COLTIVAZIONE DEI BATTERI
Substrati di crescita: Terreni di coltura
1. terreni definiti: si conosce l'esatta composizione chimica
Es.
Terreno per Escherichia coli
Glucosio
Na2HPO4
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4.7H2
CaCl2
FeSO4. 7H2O
PH finale 6,8-7,0
quantità (g/l)
1,0
16,4
1,5
2,0
200,0
10,0
0,5
b) Terreni complessi: la composizione chimica di alcuni componenti non è
esattamente conosciuta
Es. Alcuni tra i più comuni terreni complessi
Brodo nutritivo
Peptone (idrolisato di gelatina)
Estratto di carne di manzo
TSB (Tryptic Soy Broth)
Triptone (digesto pancreatico della caseina)
Peptone (digesto della farina di soia)
Glucosio
Cloruro di sodio
Fosfato di potassico
Agar MacConkey
Digesto pancreatico di gelatina
Digesto pancreatico di caseina
Digesto peptico di tessuto di animale
Lattosio
Sali biliari
Cloruro di sodio
Rosso neutro
Cristal violetto
Agar
quantità (g/l)
5
3
17
3
2,5
5
2,5
quantità (g/l)
17,0
1,5
1,5
10,0
1,5
5,0
0,03
0,001
13,5
Stato fisico dei terreni
A-Terreni liquidi
B-Terreni solidi: a base di agar o di gelatina
Agar: miscela di polisaccaridi estratti da alghe rosse
Punto di fusione > 80°C
Punto di solidificazione < 45°C
Aggiunto nella proporzione dell’1-2% (0,5% per terreni semisolidi)
Tranne alcuni batteri marini, i batteri non possiedono enzimi in
grado di attaccare l’agar
Gelatina: sostanza di natura proteica che si ottiene per azione dell’acqua
bollente sui collageni
Punto di fusione e di solidificazione: 25°C
Aggiunta nella proporzione del 10-20%
I terreni a base di gelatina si usano per identificare i batteri che
Possiedono enzimi in grado di attaccare la gelatina (batteri
fluidificanti la gelatina)
Terreni colturali liofilizzati
Crescita in terreno liquido: lo sviluppo batterico è evidenziato da
intorbidamento del terreno
Crescita su terreno solido: lo sviluppo batterico dà origine alla formazione
di colonie o di patina
Tipi di terreno
A-Terreni di base (es. Triptic soy broth)) di uso generale. Consentono la
crescita di molti microrganismi
B-Terreni arricchiti: al terreno base si aggiungono varie sostanze a
seconda delle esigenze nutrizionali del batterio: es latte, sangue,
vitamine, aminoacidi, ecc.
C-Terreni di arricchimento: terreni selettivi liquidi nei quali lo sviluppo
del batterio che si vuole isolare è favorito rispetto a quello dei
contaminanti.
Si fa seguire una sottocoltura in terreno selettivo solido.
D-Terreni selettivi: contengono sostanze batteriostatiche nei confronti
della flora microbica contaminante ma senza azione nei confronti del
batterio ricercato che è quindi favorito nello sviluppo.
E-Terreni indicatori: oltre ai normali costituenti contengono sostanze che
sono modificate in maniera facilmente apprezzabile dal batterio
ricercato o dai batteri contaminanti in modo che le colonie degli uni
siano facilmente evidenziabili dalle colonie degli altri.
Es. Gli enterobatteri patogeni non fermentano il lattosio; Escherichia
coli fermenta il lattosio con produzione di metabolici acidi che sono
messi in evidenza con un indicatore di pH
Nutrient agar: le colonie crescono indifferenziate
A
B
Agar Eosina Blu di Matilene (EMB)
Blu di metilene: inibisce la crescita della maggior parte dei batteri Gram positivi
Eosina: colorante che passa da incolore a nero quando il mezzo diventa acido
A-Batteri lattosio non fermentanti: colonie incolori
B-Batteri lattosio fermentanti:centro scuro con riflessi verde metallico delle colonie
A
B
Agar Salmonella Shigella (agar SS)
Sali biliari: inibiscono la maggior parte dei Gram positivi
Rosso neutro: indicatore rosso a pH acido e incolore a pH
basico
A- batteri lattosio fermentanti
B- batteri lattosio non-fermentanti
C-batteri lattosio non fermentanti produttori di acido
solfidrico
C
pH
Si controlla il pH mediante pHmetro
L’aggiustamento del pH si fa mediante aggiunta di NaOH o HCl diluiti
Al terreno si possono aggiungere indicatori di pH per evidenziarne le
variazioni es. Blu di bromotimolo
Rosso metile
Rosso congo
Rosso fenolo
Rosso neutro
I terreni prima della semina del campione devono essere sterili
In genere sono sterilizzati in autoclave
I terreni acquosi contenenti sostanze termolabili sono sterilizzati per
filtrazione
La vetreria è sterilizzata mediante aria calda (stufe a secco)
I terreni prima della semina del campione devono essere sterili
STERILIZZAZIONE: ha lo scopo di distruggere qualsiasi
microrganismo presente in un dato materiale
DISINFEZIONE:ha lo scopo di distruggere microrganismi patogeni
ANTISEPSI: tende a distruggere microrganismi sulla cute, ferite,
sostanze
Sterilizzazione
A- Calore
Il calore agisce denaturando le proteine e disgregando la membrana
citoplasmatica
I vari microrganismi possiedo diversa sensibilità al calore
Tempo di morte termica:tempo richiesto per sterilizzare una sospensione
microbica ad una determinata temperatura
Tempi di morte termica approssimativi per microrganismi con diversa resistenza
Calore secco
160°C 180°C
min
min
Molto sensibile
Batteri asporigeni
Virus
Miceti
Poco resistente
Clostridium perfingens
(spore)
Virus dell’epatite
Moderamente resistente
Clostridium septicum
(spore)
Bacillus anthracis
(spore)
Molto resistente
B.stearothermophilus
Clostridium botulinum
(spore)
Termofili del terreno
3
Acqua
bollente
100°C
min
Vapore
sotto ressione
121°C 132°C
min
min
<1
2
1
<1
4
<1
5
2
<1
4
<1
10
3
<1
30
5
30
12
2
60
10
<500
25
4
1- Calore secco
- Incenerimento
- Flambaggio
- Aria calda:
Metodo di scelta per la sterilizzazione di vetreria di laboratorio, siringhe di
vetro, materiale di porcellana, ecc.
Si usano particolari stufe a doppia parete
I genere si sterilizza a : 160°C per 2 ore
180°C per 1 ora
2-Calore umido
A-Acqua bollente
100°C per 5-10 minuti
non si ottiene la sterilizzazione
Si può aumentare l’azione microbicida aggiungendo disinfettanti chimici
B-Vapore
Deve essere:
- Privo di aria:
Impedisce al vapore di venire a contatto con il materiale
La temperatura è quella della miscela aria e vapore
- Saturo e non surriscaldato:
deve avere una temperatura non superiore a quella corrispondente a una
data pressione
temperatura
pressione (Atm)
100
0,00
112
0,5
121
1
128
1,5
1-Vapore fluente
Pentola di Koch
100°C per 30-60 minuti
Le spore batteriche non vengono uccise
Tindalizzazione
Consiste nel riscaldamento di materiali organici per 20-45
minuti, ripetuto per tre giorni di seguito → si ottiene l’uccisione
delle spore
2-Vapore sotto pressione
Autoclavi: apparecchi a perfetta tenuta resistenti alla pressione
Sono provviste di: Termometro
Manometro
Rubinetto di espurgo
Il ciclo di sterilizzazione comprende 4 fasi:
1- Caricamento del materiale
Il materiale non deve essere ammassato
2- Riscaldamento preliminare
Si portano temperatura e pressione ai livelli desiderati
I tappa: si scalda a 100°C con l’orificio di espurgo aperto
II tappa: si chiude l’orificio di espurgo
La temperatura sale fino al livello richiesto
3-Sterilizzazione
temperatura e pressione sono mantenuti a livelli costanti per un determinato periodo
tempi di sterilizzazione:
121°C per 15 minuti
115°C per 30 minuti
4- Raffreddamento
L'autoclave non va aperta fin tanto che all'interno la pressione è superiore a 1
B-Filtrazione
Per soluzioni acquose termolabili
Sterilizzazione dell'ambiente di lavoro
A- Raggi ultravioletti (260 nm)
Sono caratterizzati da:
- lenta attività d'azione
- scarso potere di penetrazione ( non attraversano vetro, superfici
solide, strati di sporco, ecc.)
Lampade UV sono applicate al soffitto delle stanze o nelle cabine a
flusso laminare
Il personale non deve essere esposto in quanto i raggi UV
provocano ustioni della cute e danneggiano gli occhi
B- Cappe a flusso laminare
Semina
Su terreno solido:
a) disseminazione
in superficie
Semina per disseminazione in superficie
B) semina per inclusione
Il campione deve essere liquido
Semina per inclusione
Condizioni di incubazione
Vanno rispettate le esigenze di crescita dei batteri (temperatura e
atmosfera.
Per i batteri anaerobi si deve garantire l'assenza di ossigeno
La semina in un terreno di coltura premette:
1.La conta batterica
A-Carica batterica totale: su tereni solidi
2. Isolamento e identificazione
L'identificazione dei batteri si esegue su coltura pura: terreni contenenti
una sola specie batterica
si ottiene prelevando una sola colonia cresciuta su tereno solido e la si
semina in un altro terreno
Si basa su:
1- attività metabolica dei batteri
A- inoculo di una porzione di colonia sospetta in una serie di terreni di
coltura contenenti substrati particolari e indicatori che evidenziano
le variazioni di pH e la presenza di cataboliti
B- Sistemi di identificazione rapida
es. API 20E API 20 non E
2- carattere morfologico
Osservazione microscopica dei batterì
3- carattere antigenico
4- carattere genetico
Studio di specifiche sequenze del DNA