Lezioni di
biotecnologie
2
Lezione 1
Il clonaggio
3
© Zanichelli editore, 2014
Il clonaggio non è la clonazione
Si definisce clonaggio un sistema per ottenere molte
copie di un tratto di DNA inserendolo in un ospite
mediante l’uso di vettori molecolari.
La clonazione in biologia è invece la riproduzione
agamica, naturale o artificiale, di individui o cellule con
identico patrimonio genetico (cloni). Esempi di processi
clonogenici naturali sono la scissione binaria dei batteri
o la mitosi delle cellule eucariotiche.
4
© Zanichelli editore, 2014
Le tappe del clonaggio
Il clonaggio richiede:
• l’isolamento di una particolare sequenza di DNA
(non necessariamente codificante per una proteina)
dall’insieme di tutte le sequenze del DNA di un
organismo (genoma);
• l’inserimento della sequenza di DNA in una cellula
ospite, spesso diversa da quella da cui origina il DNA
da clonare, tramite l’utilizzo di molecole di DNA
trasportatrici (vettori molecolari);
• la moltiplicazione delle cellule riceventi;
• la selezione delle cellule che effettivamente
contengono la sequenza del DNA di interesse.
5
© Zanichelli editore, 2014
L’isolamento del DNA di partenza
Il DNA da clonare può essere un segmento del genoma
oppure una copia a DNA di un RNA messaggero
(mRNA).
Nel primo caso è possibile isolare anche sequenze non
codificanti, come i promotori o gli introni presenti all’interno
dei geni eucariotici.
Nel secondo invece si può prelevare solo la sequenza
espressa di un gene, allo scopo di fare esprimere la
proteina corrispondente in un organismo diverso da quello
originario: è questo l’approccio più usato in
biotecnologia.
6
© Zanichelli editore, 2014
Le biblioteche di cDNA
La copia a DNA di un mRNA viene detta DNA
complementare o cDNA. L’insieme dei cDNA clonati
viene detto biblioteca di cDNA.
7
© Zanichelli editore, 2014
Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (I)
Per isolare gli mRNA di una cellula a partire dalla
miscela di tutto l’RNA, si sfrutta la loro caratteristica
di avere una sequenza all’estremità 3’, costituita da
circa 200 residui di adenosina (coda poli-A).
8
© Zanichelli editore, 2014
Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (II)
La miscela degli RNA cellulari viene messa in contatto
con una resina a cui sono attaccati dei corti
oligonucleotidi costituiti da timidine (poli-T).
9
© Zanichelli editore, 2014
Le biblioteche di cDNA: isolamento
degli mRNA cellulari (III)
Gli mRNA vengono successivamente staccati dalla resina e
raccolti in forma pura.
10
© Zanichelli editore, 2014
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (I)
Per preparare i cDNA a partire da mRNA, si utilizza un
enzima virale: la trascrittasi inversa (RT). Questa
polimerasi, la cui scoperta fruttò il premio Nobel per la
Medicina nel 1975 a David Baltimore e Howard
Temin, è l’unico enzima esistente in grado di generare
una copia di DNA a partire da una stampo di RNA e
viene usato dai retrovirus come HIV per la replicazione
del loro genoma.
© Zanichelli editore, 2014
11
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (II)
La trascrittasi inversa copia il singolo filamento dell’mRNA,
generando un doppio filamento ibrido DNA/RNA.
© Zanichelli editore, 2014
12
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (III)
La trascrittasi inversa è in grado di degradare il filamento
a RNA, esponendo la singola elica di DNA.
© Zanichelli editore, 2014
13
Le biblioteche di cDNA:
conversione degli mRNA in cDNA (IV)
La trascrittasi inversa sintetizza il filamento
complementare di DNA, generando un cDNA a doppia
elica.
© Zanichelli editore, 2014
14
Le biblioteche di cDNA:
i vettori di clonaggio (I)
Per inserire i cDNA all’interno di una cellula ospite si
utilizzano molecole di DNA circolare: i vettori plasmidici.
Si tratta di elementi genetici naturali dei batteri (plasmidi)
modificati dall’uomo.
© Zanichelli editore, 2014
15
Le biblioteche di cDNA:
i vettori di clonaggio (II)
I vettori plasmidici
contengono un’origine di
replicazione per potersi
duplicare insieme al DNA
cellulare, un gene
marcatore (resistenza a un
antibiotico) per poter
selezionare le cellule che li
contengono e siti di taglio
unici per enzimi di
restrizione.
© Zanichelli editore, 2014
16
Le biblioteche di cDNA:
gli enzimi di restrizione (I)
Per preparare il cDNA e il vettore per il clonaggio è
necessario utilizzare le endonucleasi di restrizione,
enzimi batterici in grado di legarsi a specifiche
sequenze del DNA (generalmente di 4 – 6 paia di basi)
e tagliare la doppia elica all’interno della sequenza
bersaglio.
© Zanichelli editore, 2014
17
Le biblioteche di cDNA:
gli enzimi di restrizione (II)
Il taglio genera estremità che possono essere piatte
oppure sporgenti, nel qual caso si definiscono
coesive (sticky ends).
© Zanichelli editore, 2014
18
Le biblioteche di cDNA: le ligasi
Per inserire il cDNA all’interno di un vettore è
necessario utilizzare le DNA ligasi, enzimi presenti in
tutte le cellule e in grado di ripristinare il legame
fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti in una
catena di DNA. In questo modo è possibile saldare
insieme due frammenti di DNA distinti.
© Zanichelli editore, 2014
19
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (I)
I cDNA e il vettore di
clonaggio vengono
digeriti con la stessa
endonucleasi di
restrizione. In questo
modo le estremità del
vettore e quelle dei
cDNA saranno
complementari.
© Zanichelli editore, 2014
20
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (II)
Tramite la DNA ligasi i cDNA vengono saldati all’interno
del vettore pasmidico.
© Zanichelli editore, 2014
21
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (III)
I DNA ricombinanti (cioè vettori contenenti i cDNA)
vengono inseriti in cellule batteriche.
© Zanichelli editore, 2014
22
Le biblioteche di cDNA:
il clonaggio e la selezione (IV)
Le cellule geneticamente
modificate (ovvero contenenti il
vettore) acquisiranno la
resistenza all’antibiotico
portata dal vettore stesso,
quindi le cellule sopravvissute
conterranno tutti i cDNA. Ogni
singola cellula originerà un
clone di un singolo cDNA.
L’insieme dei cloni sarà la
biblioteca a DNA.
© Zanichelli editore, 2014
23
Identificazione di un gene di
interesse: il Southern Blotting (I)
Per identificare il clone della
biblioteca che contiene il cDNA
del gene di nostro interesse si
può utilizzare il metodo del
Southern Blotting, chiamato
così dal suo inventore: Edwin M.
Southern.
Edwin Southern
Immagine:Jane Gitschier
(Plos Genetics)
© Zanichelli editore, 2014
24
Identificazione di un gene di
interesse: il Southern Blotting (II)
Il Southern Blotting si compone di tre fasi principali:
• Elettroforesi sul gel di agarosio del cDNA separato
dal vettore plasmidico estratto dai cloni, dopo
digestione con endonucleasi di restrizione;
• Trasferimento dei frammenti di DNA dal gel a una
membrana di nitrocellulosa;
• Ibridazione della membrana con un frammento di
DNA complementare al cDNA di interesse marcato
radioattivamente e rilevazione del segnale su lastra
fotografica.
© Zanichelli editore, 2014
25
Elettroforesi su gel di agarosio (I)
Il DNA plasmidico (vettore) estratto dai cloni viene digerito
con gli stessi enzimi di restrizione usati per il clonaggio.
In questo modo il cDNA viene separato dal vettore. Poi si
prepara una miscela di agarosio all’ 1% in un opportuno
tampone. L’agarosio è un polimero naturale che
solidifica in un gel a temperatura ambiente.
Una vasca piena di gel di agarosio
solidificato. Immagine: Joseph Elsbernd via
Wikimedia Commons
© Zanichelli editore, 2014
26
Elettroforesi su gel di agarosio (II)
Nel gel vengono lasciate delle fessure (pozzetti) in cui si
deposita la miscela contenente vettore e cDNA digeriti.
© Zanichelli editore, 2014
27
Elettroforesi su gel di agarosio (III)
Applicando un campo elettrico, il DNA (carico
negativamente) migra verso il polo positivo e le molecole
si separano in base al peso molecolare. ll vettore (più
pesante) correrà più lentamente del cDNA (più leggero).
© Zanichelli editore, 2014
28
Trasferimento (blotting) su membrana
Il gel contenente il DNA separato, è sottoposto a un
trattamento per denaturare il DNA, ovvero aprire i due
filamenti. Il gel è poi appoggiato a una membrana di
nitrocellulosa: il DNA migra dal gel alla membrana per
capillarità o applicando un campo elettrico. La
membrana, carica positivamente trattiene il DNA (a singola
elica perché denaturato) carico negativamente.
© Zanichelli editore, 2014
29
Ibridazione (I)
La membrana è immersa in una soluzione contenente un
frammento di DNA a singola elica complementare al cDNA
di interesse e recante un atomo di fosforo radioattivo (32P)
all’estremità 5’.Grazie alla proprietà del DNA a singola elica
di appaiarsi spontaneamente ad una sequenza
complementare (ibridazione) la sonda radioattiva si legherà
al cDNA di interesse.
© Zanichelli editore, 2014
30
Ibridazione (II)
Il segnale ad alta energia del 32P viene catturato su una
lastra fotografica, permettendo di identificare quale
pozzetto conteneva il cDNA cercato. Dato che in ogni
pozzetto era stato caricato il DNA di un singolo clone, con
questa procedura è possibile risalire al clone della biblioteca
che contiene il cDNA che cercavamo.
© Zanichelli editore, 2014
31
Clonaggio diretto di una sequenza
genica: la PCR (I)
La reazione a catena della
polimerasi (PCR)
automatizza la reazione di
duplicazione del DNA,
utilizzando DNA polimerasi
batteriche termostabili, cioè
stabili ad alte temperature.
Un termociclatore, la macchina usata per la
PCR
© Zanichelli editore, 2014
32
Clonaggio diretto di una sequenza
genica: la PCR (II)
La miscela dei cDNA generata a partire dagli mRNA
cellulari viene usata per una PCR. Gli oligonucleotidi
complementari all’inizio e alla fine del cDNA di interesse
funzionano da inneschi per la reazione di
polimerizzazione.
© Zanichelli editore, 2014
33
Clonaggio diretto di una sequenza
genica: la PCR (III)
Attraverso ripetuti cicli di denaturazione, rinaturazione e
polimerizzazione la sequenza originaria è amplificata per
ogni ciclo n di un fattore 2n: 32 cicli = 232 =>109 copie.
© Zanichelli editore, 2014
34
Clonaggio diretto di una sequenza
genica: la PCR (IV)
Utilizzando inneschi che
contengono le sequenze di
taglio per endonucleasi di
restrizione, le copie del
cDNA di interesse generate
per PCR possono essere
direttamente inserite nei
vettori di clonaggio con la
DNA ligasi.
© Zanichelli editore, 2014
35