garantendo il mantenimento By NA L’ inattivazione e l’eredita’ X-linked Ipotesi di Mary Lyon: Uno dei due cromosomi X presenti nella linea somatica femminile, viene precocemente inattivato durante lo sviluppo embrionale. L’inattivazione e’ casuale. Come risultato la femmina e’ un mosaico di cellule funzionalmente emiziogoti per uno o l’altro dei cromosomi X. La femmina portatrice di una patologia X-linked e’ “protetta” dalla presenza nel 50% delle sue cellule di un gene funzionante. L’inattivazione non casuale di un cromosoma X per effetto di un riarrangiamento puo’ aiutare a clonare un gene malattia By NA La distrofia muscolare di Duchenne DMD e di Becker BMD By NA DMD- RFLP Nel 1982 venne identificato il primo RFLP associato al locus DMD in Xp21. Nel giro di poco tempo altri RFLP permisero di eseguire il gene tracking. Non si trovarono pero’ polimorfismi con ricombinazione inferiore al 5%. Nel 1985 la mappa della regione era stata in parte ricostruita e la situazione che si presentava era: L1.28 10cM OTC 754 2cM C7 8cM 7cM DMD By NA 99-6 8cM D2 5cM DMD- X/autosomi Nel frattempo si erano raccolti i DNA di circa 20 ragazze affette da DMD che presentavano traslocazioni X/autosomi. Tutte presentavano il breakpoint sulla X in Xp21 ed erano casi sporadici. L’ipotesi era che il riarrangiamento avesse rotto il gene DMD e che per effetto dell’inattivazione preferenziale del cromosoma X normale, venisse manifestato il fenotipo Duchenne By NA DMDInattivazione due copie Xp attive parte autosoma inativa gene DMD attivo morte della cellula DMD Inattivazione casuale dell’X X X/A A/X A un cromosoma X attivo due autosomi attivi gene DMD non funzionante Affetta da DMD By NA DMD-XJ 1985 A Toronto un gruppo di ricercatori utilizzando il Dna di una donna DMD portatrice di una traslocazione X/21, riusci’ a clonare il breakpoint, e individuo’ una serie di cloni (XJ)che, oltre ad essere polimorfici, evidenziavano delezioni in alcuni pazienti DMD. rDNA rDNA By NA DMD? DMD- Clonaggio 1986 A Boston il gruppo di Kunkel utilizzando il DNA di un paziente, BB, portatore di un delezione citogenetica ed affettoda DMD, retinite pigmentosa, ritardo mentale e malattia granulomatosa cronica riesce a clonare il gene DMD. La loro strategia si baso’ sul clonaggio per sottrazione: il paziente era deleto per una grossa regione genomica, il suo DNA fatto riassociare con DNAnormale avrebbe lasciato in soluzione le sequenze normali non presenti nel DNAdeleto. Con quei cloni fu testata una libreria di cDNA di muscolo e vennero clonaticirca 8 cDNA che, testati sui pazienti, misero in evidenza delezioni. Lo zoo-blot confermo’ trattarsi di un gene conservato, la sequenza evidenzio’ nei pazienti mutazioni puntiformi di varia natura. By NA DMD-Distrofina Quale e’ il prodotto del gene DMD? L’RNA e’ lungo 13kb, la proteina ha un peso molecolare superiore a 400kDa, e’espresso dal muscolo, anche se costituisce solo lo 0.002% delle proteine totali.L’estremita’ N-terminale costituisce il dominio legante l’actina, segue un ampio dominio a bastoncello, con 24 ripetizioni di sequenze simili composte da 109 amminoacidi. Dopo questo dominio e’ presente un dominio ricco in cisteina leganteil Calcio, infine l’estremita’ C-terminale (420AA) interagisce con le altre proteine. N-terminale By NA ripetizioni ad elica dominio legante Ca C-terminale DMD-Distrofina Quale e’ la funzione del gene della distrofina? Fa parte di un complesso che attraversando la membrana collega i filamenti di actina del citoscheletro con la matrice extracellulare (membrana basale) Laminina sarcoglicani distroglicani sintrofine Actina By NA DMD-Becker La distrofia di Becker in che relazione e’ con DMD? Dall’analisi di linkage era gia’ emerso che avrebbero potuto essere alleliche Dopo il clonaggio del gene DMD le stesse sonde sono state testate sui pazienti affetti da BMD: sono evidenti delezioni e mutazioni puntiformi. tutte le evidenze sperimentali confermano che il locus e’ lo stesso. Non e’ stato possibile individuare una regione critica specifica per le due forme. Lo studio a livello di proteina ha evidenziato che in BMD la distrofina e’ sempre presente anche se piu’ corta o in minore quantita’ By NA Ricerca delle mutazione nel gene DMD Due terzi dei casi di Distrofia Muscolare di Duchenne sono dovuti a delezioni che coinvolgono uno o piu’ esoni Ci sono due “hot spot” di mutazioni: 5’ esoni dal 3 all’8 e al 3’ esoni dal 44 al 60 (principalmente 44-50) Si usa una PCR multiplex con reazioni prodotte da piu’ coppie di primer, ognuna delle quali amplifica uno specifico esone. Se c’e’ la delezione non c’e’amplificazione (naturalmente si sa quale e’ l’aspetto di una corsa elettroforetica di un maschio normale.) L’interpretazione nel caso delle femmine eterozigoti puo’ essere ambigua perche’ la X normale viene amplificata By NA