Prof. Giorgio Sartor
Specie radicaliche
e stress ossidativo
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All rights reserved.
Versione 4.2.1 – jun 2015
Radicali
• Specie chimiche con elettroni spaiati
• occupano da soli un orbitale atomico o
molecolare
• Molto instabili e reattivi verso le altre
molecole per compensare tale squilibrio
• Autopropagazione per reazioni a catena
• Pericolosità inversamente proporzionale
all’emivita
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-2-
Meccanismi di formazione di radicali
• Perdita di un elettrone:
X  X•+ + eChl* + A  Chl•+ + A-(•)
• Acquisto di un elettrone:
X + e-  X•O2 + e-  O2•• Scissione omolitica di un legame covalente:
X-Y  X• + Y•
Cl2  2Cl•
• Astrazione di un atomo di idrogeno (H•) da
parte di un altra specie radicalica:
CH4 + Cl•  CH3• + HCl
Lipide-H + OH•  Lipide• + H2O
R-SH + R-O2•-  R-S•- + R-O2H
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-3-
Ossigeno
• Orbitali molecolari
dell’ossigeno
 x*
y*,x*
y,x
x
• Potenziali di
riduzione
e-
O2
-0.16v
O2
e- + 2H+
O2.-
0.94v
O2.-
e- + 2H+
H2O2
H2O2
H2O
e- + H+
0.38v
OH.
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O21g
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
2.33v
H2O
-4-
Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Specie non radicaliche
H2O2
HOBr
HOCl
O3
O2 1Δg
LOOH
ONOOH
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acqua ossigenata (perossido di idrogeno)
acido ipobromoso
acido ipocloroso
ozono
ossigeno singoletto
perossido lipidico
perossinitrito
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-5-
Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Radicali prodotti per riduzione ad un
elettrone
•O-O•
+ e- → •O-O:O2•- + •OH → ¹O2 + OH2O2•- + 2H+ → H2O2 + ³O2
O2•- + H2O → HOO•
H2O2 + e- → OH- + OH•
L + O2•- → LOO•-
anione superossido
ossigeno singoletto
perossido
idroperossiradicale
radicale idrossido
anione lipoperossido
• Reazioni:
H2O2 + Fe²+ (Cu+ ) → Fe³+ (Cu++ ) + OH- + OH•
(Fenton)
H2O2 + O2•-(Cu/Fe) → O2 + OH- + OH•
(Haber-Weiss)
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
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Specie Reattive dell’Ossigeno
(ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-7-
Specie Reattive dell’Ossigeno
(ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria nel
complesso IV
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-8-
Complesso IV
Eme a
Eme a3
CuB
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
-9-
Formazione di H2O nel complesso IV
eme a
eme a
N
N
N
eN
N
+++
Fe
e-
N
eme a3
N
Fe
CuB++
+++
Cu
N
N
+
N
++
Fe
N
N
O2 + 4H+ + 4e-
Cu
+
O2
2H2O
N
2H2O
N
+++
Fe
2H+
O
N
Cu
+
O
N
eme a
N
N
N
e-
+++
Fe
eme a
OH Cu++
N
N
OH
N
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N
Fe
4+
N
N
eO
Cu++
H
O
N
+
H
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
2H+ N
+++
Fe
O
N
Cu++
O
- 10 -
Lipoperossidi
H
O
H
O
CH2 +
Y
X
Y
H
H
H
W
+ H3C
Malondialdeide
H
H
O
O
X
Y
O H
O
Y
X
Y
X
C
O2
Y
C
X
O
O
O
Y
H
X
R
OH
4-idrossinonenale
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 11 -
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 12 -
Specie Reattive dell’Azoto
(RNS)
• Prodotti prevalentemente dallo smog fotochimico
• Specie non radicaliche
–
–
–
–
–
–
–
–
HNO2
NO+
NON2O4
N2O3
NO2+
ROONO
NO2Cl
acido nitroso
catione nitrosile
anione nitrosile
tetrossido di diazoto
triossido di diazoto
nitrile
alchilperossinitrito
cloruro di nitrile
• Specie radicaliche
–
–
–
–
O2 + L-arginina → NO• + L-citrullina
O2•ˉ + NO• → ONOOˉ
ONOOˉ + CO2 → ONOOCO2ˉ
ONOOCO2ˉ → NO2• + CO3•ˉ
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
ossido d’azoto
perossinitrito
nitroperossicarbonato
biossido d’azoto
- 13 -
Ciclo dell’urea e NO
2ATP
2ADP + Pi
Carbamilfosfato
O
CO2 + NH3
O
Carbamil-fosfato
sintasi
EC 6.3.4.16
O
P
O
Citrullina
(IN)
NH2
NH2
HN
O
O
NH3 +
Ornitina
(IN)
Ornitina
trans carbamilasi
EC 2.1.3.3
NH3 +
Trasportatore
della citrullina
NH3 +
O
O
Citrullina
(OUT)
O
H2 O +
0.5 NADP+
O
NH3 +
H
N
O
Trasportatore
dell'ornitina
NH3+
Ornitina
(OUT)
NO sintasi
EC 1.14.13.39
NH3 +
NH3 +
O
Urea
H2 N
O
H
N
N
O
N--idrossi-L-arginina
O
O
O
Aspartato
NH3 +
O
H2 N
Arginasi
EC 3.5.3.1
NH3 +
O
O
H
N
NH2
O
P
O
N
OH
OH
O
NH2+
O
Citrullil-AMP
O
O
Aminoacido
Argininosuccinato
sintasi
EC 6.3.4.5
O
NH2+
Arginina
Fumarato
H
N
O
NH3 +
-chetoacido
O2 +
NADPH
H2O
O
Malato
H2 O +
NADP+
N
O
Ossalacetato
N
N
PPi
Argininosuccinato
sintasi
EC 6.3.4.5
OH
H2 N
ATP
NO.
NH2
2 Pi
NH2
O
O2 +
0.5 NADPH
O
O
AMP
O
O
O
O
NH3 +
Argininosuccinato
liasi
EC 4.3.2.1
O
H
N
O
NH2+
O
O
O
Argininosuccinato
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 14 -
Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
NH3+
O
Ossidazione a
due elettroni
H2O
O2
H
N
NH3+
NH2
O
NH
O
NADPH
NADP+
NH2
N
O
L-arginina
H
N
OH
N--idrossi-L-arginina
O2
Nitric Oxyde Sinthase
0.5 NADPH
Ossidazione a
tre elettroni
0.5 NADP+
H2O
NH3+
O
H
N
NH2
O
O
+ NO.
L-citrullina
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 15 -
Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
Ossidazione a
due elettroni
L-arginina
O
O
NH3+
H
N
O
O
Fe
L-citrullina
NH3+
NH2
O
O
Fe
H
3+
H
N
O
NADPH
Fe
NADP+
O
H
2+
0.5 NADPH
O
Ossidazione a
tre elettroni
0.5 NADP+
H2O
3+
NH2
N
O
+ NO.
NH3+
H
N
O
O
O
Fe
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NH3+
O
H
N
O
H2O
NH2
N
N--idrossi-L-arginina
O
NH2
N
O H
NH3+
H
N
O
O
2+
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
O
Fe
O
NH2
N
O
H
2+
- 16 -
NO sintasi (EC 1.14.13.39)
Dominio Ossidoreduttasico
1F20
NADP+
FAD
Dominio eme
1FOP
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
EME
ARG
- 17 -
Specie reattive del cloro (RCS)
• Radicali
– Cl•
• Non radicaliche
– HOCl acido ipocloroso (ROS)
– NO2Cl cloruro di nitrile (RNS)
– Cloramine
– Cl2
cloro
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 18 -
Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
NO2SCNI-
HONO2
• La mieloperossidasi
(MP3+) è un enzima
perossidasico presente
nei granuli dei
neutrofili.
• Si ritiene che produca
HOCl nei fagosomi.
• Può usare anche altri
ioni oltre il cloruro.
HOSCN
HOI
HOBr
HOCl
O2
.-
BrCl-
MP3+ + H2O2
Comp I
RH
O2.R.
MP2+O2
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F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
Comp II
- 19 -
Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 20 -
Stabilità dei radicali
TEMPO DI
RADICALE
VITA
Radicale idrossido
·OH
10-9 s
Radicale alcossido
·OR
10-6 s
1
O2
10-5 s
ONOO-
0.05-1.0 s
Ossido di azoto
·NO
1-10 s
Radicale perossido
ROO·
7s
O2·-
103-104 s
Ossigeno
singoletto
Anione
perossinitrito
Anione
superossido
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 21 -
Sorgenti di Radicali
• Endogene:
• Esogene:
– Catena respiratoria,
– Xenobiotici,
– Fotosintesi,
– Radiazioni
– Sintesi di
prostaglandine,
– Metabolismo dei
nucleotidi
– Ionizzanti (raggi X)
– Non ionizzanti (UV)
– Calore,
– Infezione,
– Perossisomi,
– Iperossia,
– Autossidazione,
– Inquinamento
– Fagocitosi,
– Ossiemoglobina,
– Enzimi ossidativi…
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 22 -
Sorgenti di Radicali
• Endogene:
• Esogene:
– Catena respiratoria,
 Xenobiotici,
– Fotosintesi,
– Radiazioni
– Sintesi di
prostaglandine,
– Metabolismo dei
nucleotidi
– Perossisomi,
– Autossidazione,
– Ionizzanti (raggi X)
– Non ionizzanti (UV)
– Calore,
– Infezione,
– Iperossia,
 Inquinamento
– Fagocitosi,
– Ossiemoglobina,
– Enzimi ossidativi…
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 23 -
Invecchiamento
Diminuzione delle difese
antiossidanti
UV
Aumento dello stress
ossidativo
AUMENTATA
PRODUZIONE DI
ROS
Accumulazione di
mutazioni del DNA
Modificazione di
proteine
Stimolazione delle vie
di trasduzione del
segnale
Alterazione della
struttura genica
Alterazione dell’attività
genica
Alterazione della
struttura e della
funzione delle proteine
Perdita della regolazione dell’omeostasi
intracellulare ed extracellulare
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 24 -
Stress ossidativo
Perossidazione
lipidica
Danni al DNA
Aumento di Fe+++, Cu++,
eme-proteine liberi
Attivazione di
Poli ADP riboso sintasi
Riduzione di
NAD(H)
Diminuzione e
ossidazione di GSH
Danni al
citoscheletro
Inibizione della
sintesi di ATP
Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Attivazione di
NOS
Formazione di
perossinitrito
gs © 2001-2008 ver 4.1
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
Alterazione delle
membrane
Rilascio di ioni,
eme-proteine
perossidi ecc.
Specie radicaliche e stress ossidativo
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
Perossidazione
delle membrane
Aumentato
danno a DNA,
proteine e
lipidi
- 25 - 25 -
Danni al DNA
•
Danni endogeni
–
•
ROS prodotti dal metabolismo, portano alla
deaminazione ossidativa
Danni esogeni da:
–
–
–
–
–
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
Radiazioni: UV (200-400 nm), Raggi X, Raggi
g
Idrolisi e degradazione termica
Tossine vegetali
Composti mutageni di origine antropica
(intercalanti)
Virus
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 26 -
Tipi di danno
• Ossidazione delle basi: formazione di 8-osso-7,8diidroguanine (8-oxoG)
• Alchilazione delle basi (in genere metilazione) con
formazione di 7-metilguanina, 1-metiladenina, 6O-Metilguanina
• Idrolisi delle basi (deaminazione,depurinazione e
depirimidinazione)
• Formazioni di addotti con IPA e derivati
• Formazione di cross-link tra citosine e timine
adiacenti formano dimeri di pirimidina da UV
• Depurinazione da temperatura
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 27 -
R
• Perdita di basi: il legame
glicosidico è labile sotto
condizione fisiologiche
(formazione di un sito AP).
• Deamminazione ossidativa:
i gruppi amminici primari
sono a volte instabili e
possono venire convertiti in
chetoni.
• Metilazione con formazioni
di O-metilderivati
O
O P
O
O
N
O
P
N
N
O
O
OH
O
O
H
O
O P
OH
O
O
O P
O P
H2 N
OH
N
N
H
O
O
O
R
OH
O
O
N
O
O
R
Citidina
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
N
O
NH2
N
O
O P
O P
O2
N
N
NH2
N
R
R
O
Sito AP
OH
O
CH3
NH2
N
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
O
N
H
O
O
NH3
N
O P O
R
Uracile
- 28 -
Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti
• Danni diretti: Single Strand Break,
Double Strand Break, Mismatched bases.
• Danni indiretti: produzione di ROS.
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 29 -
Danni Fisici: Radiazioni UV
• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e fotoinvecchiamento (UV-B)
• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP
(UV-C).
R
R
O P
O
O
O
O
O P
N
O
O
O
O
O
N
N
N
CH3
H
P OH
CH3
O
O
O P
O
P OH
O
R
N
O
N
N
O
O
O
NH
O
O
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
CH3
O
O
O
O
O
O P
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
O
R
- 30 -
Danni chimici: ROS
• Causano ossidazione delle basi e amplificano
deamminazioni e depurinazioni.
o Un esempio di composto ossidato è OH8dG:
causa trasversioni delle basi GC → TA
O
RO
RO
NH
N
NH2
deossiGuanosina
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
N
O
N
H
O
ROS
N
O
RO
RO
O
N
N
NH
NH2
8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 31 -
Danni chimici: inquinanti Organici
• Epigenetici: danno indiretto al
DNA attraverso stress
ossidativo o l’attivazione di
composti pericolosi. Es. IPA.
• Genotossici: danno diretto
al DNA tramite formazione
di addotti (alchilanti in
posizioni nucleofile).
(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo
NH2
N
N
N
NH
O
benzo[a]pirene
OH
(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossido
monoossigenasi
O
NH2
Guanina
N
N
NH
R
HO
O
NH2
O
N
epossido-idrolasi
R
Timina
R
Adenina
N
H3C
monoossigenasi
N
N
N
O
N
R
Citosina
N
O
DNA
N
N
H
N
O
H
HO
HO
OH
HO
OH
(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido
addotto con il DNA
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 32 -
Riparazione del danno single-strand
• Enzimi di riparazione del danno Single-strand (Uracil-DNA
glicosilasi EC 3.2.2.)
• Uso dell’altro strand come templato
• Base excision repair (BER) rimuove il danno da alchilazione,
ossidazione, idrolisi, deaminazione. La base danneggiata è
rimossa da una DNA glicosidasi. La base mancante è
risintetizzata da una DNA polimerasi e reinserita da una
DNA ligasi
• Nucleotide excision repair (NER), riconosce distorsioni
dell’elica come la formazioni di dimeri di pirimidina
• Mismatch Repair (MMR) corregge errori di replicazione e
ricombinazione dovuti a errori nell’accoppiamento delle basi
non danneggiate.
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 33 -
Uracil-DNA glicosilasi (EC 3.2.2.X)
• Ripara il danno ossidativo C  U
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 34 -
Riparazione del danno double-strand
• Non-homologous end joining (NHEJ),
microhomology-mediated end joining
(MMEJ) e ricombinazione omologa
• L’enzima DNA ligasi ripristina il legame tra
nucleotidi con la formazione di un legame
estereo tra il fosfato e il nucleotide
• In NHEJ, DNA Ligasi IV, è una DNA ligasi
specifica che forma un complesso con una
proteina (XRCC4) che è coinvolta nelle
interazione con i promotori.
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 35 -
Antiossidanti
• Gli antiossidanti non sono, in genere, dei radicali
liberi. Quindi quando un antiossidante agisce si
forma un radicale derivato dall’antiossidante.
• Se un radicale libero perde o guadagna un
elettrone non è più un radicale libero:
NO•  e- + NO+
NO• + e-  NO• La reazione tra specie radicaliche porta alla perdita
netta di radicali
O2•- + NO•  ONOO• nello specifico lo ione perossinitrito può generare
radicale idrossile.
ONOOH  OH• + NO2•
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 36 -
Acido ascorbico (Vit. C)
OH
O
H
HO
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
OH
H
OH
OH
O
H
HO
OH
H
+
H O
H
+
H
O
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 37 -
A mechanistic study of the reduction of quinones by ascorbic acid
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 38 -
Referenze sul WEB
•
Vie metaboliche
– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/
•
•
Struttura delle proteine:
– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/
– Hexpasy
•
•
•
•
•
•
•
•
Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/
Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/
Enzyme (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
Enzimi:
– Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/
– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/
Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/
Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html
Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry
http://www.atsdr.cdc.gov
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
- 39 -
Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e
ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga
riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna – Alma Mater
Giorgio Sartor - [email protected]
gs © 2001-2015 ver 4.2.1
F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo
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