La biopsia di nervo
Vittorio Cavallari
Sezione di Diagnostica Ultrastrutturale e Metodologie Quantitative
Dipartimento di Patologia Umana, Università di Messina.
www.geocities.com/diagnostica_morfo_integrata
Generalità
La biopsia di nervo non è più un
procedimento diagnostico elettivo:
• Metodo invasivo che può provocare
sintomatologie dolorose indesiderate
• Metodo oneroso in termini di risorse e
tempi di esecuzione dell’indagine
• Informazioni aggiuntive relativamente
poco rilevanti rispetto al pannello degli
studi neurofisiologici
Effetti indesiderati
• Dolore da neuroma
• Iperestesia e disestesia nell’area cutanea
innervata dal tronco nervoso sezionato
• Inestetismi da esiti dell’intervento
chirurgico
Indicazioni diagnostiche
• Limitate alle situazioni in cui si rilevano
discrepanze fra il quadro clinico e i dati
strumentali.
• Il contributo delle informazioni ottenute mediante
lo studio delle fibre amieliniche, non accessibili
alle indagini strumentali, non è unanimemente
riconosciuto
• Il significato prognostico dell’esame, che può
essere accuratamente quantificato, non
giustifica in molti casi i disagi per il paziente.
Metodologie
• Biopsia fascicolare
• Biopsia dell’intero tronco nervoso
• Nervi utilizzati: Surale, peroneo
superficiale, radiale cutaneo.
La sede della biopsia dipende dal tipo di
patologia presente nel soggetto. Per lo
studio della neuropatia diabetica è spesso
utilizzato il nervo surale.
Trattamento del materiale
• L’esame istologico e immunoistochimico
tradizionali non forniscono di solito informazioni
utili.
• L’inclusione in paraffina determina estese
alterazioni strutturali delle fibre nevose.
• La metodica d’elezione è l’inclusione in resina,
che consente l’esame in microscopia ottica ed
elettronica di materiale strutturalmente
preservato in maniera soddisfacente.
• Metodiche aggiuntive, quali la dissociazione di
fibre osmicate (teasing) forniscono informazioni
addizionali sulla mielina.
Nervo incluso in paraffina
Nervo incluso in paraffina
Nervo incluso in resina
Trattamento del materiale
• È bene ottenere sezioni dell’intero tronco
nervoso, che verranno utilizzate per la
valutazione generale della superficie fascicolare.
Le sezioni, di spessore inferiore a 0.5 mm,
vengono tagliate con una lama da rasoio da
porzioni non traumatizzate del nervo e poi
incluse orientate in trasversa.
• I fascicoli vengono poi delicatamente dissociati
nel nervo residuo, e inclusi orientati in
longitudinale e in trasversa.
• Il nervo è estremamente delicato e suscettibile
agli artefatti da trattamento improprio.
Artefatti da compressione
Sezioni semifini
• Sezioni dell’inclusione in resina spesse 1µm,
colorate con blu di toluidina e osservate in
microscopia ottica.
• La mielina è intensamente osmiofila, e le sezioni
semifini sono il metodo migliore per studiare le
alterazioni strutturali delle fibre nervose di
grande e medio diametro.
• Sono inoltre facilmente accessibili per lo studio il
perinervio e i vasi epineurali ed endoneurali.
Panoramica dell’intera superficie del nervo surale
Fascicolo nervoso
Vasi epineurali
Nervo surale normale
Nervo surale normale
Analisi quantitativa
• Fornisce informazioni importanti in
microscopia ottica ed elettronica.
• Non è una procedura diffusamente
applicata, poiché richiede elevati livelli di
organizzazione delle procedure e tempi di
elaborazione relativamente lunghi.
• Il progresso del supporto informatico
rende l’analisi quantitativa sempre più
efficiente e agevole.
Analisi quantitativa
•
•
•
•
Procedure
Campionamento random-sistematico
Misurazione individuale delle fibre nervose
Misurazione dello spazio di riferimento
Analisi statistica
Campionamento random – sistematico
La superficie da misurare viene prelevata da
ogni fascicolo, senza altri criteri di scelta.
Morfometria in microscopia
ottica. Misurazione
automatica delle fibre.
Analisi quantitativa
•
•
•
•
Morfometria in microscopia ottica
Densità numerica delle fibre mieliniche
Analisi statistica: istogramma dei diametri
e delle aree delle fibre
Calcolo della G-ratio (valore medio = 0.8)
Analisi della correlazione mielina-assone
300
Istogramma dell’area assonale
Nervo normale
Densità numerica 11200/mmq
200
100
Std. Dev = 35,24
Mean = 42,3
N = 917,00
0
0
0,
18 ,0
0
17 ,0
0
16 ,0
0
15 ,0
0
14 ,0
0
13 ,0
0
12 ,0
0
11 ,0
0
10
,0
90
,0
80
,0
70
,0
60
,0
50
,0
40 0
,
30
,0
20
,0
10
0
0,
V1
80
Correlazione fra area della mielina(x)
e area assonale (y) R= 0.965
Nervo normale
60
40
V4
20
0
0
V5
20
40
60
80
100
120
Analisi quantitativa in microscopia
elettronica
• Densità numerica e distribuzioni di frequenze
delle fibre amieliniche. Questi parametri non
sono molto attendibili, per la frequente
coesistenza di fenomeni rigenerativi che
possono mascherare la perdita assonale
• Misurazione delle cellule di Schwann e della
correlazione con l’area assonale.
• La morfometria in m.e. non ha in atto significato
diagnostico ma può essere utilizzata nella
ricerca.
Neuropatia diabetica
• Neuropatia distale e simmetrica
Neuropatia sensitivo-motrice
Neuropatia vegetativa
• Neuropatia ischemica (interessamento
asimmetrico di singoli tronchi nervosi)
Neuropatia distale e vegetativa
• Lesione primitiva assonale
• Interessamento secondario della mielina
• Degenerazione delle porzioni più distali delle
fibre nervose (diyng-back)
• Alterazioni morfologiche aspecifiche
• Nei nervi sensitivi e vegetativi, riduzione
numerica delle fibre amieliniche
• Quote variabili di fenomeni rigenerativi che
possono rendere meno evidente l’effettiva
perdita di fibre nervose.
Lesioni precoci nella neuropatia diabetica
Nervo surale apparentemente normale
Densità numerica delle fibre conservata
Alterazioni del contorno della mielina
e del rapporto mielina/assone
Contorno festonato della mielina
Neuropatia diabetica avanzata
Grave riduzione numerica delle fibre mieliniche
Grave neuropatia assonale
*
Gravissima neuropatia assonale
*
Gravissima neuropatia assonale
Microscopia elettronica
• La patologia delle fibre mieliniche può
essere studiata con maggiore precisione
• Sono inoltre accessibili per lo studio le
fibre amieliniche, le cellule di Schwann, il
perinervio e i capillari endoneurali.
Ipermielinizzazione
Mielina sottile, fibra in rigenerazione
Degenerazione laminare
Disposizione iniziale ad onion bulb delle cellule di Schwann
Fibre amieliniche normali
Riduzione numerica delle fibre amieliniche
Bande di Büngner amieliniche
Riduzione numerica, edema e ipotrofia delle fibre amieliniche
E
I
Collagen pockets e assoni nudi
AX
S
Microscopia elettronica
Alterazioni strutturali del perinervio:
• Ispessimento
• Deposizione di membrana basale
• Presenza di detriti osmiofili endocellulari
Ispessimento del perinervio
C
Ispessimento del perinervio e depositi elettrondensi
14
Correlazione fra area della mielina (x)
E area assonale (y) R=0.65
Neuropatia diabetica
di media gravità
12
10
8
6
4
V4
2
0
0
V5
10
20
Neuropatia ischemica
*
*
Neuropatia ischemica
Neuropatia ischemica
Conclusioni
• La biopsia di nervo periferico è un esame
invasivo che va limitato a casi di effettiva
necessità.
• Per lo stesso motivo sarebbe preferibile che la
biopsia fosse trattata nel modo più completo
possibile, per garantire, una volta effettuata, la
massima quantità di informazioni
• L’analisi quantitativa è fortemente
raccomandata, in quanto può fornire
informazioni dinamiche sui processi di
mielinizzazione, importanti per la prognosi.