UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PALERMO
ISTITUTO DI CLINICA MEDICA I
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
“ANTICOAGULANTI E ADDITIVI
DI USO LABORATORISTICO
LORO INFLUENZA / INTERFERENZA”
Dott. Vincenzo Di Garbo
M.M.G. – Specialista in Cardiologia
Centro delle Dislipidemie e del Rischio Trombotico
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
GOOD LABORATORY PRACTICE
(“Buona Pratica di Laboratorio”)
LA STANDARDIZZAZIONE DEI METODI DI LABORATORIO
( SIA QUELLI RELATIVI AL PRELIEVO DEL CAMPIONE EMATICO
SIA QUELLI RELATIVI ALL’ESECUZIONE DEI TESTS )
E’ OGGI CONSIDERATA DI FONDAMENTALE IMPORTANZA
E VIENE SOLITAMENTE RIASSUNTA IN UNA DIZIONE
PRESA IN PRESTITO DAGLI ANGLOSASSONI:
La “GOOD LABORATORY PRACTICE”
FISIOPATOLOGIA
EMOSTASI E TROMBOSI
NELL’AMBITO DELLE ATTIVITA’
DI UN LABORATORIO DI ANALISI
UN SETTORE DI PARTICOLARE RILIEVO E’ COSTITUITO
DALLO:
“STUDIO DELL’EMOSTASI e DELLA TROMBOSI”,
I CUI TESTS RICHIEDONO
NON SOLO UNA PRECISA COMPETENZA
MA ANCHE UNA PROFESSIONALITA’ SPECIFICA.
FISIOPATOLOGIA
EMOSTASI E TROMBOSI
LA FISIOPATOLOGIA DELL’EMOSTASI E DELLA TROMBOSI
RICONOSCE DUE COMPONENTI FONDAMENTALI:
- LE PIASTRINE, CHE INTERVENGONO NELL’EMOSTASI PRIMARIA
(FASE RAPIDA CHE EVOLVE IN POCHI SECONDI)
- I FATTORI DELLA COAGULAZIONE, CHE INTERVENGONO
NELL’EMOSTASI SECONDARIA (FASE LENTA CHE SI ESAURISCE
IN POCHISSIMI MINUTI).
EMOSTASI PRIMARIA E SECONDARIA
LE DUE FASI POSSONO ESSERE TENUTE DISTINTE
PER I SEGUENTI MOTIVI:
1) ENTRANO IN AZIONE IN SUCCESSIONE TEMPORALE;
2) SI REALIZZANO CON MECCANISMI FISIOLOGICI IN PARTE INDIPENDENTI;
3) POSSONO ESSERE INDAGATE SEPARATAMENTE in laboratorio;
4) POSSONO GENERARE QUADRI PATOLOGICI per alterazioni delle
loro singole componenti (SIA IN SENSO QUANTITATIVO CHE FUNZIONALE);
5) POSSONO ESSERE INFLUENZATE INDIPENDENTEMENTE DA
DIVERSI FARMACI.
EMOSTASI PRIMARIA
(Fase vasculo-piastrinica)
RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO
LE PIASTRINE, MENTRE SCORRONO LIBERAMENTE SE IL VASO E’
INTEGRO, TENDONO INVECE AD ADERIRE ALLA BRECCIA VASALE
(ADESIVITA’ PIASTRINICA) in particolare al COLLAGENO
SOTTOENDOTELIALE. DOPO L’ADESIONE, LE PIASTRINE INIZIANO AD
AGGREGARE E, MEDIANTE IL RILASCIO PER UN PROCESSO DI
SECREZIONE (RELEASE REACTION) DI COSTITUENTI ENDOPIASTRINICI
(ADP,Trombossani, Fattore Piastrinico 3, Serotonina), RICHIAMANO ALTRE
PIASTRINE CON ULTERIORE ACCRESCIMENTO DEL COSIDETTO “TROMBO
BIANCO”, CHE E’ SUFFICIENTE AD ASSICURARE L’EMOSTASI IN VASI DI
PICCOLO CALIBRO A RIDOTTO REGIME PRESSORIO.
EMOSTASI PRIMARIA
(Fase vasculo-piastrinica)
RUOLO DELLE PIASTRINE – TROMBO BIANCO
LA FASE PIASTRINICA HA QUINDI UNA IMPORTANZA NOTEVOLE
NEL DETERMINISMO DELL’EMOSTASI PRIMARIA, MA NON E’
SUFFICIENTE PER L’EMOSTASI DEFINITIVA.
QUESTO SPIEGA LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE, QUANDO
SONO ALTERATI ALTRI SISTEMI EMOSTATICI, QUALI QUELLI DELLA
COAGULAZIONE, E LA FASE PIASTRINICA E’ NORMALE.
EMOSTASI SECONDARIA
(Fase coagulativa)
RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI
E’ LA FASE PIU’ IMPORTANTE DELL’EMOSTASI,
CHE PORTA IN CONDIZIONI NORMALI
AD UN ARRESTO PERMANENTE DELL’EMORRAGIA.
LE MANIFESTAZIONI EMORRAGICHE
CONSEGUENTI AD ALTERAZIONI DI QUESTA FASE
SONO INDUBBBIAMENTE PIU’ GRAVI DI QUELLE LEGATE
A COMPROMISSIONI DELLA FASE PIASTRINICA.
EMOSTASI SECONDARIA
(Fase coagulativa)
RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI
LA COAGULAZIONE SI COMPIE A SEGUITO DELLA FORMAZIONE DI
FIBRINA AD OPERA DI UN ENZIMA PROTEOLITICO, LA TROMBINA,
CHE TRASFORMA UNA PROTEINA DEL PLASMA, IL FIBRINOGENO
(FATTORE I) IN FIBRINA. IL MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE
DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA E’ ASSAI COMPLESSO, IN QUANTO
L’ATTIVAZIONE DELLA PROTROMBINA (FATTORE II) IN TROMBINA
E’ PRECEDUTA DA UNA SERIE NUMEROSA DI REAZIONI
ENZIMATICHE SUI FATTORI DELLA COAGULAZIONE, CATALIZZATE
DALLA PRESENZA DI IONI CALCIO.
EMOSTASI SECONDARIA
(Fase coagulativa)
RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI
LE REAZIONI DELLA FASE COAGULATIVA SONO INNESCATE DAL
CONTATTO CON SUPERFICI ESTRANEE (AD ES.,IN VIVO, COLLAGENE
SOTTOENDOTELIALE o, IN LABORATORIO, SUPERFICI DI VETRO o CAOLINO o
AC. ELLAGICO)
E PROCEDONO UTILIZZANDO COMPONENTI DI
ORIGINE ESCLUSIVAMENTE EMATICA (VIA INTRINSECA DELLA
COAGULAZIONE) O DA MATERIALE TROMBOPLASTINICO DI
ORIGINE TESSUTALE, DISPONIBILE IN CASO DI LESIONE DI
CONTINUO DELLA PARETE VASCOLARE (VIA ESTRINSECA DELLA
COAGULAZIONE).
EMOSTASI SECONDARIA
(Fase coagulativa)
RUOLO DEI FATTORI COAGULATIVI
NELLA FIGURA DELLA CASCATA COAGULATIVA ERANO
RAFFIGURATI ANCHE I DUE PRINCIPALI TESTS CHE STUDIANO LA
COAGULAZIONE: IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT) , CHE ESPLORA
IL SISTEMA ESTRINSECO, E IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA
PARZIALE ATTIVATO (aPTT), CHE ESPLORA IL SISTEMA
INTRINSECO.
L’ESECUZIONE DI QUESTI DUE TESTS CONSENTE DI VERIFICARE
NON SOLO LA PRESENZA NEL SISTEMA DI TUTTI I FATTORI DELLA
COAGULAZIONE, MA ANCHE SE SONO TUTTI FUNZIONALMENTE
EFFICIENTI.
TESTS DI LABORATORIO
TEST DI AGGREGABILITA’ PIASTRINICA ( sec. Born )
GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA
COAGULAZIONE
RUOLO DEGLI INIBITORI
IL SISTEMA COAGULATIVO E’ UN SISTEMA A CASCATA
AUTOAMPLIFICANTE (UNA VOLTA CHE UN PROENZIMA SI ATTIVA VA AD AGIRE
FATTORE SUCCESSIVO TRASFORMANDOLO IN ENZIMA ATTIVO E COSì VIA)
,
CULMINA NELL’ESPLOSIVA TRASFORMAZIONE
DEL FIBRINOGENO IN FIBRINA.
LE REAZIONI ENZIMATICHE DELLA COAGULAZIONE SONO,
COMUNQUE, CONTROLLATE E MODULATE DAGLI “INIBITORI
FISIOLOGICI DELLA COAGULAZIONE”, CHE RIVESTONO UNA
FONDAMENTALE IMPORTANZA NELLA IDENTIFICAZIONE DEI
PAZIENTI A RISCHIO PER TROMBOSI VENOSE ED ARTERIOSE.
SUL
CHE
GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA
COAGULAZIONE
ANTITROMBINA III – PROTEINA C / PROTEINA S
L’ANTITROMBINA III (AT III) E’ UN INIBITORE FISIOLOGICO DELLA
TROMBINA, DEL FATTORE X ATTIVATO (F. Xa) E DI ALTRE
PROTEASI SERINICHE DELLA CASCATA COAGULATIVA;
E’ DETTA ANCHE CO-FATTORE EPARINICO, PERCHE’ L’EPARINA ACCELERA
GRANDEMENTE LA SUA AZIONE DI CONTROLLO DELLA COAGULAZIONE.
LA PROTEINA C e LA PROTEINA S SONO PROTEINE VITAMINA K
DIPENDENTI CHE INIBISCONO IL F. VIII ED IL F. V.
IN PARTICOLARE E’ LA STESSA TROMBINA CHE LEGANDOSI ALLA
TROMBOMODULINA ENDOTELIALE ATTIVA LA PROTEINA C, LA CUI AZIONE
INIBENTE VIENE ACCELERATA DAL SUO COFATTORE PROTEINA S.
GLI INIBITORI FISIOLOGICI DELLA
COAGULAZIONE
ALTERAZIONI CONGENITE e S. TROMBOFILICA
NELLE TROMBOSI VENOSE O ARTERIOSE, DI RECENTE SONO
STATE IDENTIFICATE MUTAZIONI CHE POSSONO GENERARE UNA
CONDIZIONE DI PREDISPOSIZIONE ALLE MALATTIE
TROMBOEMBOLICHE quali: IL DEFICIT DI ANTITROMBINA III, DI
PROTEINA C, DI PROTEINA S, IL FATTORE V DI LEIDEIN, LA
MUTAZIONE DELLA PROTROMBINA E LE DISFIBRINOGENEMIE.
TALI CONDIZIONI PRESENTI DA SOLE O IN VARIA COMBINAZIONE
HANNO PERMESSO DI IDENTIFICARE “GRUPPI FAMILIARI AD
ALTISSIMO RISCHIO TROMBOEMBOLICO” CON NECESSITA’ DI UN
TRATTAMENTO ANTICOAGULANTE PREVENTIVO.
IL SISTEMA FIBRINOLITICO
COMPONENTE ANTI-EMOSTASTICA
LA FIBRINOLISI E’ IN REALTA’ UNA COMPONENTE
ANTI-
EMOSTATICA, IN QUANTO LA SUA ATTIVAZIONE DETERMINA LA
DISSOLUZIONE DEL COAGULO DI FIBRINA.
TUTTAVIA E’ IMPORTANTE CONSIDERARE LA FIBRINOLISI NEL
CONTESTO DELL’EMOSTASI, PERCHE’ UNA SUA ALTERAZIONE
PUO’ ESSERE RESPONSABILE SIA DI FENOMENI TROMBOTICI CHE
EMORRAGICI.
IL SISTEMA FIBRINOLITICO
LA PLASMINA
IL PRODOTTO FINALE DELLA FIBRINOLISI E’ LA PLASMINA,
ENZIMA PROTEOLITICO, CAPACE DI LISARE LA FIBRINA DEL
TROMBO (QUESTA REAZIONE GENERA IL COSIDETTO D-DIMERO).
TUTTAVIA LA CAPACITA’ LITICA DI QUESTO ENZIMA SI ESTENDE
SU ALTRI FATTORI DELLA COAGULAZIONE, FRA CUI ANCHE
IL FIBRINOGENO (QUESTA AZIONE GENERA I COSIDDETTI FDP).
IN ALCUNI STATI PATOLOGICI (C.I.D., CIRROSI) SI PUO’
EVIDENZIARE UNA IPERPLASMINEMIA, CHE PROVOCA UNA GRAVE
DEPLEZIONE DEI FATTORI COAGULATIVI E CHE SI MANIFESTA
CON IMPONENTI EMORRAGIE.
IL SISTEMA FIBRINOLITICO
ATTIVAZIONE DELLA PLASMINA
LA PLASMINA E’ GENERATA DAL PLASMINOGENO; QUESTA
ATTIVAZIONE PUO’ ESSERE REALIZZATA ATTRAVERSO TRE
DIVERSE VIE: - ATTIVAZIONE INTRINSECA (MEDIANTE IL FATTORE
XIIa, LA CALLICREINA ED IL CHININOGENO AD ALTO PESO MOLECOLARE-
HMWK); - ATTIVAZIONE ESTRINSECA (MEDIANTE L’ATTIVATORE
TISSUTALE DEL PLASMINOGENO (t-PA) RILASCIATO DALLA PARETE
VASALE DOPO DIVERSI STIMOLI: STRESS-ATTIVITA’ FISICA-STASI);
ATTIVAZIONE FARMACOLOGICA CON UROCHINASI,
STREPTOCHINASI O rTPA.
-
IL SISTEMA FIBRINOLITICO
ANTIATTIVATORI
LE ATTIVAZIONI SIA DELLA VIA INTRINSECA CHE DELLA VIA
ESTRINSECA DELLA FIBRINOLISI, SONO A LORO VOLTA
REGOLATE DALLA PRESENZA DI ANTIATTIVATORI PLASMATICI
(INIBITORE DELL’ATTIVATORE DEL PLASMINOGENO – PAI )
DALLA PRESENZA DI INIBITORI DELLA PLASMINA CIRCOLANTE
(ALFA-2-ANTIPLASMINA, ALFA-2-MACROGLOBULINA, ANTITROMBINA,
ALFA1-ANTITRIPSINA, INIBITORE DALLA C1-ESTERASI,
ANTICHIMOTRIPSINA).
E
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
LE MODALITÀ OPERATIVE DEL LABORATORIO
LE INDAGINI DI LABORATORIO HANNO COME FINE ULTIMO LA
CONFERMA DI UN SOSPETTO DIAGNOSTICO, LA VERIFICA DI UNA
DIAGNOSI, L’INDICAZIONE AD UNA TERAPIA o IL CONTROLLO
DELL’EFFICACIA DI UNA TERAPIA IN ATTO.
PER ASSOVERE A QUESTE ESIGENZE, OGNI PARAMETRO
INTERESSATO (DAL CAMPIONE ALLA TRASFORMAZIONE DEI DATI
IN UN RISULTATO FINALE) DEVE RISPONDERE A DETERMINATI
CRITERI (SICUREZZA DI QUALITA’)
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
ERRORI IN LABORATORIO - METODI DI CONTROLLO
SI POSSONO RILEVARE TRE GRUPPI DI ERRORI: 1) ERRORI GROSSOLANI
DOVUTI PREVALENTEMENTE A SCAMBIO DI REAGENTI, PIPETTE,
STRUMENTI E CAMPIONI (VENGONO EVIDENZIATI PER LA GROSSA DISCREPANZA TRA
VALORI OTTENUTI E ATTESI);
2) ERRORI CASUALI LEGATI ALLA CASUALITA’ CHE
COMUNQUE AFFERISCONO A TUTTE LE OPERAZIONI E MISURE;
3)
ERRORI SISTEMATICI LEGATI A MODIFICAZIONI PIU’ O MENO GRANDI DI
UN LOTTO DI REAGENTI, DI UNO STRUMENTO O DI UNA METODICA
(SI
RIPETONO IN MODO COSTANTE E SONO RICONOSCIUTI DAL CONTROLLO DEI DATI OTTENUTI
PER UN CAMPIONE NOTO CON QUELLI CHE SONO STATI OTTENUTI IN ALTRE CONDIZIONI DI
REAGENTI, DI STRUMENTI O DI OPERATORI).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
CONTROLLO DI QUALITA’ (CQ)
LA VALUTAZIONE DELL’IMPRECISIONE E’ LA MISURA DELLA
CONCORDANZA DEI VALORI MISURATI IN ANALISI RIPETUTE
SULLO STESSO CAMPIONE NELLA STESSA SERIE (Coefficiente di
Variazione INTRASERIE) o TRA SERIE IN GIORNI DIVERSI
(Coefficiente di Variazione TRA SERIE).
L’INSERIMENTO DI PLASMI DI CONTROLLO A TITOLO NOTO PUO’
ESSERE UNA VALIDA GUIDA PER L’AFFIDABILITA’ DEI METODI.
“UN METODO PRESENTA UNA BUONA AFFIDABILITA’ SE TUTTI I
VALORI OTTENUTI RIENTRANO IN 2 DS E COMUNQUE NON
SUPERANO UNO SCARTO DEL 5%”.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
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IL PAZIENTE :
• Digiuno
• Dieta
• Stress
• Esercizio fisico
• Ora del prelievo
• Trattamenti farmacologici
• Postura
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G.L.P.
IL PAZIENTE : IL DIGIUNO- LA DIETA
Un aspetto di grande importanza NELLA RACCOLTA DEL CAMPIONE
DESTINATO ALLE PROVE DI COAGULAZIONE E’ COSTITUITO DAL
DIGIUNO (DI ALMENO 12 ORE). Questo stato è imperativo in quanto tutti
i fattori della coagulazione e le piastrine risentono della presenza in circolo
dei chilomicroni. UN ALTRO DATO DA RACCOGLIERE PRIMA
DELL’ESECUZIONE DEL PRELIEVO E’ LA DIETA SEGUITA DAL PAZIENTE.
Un esempio di particolare rilievo, è la puntualizzazione del regime dietetico
praticato negli ultimi 2-3 giorni nei pazienti sottoposti a terapia con
anticoagulanti orali (in particolare l’ingestione di verdure sia esse crude o
lessate, soprattutto se a foglie larghe, che per le vitamine in esse contenute
possono provocare un falso risultato).
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DEL CAMPIONE BIOLOGICO
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IL PAZIENTE : LO STRESS-L’ESERCIZIO FISICO-IL FUMO
IL PAZIENTE CHE DEVE SOTTOPORSI AD UN PRELIEVO PER
COAGULAZIONE NON DEVE ESSERE SOTTO STRESS, NON DEVE AVERE
PRATICATO ESERCIZIO FISICO O AVERE FUMATO DA ALMENO 2 ORE,
PERCHE’ TUTTE QUESTE CONDIZIONI NON SOLO POSSONO CREARE
DIFFICOLTA’ AL REPERIMENTO DELLA VENA, MA ANCHE PROVOCARE
UN AUMENTO DELL’EMATOCRITO E UNA ATTIVAZIONE DEI FATTORI
COAGULATIVI E DELLE PIASTRINE CHE CONDIZIONERANNO LE PROVE
DI LABORATORIO.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
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IL PAZIENTE : L’ORA DEL PRELIEVO-LA POSTURA
AL FINE DI POTER STANDARDIZZARE LA METODOLOGIA DI RACCOLTA
DEL CAMPIONE EMATICO DESTINATO ALLA COAGULAZIONE SI RENDE
NECESSARIO CHE L’ORA DEL PRELIEVO VENGA POSTA FRA LE 7.30 E LE
8.30, Sia per tenere conto dei ritmi circadiani che per poter effettuare tutte le
determinazioni entro 4 ore. LA POSTURA DEL PAZIENTE CHE SI DEVE
SOTTOPORRE AL PRELIEVO VENOSO PUO’ ESSERE DISTESO SU UNA
LETTIGA o SEDUTO. La sedia dovrà essere comoda ed accogliente, in un
ambiente a temperatura confortevole, mettendo il paziente a suo agio,
rispettando la sua privasy, senza rumori sgradevoli o con musica ad alto
volume. Tutto ciò renderà il prelievo ben accetto dal paziente, che guarderà
l’operatore come una persona amica che non gli arrecherà nocumento.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
IL PRELIEVO VENOSO:
• Il prelievo finalizzato
• Strumentario per il prelievo
• Utilizzazione degli additivi
• Stasi venosa
• Puntura venosa
• Stoccaggio del campione
o
o
o
o
contenitori
temperatura
tempo
trasporto
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
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LA STASI VENOSA
LA STASI VENOSA, INDOTTA DAL POSIZIONAMENTO
DEL LACCIO EMOSTATICO, DEVE ESSERE RIDOTTA AL
MINIMO, IN MODO DA EVITARE UNA CONCENTRAZIONE
DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED UN AUMENTO
DELL’EMATOCRITO.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
LO STRUMENTARIO ED IL PRELIEVO
LO STRUMENTARIO PER LA RACCOLTA DEL CAMPIONE DESTINATO
ALLE ANALISI DI LABORATORIO PER L’ESECUZIONE DI TESTS
DELL’EMOSTASI DEVE ESSERE COSTITUITO DA “MATERIALE
ANTICONTATTO” (VETRERIA SILICONIZZATA O MATERIALE DI
PLASTICA): DALLE SIRINGHE ALLE CUVETTE AI PUNTALI, IN
QUANTO L’EFFETTO “CONTATTO” DA’ INIZIO ALLA
COAGULAZIONE PER VIA INTRINSECA, PROVOCANDO UNA
DEPLEZIONE DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE ED ALTERANDO
QUINDI IL RISULTATO FINALE.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
IL PRELIEVO: METODO DELLA DOPPIA SIRINGA
PER IL PRELIEVO, IL METODO MIGLIORE PER EVITARE OGNI POSSIBILE
INTERFERENZA E’ QUELLO DELLA DOPPIA SIRINGA, CON AGHI GROSSI (TIPO 21G)
MONTATI SU SIRINGHE DI PLASTICA DA 10CC. DOPO AVERE ASPIRATO UNA
PICCOLA QUANTITA’ DI SANGUE NELLA SIRINGA VUOTA (QUESTA PROCEDURA
PERMETTE IL LAVAGGIO DELL’AGO ALLONTANANDO I FRUSTOLI DI TESSUTO PENETRATI
NELL’AGO AL MOMENTO DELLA SUA INTRODUZIONE NELLA CUTE E NELLA VENA) SI
DISINSERISCE LA SIRINGA VUOTA E SI INNESTA NELL’AGO TENUTO IN POSIZIONE
LA SIRINGA CONTENTE 1 ML DI SODIO CITRATO AL 3,8% (o 0,11 M/L) ED,
ASPIRANDO LENTAMENTE, SI PORTA LO STANTUFFO SINO ALLA TACCA 10 ML.
ESTRATTA LA SIRINGA DALLA VENA SI PROCEDE AD UNA LENTA OSCILLAZIONE
DELLA SIRINGA PER UNA PERFETTA MISCELA FRA ANTICOAGULANTE E SANGUE
(RAPPORTO 1/10).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
STOCCAGGIO DEL CAMPIONE
PER LE DETERMINAZIONI DI LABORATORIO SULL’EMOSTASI, SI
RENDE IMPERATIVO CHE LE ANALISI VENGANO EFFETTUATE
ENTRO LE 4 ORE DAL PRELIEVO. SE E’ NECESSARIO IL
TRASPORTO, LA PROVETTA, BEN TAPPATA, DEVE ESSERE POSTA
A TEMPERATURA PROSSIMA AI 7-10 C° (E’ SUFFICIENTE UNA BORSA
TERMICA)
IN MODO DA RALLENTARE LE ATTIVITA’ ENZIMATICHE
CHE SI ATTIVANO A TEMPERATURA AMBIENTE.
PER ALCUNE ANALISI SI PUO’ PROCEDERE ALLO STOCCAGGIO
DEL CAMPIONE A MENO 70 C°, dopo avere separato il plasma dalla
parte corpuscolata.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
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ANTICOAGULANTI ED ADDITIVI
L’IMPIEGO DEGLI ANTICOAGULANTI E’ STATO A LUNGO DISCUSSO IN
LETTERATURA SPECIALISTICA E SI E’ GIUNTI ALLA CONCLUSIONE CHE IL
CITRATO SODICO (0,11M/L – OPPURE 3,8%) RAPPRESENTA L’ANTICOAGULANTE CHE GARANTISCE I RISULTATI PIU’ RIPRODUCIBILI.
FRA GLI ADDITIVI, SONO CONSIGLIABILI AL FINE DI INIBIRE LA
REATTIVITA’ PIASTRINICA DELLE SOLUZIONI CONTENENTI TEOFILLINA
E/O PROSTAGLANDINA E2 (ESISTONO IN COMMERCIO PROVETTE CONTENTI
SOLUZIONI GIA’ PREDISPOSTE COME LE “CTAD – TUBES”).
PER I TEST FIBRINOLITICI, ALL’ANTICOAGULANTE E’ NECESSARIO
AGGIUNGERE UN INIBITORE DEGLI ENZIMI PROTEOLITICI (COME L’AC.
EPSILON-AMINO-CAPROICO O L’APROTININA).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
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ANTICOAGULANTI:
• Sodio Citrato
• EDTA-Na2
• EDTA-K2
• Eparina-Na
• Eparina-Li
• CTAD-Tube
• Fx Sodium fluoride / Potassio Oxalate
• Miscele varie per inibire le piastrine
• Stabilizzanti il sistema fibrinolitico
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
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IL PRELIEVO PER TESTS DELLA COAGULAZIONE:
– Punti cruciali
•
•
•
•
•
•
•
Stasi
Puntura venosa
La “schiuma”
I contenitori
Il rapporto sangue/anticoagulante
Temperatura del lettore
Critico
o < 4 ore dal prelievo
o assenza di emolisi
o siero torbido o opalescente
o altri composti interferenti
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
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PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
NELLA PREPARAZIONE DEL PLASMA PER I TESTS DELLA COAGULAZIONE
UN PUNTO CRUCIALE E’ RAPPRESENTATO DALLA CENTRIFUGAZIONE
DEL CAMPIONE, CHE DEVE ESSERE ESEGUITA A 3.000 GIRI, PER 10 MIN,
IN MODO DA EVITARE LA COMPARSA DI EMOLISI ED ALLONTANARE
TUTTA LA PARTE CORPUSCOLATA, SOPRATTUTTO LE PIASTRINE, CHE
POSSONO ACCELERARE LE REAZIONI COAGULATIVE.
ALLA FINE DELLA CENTRIFUGAZIONE, SE IL PLASMA E’ OPALESCENTE
PER LA PRESENZA DI ELEVATI LIVELLI DI CHILOMICRONI E’ NECESSARIO
RIPETERE LA CENTRIFUGAZIONE PER ALLONTANARE AL MASSIMO LE
PARTICELLE LIPIDICHE.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
PRINCIPALI TEST EMOCOAGULATIVI
TRA GLI ESAMI DI LABORATORIO DI PIU’ FREQUENTE RICHIESTA IN
CAMPO EMOCOAGULATIVO SONO: - IL TEMPO DI PROTROMBINA (PT),
-
IL TEMPO DI TROMBOPLASTINA ATTIVATO (aPTT) ed IL DOSAGGIO DEL FIBRINOGENO (FB).
I METODI DI LABORATORIO DI PIU’ LARGA DIFFUSIONE SONO FONDATI
SULLA VELOCITA’ DI FORMAZIONE DEL COAGULO (END POINT
COAGULATIVO), DA CUI SI RISALE ALLA CONCENTRAZIONE PLASMATICA.
SONO IN COMMERCIO ALTRI METODI BASATI SULLO SVILUPPO DI
COLORAZIONE (TESTS CROMOGENICI), IL CUI IMPIEGO TROVA OGGI
LARGO IMPIEGO NEI METODI AUTOMATIZZATI.
POSSIBILI DIFETTI DELL’EMOSTASI ESPLORATA
MEDIANTE I TEST DI COMUNE IMPIEGO
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DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
METODI PER IL DOSAGGIO DEL FIBRINOGENO (FATTORE I)
a) Metodi basati sulla precipitazione specifica
b) Metodi immunologici
dosaggio di tutta la proteina
c) Metodi chimici e cinetici
funzione della molecola
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
aPTT (v-n. 30-40 sec.)
LA DETERMINAZIONE DELL’APTT NON PRESENTA PARTICOLARI
DIFFICOLTA’, ANCHE SE UNA CERTA DIFFERENZA DI RISULTATI
PUO’ ESSERE EVIDENZIATA IN RELAZIONE AL MATERIALE CHE
VIENE UTILIZZATO PER DARE INIZIO ALLA COAGULAZIONE.
ESISTONO, INFATTI, METODI CHE IMPIEGANO IL CAOLINO ED
ALTRI CHE IMPIEGANO L’AC. ELLAGICO; ENTRAMBI AGISCONO
SULLA VIA INTRINSECA INNESCANDO LA REAZIONE
COAGULATIVA DAL FATTORE XII (DENOMINATO ANCHE FATTORE
“CONTATTO”).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
aPTT
IL SUO IMPIEGO NELLA DIAGNOSTICA E’ MOLTO DIFFUSO PERCHE’
E’ IN GRADO DI RISPONDERE ALLA DOMANDA SE
TUTTI I
FATTORI DELLA COAGULAZIONE SONO PRESENTI E
FUNZIONALMENTE ATTIVI: IN PRESENZA DI DIFETTI CONGENITI
O ACQUISITI DI FATTORI COAGULATIVI SI AVRA’, INFATTI,
UN ALLUNGAMENTO DEL SUO VALORE.
VIENE USATO, ANCHE, NEL MONITORAGGIO DELLA TERAPIA
EPARINICA (UN VALORE 2-3 VOLTE LA NORMA INDICA TERAPIA EPARINICA
CORRETTA)
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
PT (SORVEGLIANZA TAO)
QUESTO TEST (Valori normali: 12-14 sec. oppure 80-100%)
HA OGGI UNA GRANDE RICHIESTA PER IL MONITORAGGIO
DELLA TERAPIA ANTICOAGULANTE (T.A.O.)
NEL TRATTAMENTO E NELLA PREVENZIONE
DELLE TROMBOEMBOLIE
E NEI PAZIENTI PORTATORI
DI PROTESI VALVOLARI CARDIACHE.
INDICAZIONI ALLA TERAPIA ANTICOAGULANTE
TERAPIA ANTICOAGULANTE
CARATTERISTICHE ED INDICAZIONI DEGLI
ANTICOAGULANTI
a) ANTICOAGULANTI DIRETTI (EPARINA ED EPARINOIDI)
BLOCCANO RAPIDAMENTE LE REAZIONI COAGULATIVE CHE
PORTANO ALLA FORMAZIONE DEL TROMBO.
b) ANTICOAGULANTI INDIRETTI (FARMACI ANTI VITAMINA K)
RIDUCONO CON EFFETTO FARMACOLOGICO RITARDATO
(> 24 ORE) LA SINTESI EPATICA E LA CONCENTRAZIONE
PLASMATICA DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE F.II – F.VII –
F. IX – F. X , CON MARCATO RALLENTAMENTO DELLA
FORMAZIONE DEL TROMBO.
c) ANTIPIASTRINICI (ASA-TICLOPIDINA-CLOPIDOGREL)
INIBISCONO O RIDUCONO CON EFFETTO DOSE DIPENDENTE
TUTTE LE REAZIONI PIASTRINICHE PROLUNGANDO LA FASE
INIZIALE DELL’EMOSTASI (VASCULO – PIASTRINICA).
TERAPIA ANTICOAGULANTE
a) DIRETTI : EPARINE – EPARINOIDI
(EPARINA SODICA– EPARINA CALCICA –
LMW EPARINA)
b) INDIRETTI : FARMACI ANTIVITAMINA K
(WARFARINA- ACENOCUMAROLO)
c) ANTIPIASTRINICI : FARMACI ANTIAGGREGANTI
(ASA – TICLOPIDINA – CLOPIDOGREL – ETC.)
d) FIBRINOLITICI : FARMACI FIBRINOLITICI
(UROKINASI – STREPTOCHINASI – rTPA)
TERAPIA ANTICOAGULANTE
ANTICOAGULANTI INDIRETTI
FARMACI ANTIVITAMINA K
WARFARINA
=
COUMADIN
ACENOCUMAROLO
=
SINTROM
TERAPIA ANTICOAGULANTE
FARMACI ANTIVITAMINA K (WARFARINA- ACENOCUMAROLO)
Sono gli anticoagulanti piu’ utilizzati, in quanto
vengono assorbiti per via orale in misura
pressochè completa e abbastanza costante.
La distribuzione è caratterizzata da una elevata percentuale
di legame alla sieroproteine (circa il 97%).
Il decadimento plasmatico (T1/2 circa 35 ore per la
warfarina e un po’ minore per l’acenocumarolo: 24 ore)
dipende dalla velocità di biotrasformazione epatica (sono
possibili infatti fenomeni di induzione enzimatica).
L’eliminazione di entrambi avviene prevalentemente per via
urinaria, sotto forma di metaboliti inattivi.
FATTORI VITAMINA K-DIPENDENTE
F.II F.VII F.IX F.X
FATTORI VITAMINA K-DIPENDENTE
F.II F.VII F.IX F.X
PIVKA
Il blocco della carbossilazione rende i fattori VITAMINA Kdipendenti (F.II, VII, IX e X) incapaci di legarsi ai calcio
ioni e quindi ai fosfolipidi di membrana, tappe essenziali
per la loro attivita’ procoagulante (PIVKA: Proteins
Induced By Vitamin K Absence Or Antagonist).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
VITAMINA K
LA VITAMINA K (DA KOAGULATION = COAGULAZIONE) E’ UNA VITAMINA
LIPOSOLUBILE, CHE NON SINTETIZZATABILE DALL’ORGANISMO UMANO.
ESISTE IN NATURA SOTTO DUE FORME DERIVATE DAL MENADIONE: LA VITAMINA
K1 (presente nelle foglie verdi ed in altri vegetali); LA VITAMINA K2 ( sintetizzata dalla
flora batterica intestinale).
NELL’UOMO E’ DIFFICILE CHE SI MANIFESTI AVITAMINOSI K PER CAUSE
ALIMENTARI; SI POSSONO VERIFICARE INVECE SINDROMI CARENZIALI QUANDO
LA FLORA BATTERICA SIA STATA MODIFICATA PER TRATTAMENTI ANTIBIOTICI E
NELLE FORME IN CUI SI ABBIA UN ALTERATO ASSORBIMENTO INTESTINALE DEI
LIPIDI COME NELL’ITTERO OSTRUTTIVO, oppure NEL NEONATO QUANDO LE
RISERVE DI VITAMINA K DI PROVENIENZA MATERNA SONO INSUFFICIENTI E LA
FLORA BATTERICA INTESTINALE E’ ANCORA SCARSA.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
VITAMINA K
BISOGNA RACCOMANDARE AL PAZIENTE DI NON MODIFICARE
DRASTICAMENTE LE PROPRIE ABITUDINI ALIMENTARI, MA
CERCARE DI ASSUMERE UN QUANTITATIVO COSTANTE DI
VITAMINA K CON LA DIETA, SENZA SUPERARE UN APPORTO
GIORNALIERO DI 200-300 MICROGRAMMI.
POTREBBE ESSERE UTILE FORNIRE AI PAZIENTI UN ELENCO DI
PRODOTTI ALIMENTARI, CON L’INDICAZIONE DELLA QUANTITA’ DI
VITAMINA K IN ESSI CONTENUTA, ED ESPRESSA IN
MICROGRAMMI.
VITAMINA K
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
STANDARDIZZAZIONE TROMBOPLASTINE
I METODI AD END POINT COAGULATIVO RICHIEDONO L’AGGIUNTA AL PLASMA
IN
ESAME DI TROMBOPLASTINA ESOGENA E IONI CALCIO, PER CUI
LA VELOCITA’ DELLA REAZIONE PER LA FORMAZIONE DEL COAGULO RISULTA
CORRELATA SOPRATTUTTO ALLA QUALITA’ E ALLA FUNZIONALITA’
DELLA TROMBOPLASTINA IMPIEGATA.
PER UNA STANDARDIZZAZIONE SICURA DEI RISULTATI, E’ STATA OTTENUTA UNA
TROMBOPLASTINA DI RIFERIMENTO, CHE POSSIEDE UNA DETERMINATA
SENSIBILITA’ (INTERNATIONAL REFERENCE PREPARATION – I.R.P.). A CUI
TUTTE LE TROMBOPLASTINE COMMERCIALI DEVONO RAPPORTARSI.
QUESTO STANDARD CONSENTE DI SEPARARE COMPLETAMENTE I PAZIENTI SOTTO
TERAPIA CON ANTICOAGULANTE ORALE DAI SOGGETTI NORMALI.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
INTERNAZIONAL SENSITIVITY INDEX (I.S.I.)
SE IN UNA CARTA DOPPIO LOGARITMICA SI METTONO A CONFRONTO
LA
TROMBOPLASTINA STANDARD INTERNATIONAL REFERENCE PREPARATION (I.R.P.
) E LA TROMBOPLASTINA COMMERCIALE IN USO, SI OTTIENE UNA RETTA
DI CORRELAZIONE CHE PRESENTA UNA PENDENZA (CHIAMATA SLOPE),
CI PERMETTE DI CALCOLARE L’I.S.I. (INTERNATIONAL SENSITIVITY INDEX).
I.S.I.= SLOPE X (I.S.I – I.R.P)
TUTTE LE TROMBOPLASTINE COMMERCIALI RIPORTANO IL LORO I.S.I.,
CHE PROVIENE PROPRIO DAL CONFRONTO DELLA SENSIBILITà DELLA
TROMBOPLASTINA IMPIEGATA E LA TROMBOPLASTINA DI RIFERIMENTO.
CHE
VALUTAZIONE
DELLA
SENSIBILITÀ
DELLA
TROMBOPLASTINA
IN CONFRONTO
CON I.R.P.
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
INTERNAZIONAL NORMALIZED RATIO (I.N.R.)
IL CALCOLO DELL’I.N.R. VIENE EFFETTUATO
MEDIANTE IL RAPPORTO DEL TEMPO DI REAZIONE DEL
CAMPIONE (ESPRESSO IN SECONDI) ED IL TEMPO DI REAZIONE DEL
PLASMA NORMALE (ESPRESSO IN SECONDI) ED IL RISULTATO
CORRETTO PER L’I.S.I. DELLA TROMBOPLASTINA IMPIEGATA.
NEI SOGGETTI IN TRATTAMENTO ANTICOAGULANTE
IL VALORE DI I.N.R. DEVE ESSERE COMPRESO TRA 2.0 E 4.5 (IN
RELAZIONE ALLE PATOLOGIE).
LA RACCOLTA CONSAPEVOLE
DEL CAMPIONE BIOLOGICO
G.L.P.
I.N.R. = INTERNATIONAL NORMALIZED RATIO
PR =
Tempo di reazione del campione (secondi)
Tempo di reazione nel plasma normale (secondi)
I.N.R. = PR ISI
I.S.I. = INTERNATIONAL SENSITIVITY INDEX
TRATTAMENTO CON ANTICOAGULANTI ORALI
COMPLICANZE EMORRAGICHE
DELLA TERAPIA ANTICOAGULANTE
GOOD LABORATORY PRACTICE
(“buona pratica di laboratorio”)
CONCLUSIONI (I)
LA BUONA PRATICA DI LABORATORIO RICHIEDE COMPETENZA E
PROFESSIONALITA’ IN OGNI ATTO SANITARIO CHE PUO’ ESSERE
CAUSA DI ERRORE NEL RISULTATO FINALE
(LE CARATTERISTICHE DEL PAZIENTE, LA CORRETTA ESECUZIONE
DEL PRELIEVO VENOSO, LA SCELTA DEGLI ANTICOAGULANTI E
DEGLI ADDITIVI, LE CARATTERISTICHE DEL METODO UTILIZZATO, LA
SCELTA DEI REATTIVI , LA STANDARDIZZAZIONE DEL METODO E DEI
REATTIVI IMPIEGATI).
GOOD LABORATORY PRACTICE
(“buona pratica di laboratorio”)
CONCLUSIONI (II)
LA BUONA PRATICA DI LABORATORIO
E’ FONDAMENTALE AL FINE DI UN RISULTATO CORRETTO
ED AFFIDABILE PER IL MEDICO, CHE
DA QUELLE
RISULTANZE DOBBIAMO SOTTOLINEARE
TRAE DELLE
CONCLUSIONI DIAGNOSTICHE
E
TERAPEUTICHE.