Validazione di un
metodo di analisi
Argomenti trattati
 Introduzione alla validazione dei
metodi analitici
 Parametri che caratterizzano un
metodo analitico
 esempio pratico
Validazione
 Validazione di un metodo analitico:
 “Conferma attraverso l’esame e l’apporto di
evidenza oggettiva che i requisiti particolari per
l’utilizzazione prevista siano soddisfatti”
Quando validare un metodo?
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
Quando un metodo è
non normato
sviluppato e/o progettato dal laboratorio
normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione
prefissato
 le più comuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono le
seguenti:
 un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari;
 un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o
esteso ad un nuovo problema analitico;
 il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di
qualità;
 un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un
diverso analista, con diversa strumentazione;
 è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo in esame con un
metodo standard.
Validazione
 Il laboratorio che utilizza un metodo deve
avere la documentazione che dimostri
l’appropriata validazione del metodo stesso.
 È responsabilità dell’utilizzatore assicurare
che la validazione documentata sia
sufficientemente completa
Validazione
 Non ci sono linee guida ufficiali per la
sequenza degli esperimenti necessari per la
validazione
 La sequenza ottimale può dipendere dal
metodo stesso
Parametri che caratterizzano un
metodo analitico
 Campo di misura
 Specificità-selettività analitica
 limite di rivelabilità e di quantificazione
 range dinamico e lineare
 accuratezza intesa come esattezza più
precisione (quest’ultima a sua volta distinta
in ripetibilità, precisione intermedia e
riproducibilità)
 incertezza di misurazione
 robustezza.
Campo di misura (validità)
 Intervallo tra il più alto e il più basso livello
dell’analita determinabili con precisione ed
accuratezza applicando il metodo stesso
 Il campo di misura (validità) è espresso nella
stessa unità di misura dell’analita
 Dipende dallo scopo del metodo
Specificità-Selettività analitica
 Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce
una singola risposta
 Selettività: si riferisce ad un metodo che produce
più risposte (metodo separativo)
 ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE
L’ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI
Limite di rilevabilità
 È la più bassa concentrazione dell’analita
che può essere rilevata, ma non
necessariamente determinata
quantitativamente, nelle condizioni
sperimentali del metodo
 LdR=3*Sb/S
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Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
Limite di quantizzazione
 La Più bassa concentrazione analitica che
può essere determinata quantitativamente
con accettabile precisione ed esattezza nelle
condizioni sperimentali del metodo
 LdQ = 10*Sb/S
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Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni)
S =coefficiente angolare della curva di taratura
per metodi cromatografici
Sb = D/5
dove
D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo
Linearità
 La linearità di un metodo analitico è la sua
abilità di dare risultati che sono
direttamente proporzionali alla
concentrazione degli analiti nei campioni
all’interno di un determinato campo di
validità
 la proporzionalità può essere raggiunta
anche attraverso trasformazioni
matematiche ben definite
Linearità
 Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di
correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con
aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su
matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il
solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione
delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente
accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei
minimi quadrati) pari almeno a 0,99.
 Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante
l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata
restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera.
Linearità
 Si deve effettuare almeno da 3 a 6 repliche
di 4 o più concentrazioni
 Nella validazione del metodo devono essere
riportati il coefficiente di correlazione, la
pendenza, l’intercetta e i residui, oltre ad un
grafico dei dati sperimentali e della curva
calcolata
Esattezza
 Grado di concordanza tra il valore medio
ottenuto a partire da un grande insieme dì
risultati di prova, e un valore dì riferimento
accettato
Per la valutazione dell’esattezza:
 Confronto con un metodo analitico di ordine
metrologico superiore
 Analisi di idonei materiali di riferimento
certificati a diversi livelli di concentrazione
 Confronto con i valori attesi in studi
collaborativi (circuiti interlaboratorio)
 Analisi di idonei campioni costruiti
aggiungendo alla matrice quantità certificate
di analita (Spike) a diversi livelli di
concentrazione
Ripetibilità
 concordanza tra risultati di prova
indipendenti ottenutì con lo stesso
metodo su materiali ídentici, nello
stesso laboratorio, dallo stesso
operatore, usando la stessa
apparecchiatura e in intervalli di tempo
brevi (stessa serie analitica)
Per valutare la ripetibilità si
possono usare:
 Campioni reali
 Materiali di riferimento certificati nella
stessa matrice
 Materiali di riferimento in matrice ottenuti
per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni
della sostanza pura
Precisione intermedia
 Concordanza tra risultati di prova
indipendenti ottenuti con lo stesso metodo
su material identici, nello stesso
laboratorio, dallo stesso operatore, usando
la stessa apparecchiatura e in intervalli di
tempo lunghi (diverse serie analitiche con
possibilità di cambiamento del lotto dei
reattivi e dei materiali di consumo).
Per valutare la Precisione
intermedia si possono usare:
 Campioni reali
 Materiali di riferimento certificati nella
stessa matrice
 Materiali di riferimento in matrice ottenuti
per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni
della sostanza pura
Riproducibilità
 concordanza tra risultati di prova
indipendenti ottenuti con lo stesso metodo
su materiali identici, in laboratori diversi, da
operatori diversi, usando apparecchiature
diverse e in intervalli di tempo diversi
Incertezza di misura
 stima legata ad un risultato di prova che
caratterizza l'escursione dei valori entro
cui si suppone che cada il valore vero
del misurando - Ha le dimensioni di uno
scarto tipo e si indica con ”U"
Per valutare l’incertezza può essere
riassunto nei seguenti punti:
 specificazione del misurando (eseguita nel
metodo di prova)
 definizione della relazione che lo lega alle
grandezze misurate nel metodo di prova (ad
esempio modello matematico per la misura
della concentrazione specificato nel metodo di
prova)
 identificazione dei fattori che possono
contribuire all'Incertezza di misura per ogni
stadio del processo eseguito in laboratorio
(indicati nel metodo di prova)
 raccolta dei dati relativi alle prestazioni del
metodo (studi collaborativi, studi di
validazione in laboratorio, circuiti
inetrlaboratorio)
 quantificazione dei vari contributi
all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni
del metodo, esprimendole come varianze o
scarti tipo (incertezze tipo):
u(xi)
 combinazione delle incertezze tipo per
ottenere l'incertezza composta:
uc(y)
 trasformazione dell'incertezza composta in
incertezza estesa
U(y) = K uc (y)
moltiplicando per il fattore di copertura (K)
In generale K=2.
Robustezza
 Insensibilità a piccole variazioni dei parametri
sperimentali
 Variazioni deliberate
% solventi organici
pH
temperatura
Flusso
Esempio di validazione
 Come esempio si riporta la validazione della
determinazione dei cloruri solubili negli
aggregati per confezione di calcestruzzi in
cui abbiamo avuto la necessità di adattare
un metodo normato (secondo la norma UNI
8520) ad un metodo più veloce e preciso.
 Il metodo normato, dopo l’attacco della
sostanza prevede la determinazione dei
cloruri in acqua, dopo precipitazione con
AgNO3, con un metodo gravimetrico,
pesando dopo essiccazione il precipitato, o
volumetrico, riprendendo il precipitato e poi
retrotitolando con NH4CNS l’argento in
eccesso. Questo procedimento è stato
semplificato utilizzando la tecnica della
cromatografia ionica.
Principio del metodo
 Il campione è sottoposto a una
solubilizzazione degli ioni attraverso
acqua calda, su questa soluzione
vengono determinati, tramite
cromatografia ionica, i cloruri.
Campo di misura
 Il campo di misura varia tra 0,002 % e 0,050 %
in peso di cloruri
 che rappresenta il range 10 % - 160 % del limite
della presenza di cloruri in inerti per la
confezione di calcestruzzi.
Taratura Cromatografo Ionico
 Standard iniziale soluzione a 1000 ± 5 mg/l di
cloruri
 Con micropipetta prelevati 100 µl, 250 µl, 400
µl, 500 µl e portati tutti a 100 ml con acqua
deionizzata
 Ottenute le seguenti concentrazioni:
 1,00/ 2,50/ 4,00/ 5,00 mg/l
 Sono state effettuate quattro repliche per ogni
concentrazione
Retta di taratura
retta di taratura cloruri
6000000
5000000
conteggi d'area
4000000
3000000
y = 1,07E+06x - 1,15E+04
R2 = 9,98E-01
2000000
1000000
0
0,00
1,00
2,00
3,00
concentrazione mg/l
4,00
5,00
6,00
Analisi dei residui
150000
100000
50000
0
0
-50000
-100000
-150000
1
2
3
4
5
6
Limiti di quantizzazione e di
rilevabilità
 LdR=0,01 mg/l
 LdQ = 0,05 mg/l
Incertezza
 Ora valutiamo l’incertezza della misura
analizzando i vari contributi all’incertezza
Incertezza della taratura









Incertezza della vetreria e della diluizione:
Matraccio da 100 ml: 0,00058
Micropipetta:
std 1,00 mg/l = 0,00141
std 2,50 mg/l = 0,000776
std 4,00 mg/l = 0,000663
std 5,00 mg/l = 0,000635
Da cui :
INCtot: 0,00185
Incertezza dovuta alla bilancia
 Dal certificato di taratura della bilancia,
l’incertezza determinata (per n = 10 misure
con i.c. 95%) è 0,040 mg
 INCbil = 0.0177 mg
 INC/P(10 g) = 0.00000177
Incertezza ripetibilità
 Le prove sono state effettuate su un
campione di inerte analizzandolo 5 volte
ottenendo il seguente risultato:
 0,0346 ± 0,00123
 da cui
 INC=0,0158
Incertezza dovuta alla taratura
lineare
 Un aliquota di campione analizzato secondo
la procedura precedentemente descritta
porta ad avere una incertezza, dovuta alla
taratura strumentale di:
 INC=0,0103
Incertezza vetreria analisi
 Matraccio da 1000 ml
 INC=0,00058
Incertezza composta ed estesa
 INCglob= 0,0189
 Quindi in termini percentuali l’incertezza
associata alla determinazione dei cloruri
negli inerti è pari a 1,89 % del valore
trovato
 nel caso precedente si può esprimere il
risultato:
 Cloruri = 0,0346 ± K*0.000654
Accuratezza
 Sono state effettuate 3 serie di 5 misure in
giorni diversi su un campione noto, si è
ottenuto una media di 0,0345 ± 0,00121 , il
campione è dato 0,0352 ± 0,00100 per cui il
dato sperimentale rientra nel range del dato
sperimentale.
Conclusioni
 L’esempio riportato mostra come
l’incertezza della misura può essere stimata
considerando tutti gli stadi della procedura
valutando i singoli contributi.