Università degli Studi di Catania La caratterizzazione genetica del Coniglio selvatico Oryctolagus cuniculus e la dinamica annuale in alcuni ambiti territoriali della provincia di Catania Regione Sicilia Assessorato Agricoltura e Foreste Dipartimento Interventi Strutturali Servizio XI - Faunistico Venatorio ed ambientale Ripartizione Faunistico Venatoria ed Ambientale di Catania La caratterizzazione genetica del Coniglio selvatico Oryctolagus cuniculus e la dinamica annuale in alcuni ambiti territoriali della provincia di Catania Università degli Studi di Catania Dipartimento di Scienze Biomediche Osservatorio Natura s.r.l. Regione Sicilia Assessorato Agricoltura e Foreste Dipartimento Interventi Strutturali Servizio XI - Faunistico Venatorio ed ambientale Ripartizione Faunistico Venatoria ed Ambientale di Catania Dinamica delle popolazioni Giovanni Leonardi (coordinamento ed analisi), Antonio Brogna, Vincenzo Mannino, Roberto D’Angelo, Graziella Lucia Dell’Arte Analisi genetica Prof. Salvatore Travali, Antonio Brogna Ripartizione Faunistico venatoria ed Ambientale Dott. Carlo Amico (dirigente), Maurizio Pennisi (funzionario direttivc) Ringraziamenti La ricerca sulle dinamiche di densità è stata portata a termine grazie anche all’aiuto dell’’Ente Parco dell’Etna, della stazione di Bronte del Corpo Forestale e dalla direzione del “Picciolo Golf Club”. Ringaziamo il Sig. Salvatore Leonardi (Picciolo Golf Club) per il suo costante aiuto durante la ricerca di campo. Indice 1. Densità e distribuzione spaziale delle popolazioni................5 2. Caratterizzazione del gene del citocromo b...........................23 3 1. Densità e distribuzione spaziale delle popolazioni Introduzione Questo studio condotto dalla R.F.V. ed Ambientale di Catania e l'Università degli Studi di Catania Dipartimento Scienze Biomediche in collaborazione con Osservatorio Natura s.r.l., si prefigge di ottenere un ulteriore approfondimento delle conoscenze sulla consistenza e composizione delle popolazioni di Coniglio all'interno di alcuni ambiti territoriali della provincia di Catania. I dati raccolti durante la ricerca promossa alla fine degli anni 90 dall'Ente Parco dell'Etna rappresentano una ottima base di partenza per potere affinare le metodiche da utilizzare sul campo nel presente lavoro di ricerca. Tecniche di censimento Le aree prescelte hanno una forma regolare, quadrata, e sono suddivise in griglie con celle di 100 × 100 m che approssimativamente rappresentano lo spazio vitale minimo sperimentato per un gruppo familiare (Villafuerte 1994). Attraverso l'utilizzo di strumenti GIS è stata effettuata la caratterizzazione ambientale e misurata la grandezza di ogni singolo patch (porzione) di territorio uniforme. Successivamente, sono state scelte in modo random le stazioni di rilevamento all'interno di questa griglia, una per cella. 5 La metodologia di rilevamento è quella già ampiamente utilizzata all'interno del Parco dell'Etna (Caruso et al., 1999) e successivamente nelle Riserve Naturali della provincia di Ragusa (Riserva “Pino d'Aleppo” e Riserva del Fiume Irminio; A.A.V.V. 2001). La tecnica consiste nell'utilizzare stazioni fisse (contrassegnate da paletti in castagno) per il conteggio degli escrementi di Coniglio al fine di misurare la densità di individui per ettaro all'interno dell'area campione prescelta (Wood, 1988; Palomares, 2001). Questa metodologia può essere applicata seguendo parametri diversificati in base alle condizioni ambientali delle aree di studio. Anche per questa ricerca si propongono quelli ideati da Taylor & Williams (1956) ed utilizzati per studi analoghi da Moreno & Villafuerte (1992) nel Parco Nazionale di Doñana (Spagna) e da Caruso et al. (1999) nel Parco Naturale Regionale dell'Etna. Il metodo consente di stimare la densità di animali D contando con cadenza mensile il numero di escrementi in parcelle standard di 1,54 m2 di superficie scelte casualmente all'interno degli habitat studiati. Successivamente viene applicata la formula di Eberhardt & Van Etten (1956) D = d/rt nella quale r è il numero di escrementi depositati da un individuo giornalmente (costante pari a 350 sulla base delle ricerche effettuate da Moreno & Villafuerte 1992 - per gli ambienti mediterranei), t è il periodo di tempo nel quale questi sono stati depositati e d è la densità media di escrementi per stazione di rilevamento. Le core areas Le densità mensili per stazione/cella sono state rappresentate su ortofoto carte delle aree campione attraverso la costruzione delle cosiddette core areas. Queste ultime includono le porzioni di territorio dove si presuppone che ci sia la maggiore probabilità di incontrare una determinata densità. In fine, le densità mensili ottenute durante i rilievi di campo sono state interpolate tra loro. Il calcolo delle core areas è basato sull'uso di una famiglia di algoritmi utilizzati nella metodologia denominata LoCoH (LOcal COnvex for Hull). Per questa ricerca abbiamo usato l'algoritmo Fixed k LoCoH (denominato k-NNCH) che produce le curve dal (k - 1) punto più vicino a quello preso in esame. Rispetto agli altri metodi di misurazione delle densità come il Minimum Convex Polygon (MCP) e quelli che usano i Kernel density estimate (KDE), LoCoH ottiene core areas molto realistiche. La resa è quindi molto simile al metodo del Fixed Kernel density estimate ampiamente utilizzato negli studi di 6 radio tracking. I calcoli sono stati effettuati attraverso la versione web del software LoCoH messo a disposizione dall'Università di Berkley (California, USA; http://locoh.cnr.berkeley.edu/). Nella procedura di calcolo, di fondamentale importanza è il valore attribuito a k che rappresenta il numero minimo di punti che interagiscono con quello preso in considerazione per la costruzione delle curve. Ovviamente se a k si associa il numero totale di punti a nostra disposizione LoCoH calcolerà curve al 100% quindi il cosiddetto Minimum Convex Polygon (MCP). Per questo studio in cui l'obiettivo finale è quello di calcolare in modo più possibile preciso le core areas si è scelto di calcolare k come la radice quadrata del numero totale delle osservazioni. Infine cosi come supportato dalla letteratura sui Fixed Kernel density estimate, si è deciso di mettere in evidenza le core areas utilizzando curve al 50% in confronto con quelle prodotte con l'intero range di probabilità (100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10). Le aree campione Le aree campione sono state scelte per motivi logistici e non sulla base di fattori ambientali correlabili alla specie in esame, evitando accuratamente di scegliere la posizione delle stazioni in modo pre-determinato. Infatti, appare contraddittorio posizionare le stazioni in modo random ma all'interno di subaree che sono state scelte precedentemente in modo soggettivo (coltivo, marginale, naturale ecc.). Gli animali sono teoricamente liberi di spostarsi in tutte le direzioni. Inoltre, devono essere i movimenti degli animali ad indicare le aree di scelta e non viceversa considerare quelli che rientrano nella nostra area contenitore artefatta. Nel primo studio effettuato all'interno del Parco dell'Etna sono state scelte otto aree campione e le densità possono essere relazionate sono a queste piccole porzioni non certo all'intero comprensorio del Parco. Questa ricerca si prefigge di condurre a risultati più fini quali i movimenti e le fluttuazioni delle popolazioni. Per valutare le densità sono state usate tecniche più dinamiche (censimenti notturni) utili su larga scala (10 o 20 Km) per confronti sull'intera provincia di Catania (cosi come suggerito dall'Istituto Nazionale per la Fauna Selvatica). In definitiva, i dati raccolti in questa ricerca cercano di valutare l'aspetto dinamico delle popolazioni e possono essere prese in considerazione come base per studi futuri. Le aree campione prese in esame sono nel comprensorio dell'Etna: il golf 7 Fig.1. Scorcio dell’area campione denominata “Piano dei grilli”. Fig.2. La griglia di lavoro delimitante l’area campione all’interno del Parco dell’Etna. 8 club “Il Picciolo” e la zona denominata “Piano dei Grilli”. La seconda già utilizzata nelle precedenti ricerche. L'area del golf club è strettamente controllata e mantenuta ai fini sportivi quindi il manto erboso e le aree “marginali” di macchia e alberi sono frutto delle geometrie richieste per lo svolgimento del gioco. Secondo i vecchi principi questa area non sarebbe utile in quanto gli animali dovrebbero essere pesantemente influenzati dalle continue attività umane o esserne favoriti (erba fresca, contenimento dei predatori ecc.). Un grande vantaggio è stato quello di non perdere durante lo svolgimento della ricerca nessuna stazione di rilevamento. Risultati generali Come era prevedibile i dati assoluti di densità del Coniglio nelle aree campione non differiscono da quelli già prodotti nei precedenti studi all'interno del Parco dell'Etna e nelle Riserve della Provincia di Ragusa (Caruso et al. 1999; A.A.V.V. 2001). Le fluttuazioni mensili e, quindi, stagionali hanno il “classico” andamento con picchi di densità nel mese di agosto settembre ed ottobre. Questi dati utilizzati in questo modo risultano abbondantemente ridondanti e non aggiungono nulla alle conclusioni già proposte nei precedenti studi. Inoltre, questa predisposizione del dataset può fornire spiegazioni alquanto parziali in quanto le densità rilevate vengono “spalmate” in tutta l'area campione. Questa ricerca di contro ha ottenuto dati molto più realistici in senso spaziale grazie al posizionamento delle stazioni in modo da ottenere dati di densità che rispettano le reali capacità di spostamento della specie. In tal modo possiamo cominciare a capire in che modo gli individui si dispongono nel territorio. Conseguentemente si può analizzare se le maggiori densità sono legate alla conformazione e natura del territorio. Inoltre, utilizzando l'intero dataset per ogni area campione, capire in quale porzione di territorio persiste il nucleo principale di individui. Poiché appare evidente che le fluttuazioni stagionali partono dalla produzione di nuovi individui a partire da nuclei più o meno numerosi di adulti sopravvissuti, ciò che è importante valutare è se esiste uno “zoccolo duro” dell'intera popolazione dell'area campione. L'area campione all'interno del Picciolo Golf Club Questa area campione presenta caratteristiche peculiari in quanto è all'interno del Parco dell'Etna ed è teatro di un attività sportiva. A differenza delle aree scelte in precedenti ricerche non si tratta né di zone naturali né di terreni ad uso agricolo. Di seguito sono mostrate le core areas rilevate 9 Core area nel mese di Febbraio. Core area nel mese di Marzo. 10 Core area nel mese di Aprile. Core area nel mese di Maggio/Giugno. 11 Core area nel mese di Luglio. Core area nel mese di Agosto. 12 Core area nel mese di Settembre/Ottobre. Core area nel mese di Novembre. 13 Core area principale da cui si originano le espansioni stagionali . 40 D en sità (ind. /ha ) 35 30 25 20 15 10 5 0 Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Sett Ott Nov Fig. 3. Dinamica mensile delle densità all'interno del “Picciolo Golf Club”. 14 mensilmente senza mostrare la griglia di riferimento ma solo le stazioni di rilevamento. Visionando la sequenza mensile delle densità sembra evidente che la popolazione si contrae ed espande durante i mesi partendo da est verso ovest. A riprova di ciò, nell'ultima immagine il modello matematico mostra quale sia la probabile zona a maggiore densità dell'intera area campione. Questi risultati potranno essere utilizzati come strumento per una gestione delle popolazioni di coniglio ed un eventuale azione di controllo potrà essere mirata nel territorio al fine di ottenere in migliori effetti. La fig. 3 mostra l'andamento mensile della popolazione di Coniglio selvatico all'interno dell'area campione del “Picciolo”. Come riscontrato nelle precedenti ricerche un andamento ciclico stagionale è ben evidente con un picco di densità nel mese di giugno. Questo risultato non aggiunge nulla alle attuali conoscenze sulla dinamica di popolazione di questa specie. Di maggiore interesse appare, invece, il confronto tra le dimensioni del territorio maggiormente occupato mensilmente e le densità relative misurate (Fig. 4). Non sussiste nessun rapporto diretto tra l'aumento della popolazione e l'estensione del territorio utilizzato. Considerando il solo dato di densità è stato ipotizzato come le popolazioni seguano un apparente ciclo di espansione e contrazione. Cicli segnati dalla mortalità infantile, dai predatori e dalle malattie. La mancanza di un rapporto diretto tra il numero di individui presenti contemporaneamente nel territorio e la loro localizzazione pone almeno tre quesiti: 1) il Coniglio tende ad occupare tutti gli habitat idonei disponibili? 2) la popolazione è frammentata nel territorio in base alla struttura ambientale? e 3) è possibile agire sulla popolazione in modo da ottenere un certo controllo numerico?. Rispondere a questi quesiti non è possibile utilizzando solo i dati di densità raccolti. Infatti, la proposta più concreta è stata formulata alla fine della ricerca nelle Riserve della Provincia di Ragusa dove era stata fatta un attenta analisi ambientale ed utilizzato il metodo dell'HSI (Habitat Suitability Index). In questa ricerca esiste un dato spaziale che può essere accostato a quello di densità. Mettendo in relazione i due dati nell'ordine mensile notiamo come l'espansione spaziale sia successiva a quella numerica (Fig. 5). Al picco di densità del mese di giugno segue l'occupazione massima del mese di luglio ma con un numero di effettivi decisamente ridotto. I mesi successivi sono speculari con un aumento delle densità ma una concentrazione degli individui in aree sempre più ristrette (Fig. 5). 15 Fig. 4. Confronto diretto tra l'ampiezza del territorio occupato dalla specie e le densità relative misurate in campo. Habitat utilizzato 40 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 Den sità (ind. /ha) 35 30 25 20 15 10 5 H abitat utilizz ato (ha) Densità 0.2 0 0 Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Sett Ott Nov Fig. 5. Confronto tra l'ampiezza del territorio occupato dalla specie e densità relative misurate in campo con cadenza mensile. 16 Tenendo presente l'ortofoto riguardante le “probabili aree di origine della popolazione” il picco di giugno è stato prodotto proprio in quest'area. Nel caso di questa area campionala zona in cui agire si riduce a questi 0.40 ha apparentemente cruciali per il resto degli individui presenti nel resto del campo da golf. Ovviamente queste osservazioni non tengono conto della presenza di altri conigli all'esterno dell'area considerata. Questo modello resta comunque un primo passo verso l'analisi degli effetti di un intervento mirato alla riduzione delle popolazioni in un area. L'area campione del Parco dell'Etna Al pari dell'area campione del Picciolo anche l'area Piano dei Grilli ha mostrato un andamento molto simile anche se le medie mensili di densità sono leggermente differenti. Comunque sia per il “Picciolo” che per le aree che sono ampiamente frammentate si pone una questione riguardante il reale interscambio di individui con l'area campione e le zone limitrofe esterne ad essa. Il problema è stato posto proprio dall'Assessorato Territorio ed Ambiente in merito alla messa in pratica delle proposte gestionali (prelievi) a seguito della ricerca nelle Riserve della Provincia di Ragusa. Ancora una volta la precedente metodologia ha messo in luce che il semplice dato numerico è insufficiente senza una adeguata conoscenza spaziale. Questa problematica risulta, inoltre, dilatata quando siamo di fronte ad aree eterogenee, utilizzate dall'uomo o frammentate. Cosa succede in aree più omogenee, meno frammentate e con ridotta attività umana? La nostra area campione sull'Etna (Piano dei Grilli) è un perfetto esempio di questa tipologia di territorio. Anche in questo caso, sebbene le distanze siano molto più estese, la popolazione mostra delle contrazioni spaziali seguite da espansioni (si vedano le figure precedenti). Le variazioni cicliche mensili sono presenti ma con assenza di picchi (fig. 6). Da notare, cosi come appurato durante la ricerca del 1999, che la crescita delle popolazioni inizia durante l'estate per poi protrarsi in autunno (fig. 6). In linea con quanto osservato, all'espansione numerica autunnale si nota un aumento della superficie utilizzata (fig. 7). Di fatto, i conigli del Parco dell'Etna si comportano come quelli delle altre aree. Eventuali differenze climatiche o ambientali possono avere degli effetti sul momento di crescita della popolazione a seguito delle nascite ma l'evento successivo è simile a prescindere dalle aree considerate. 17 Core area nel mese di Febbraio. Core area nel mese di Marzo. 18 Core area nel mese di Aprile. Core area nel mese di Maggio/Giugno. 19 Core area nel mese di Luglio. 40 D ensità (ind./ha) 35 30 25 20 15 10 5 0 Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Sett Ott Nov Fig. 6. Dinamica mensile delle densità all'interno dell'area “Piano dei Grilli” nel Parco dell'Etna. 20 Densità Habitat utilizzato 25 D en sità (ind. /ha) 35 20 30 25 15 20 10 15 10 5 H abitat utilizz ato (ha) 40 5 0 0 Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Sett Ott Nov Fig. 7. Confronto tra l'ampiezza del territorio occupato dalla specie e densità relative misurate in campo con cadenza mensile. Conclusioni Questa ricerca ha permesso di analizzare aspetti sulla dinamica delle popolazioni di Coniglio selvatico non ancora chiarite. Inoltre, ha utilizzato una nuova metodologia per ottenere un dato spaziale il più possibile realistico sulle contrazioni ed espansioni delle popolazioni di coniglio. Le principali conclusioni sono: 1) L'espansione territoriale segue in modo asincrono l'incremento numerico 2) Questa espansione avviene all'interno di aree limitate dove si nota l'incremento numerico 3) Dopo la massima espansione territoriale il nucleo principale di individui torna ad essere quello di origine In base queste considerazioni un' azione di controllo, ad esempio nell'area campione del Picciolo, dovrebbe essere concentrata nell'area “vocata”. Un prelievo in questa zona potrebbe avere effetti anche sulla successiva 21 espansione. Un prelievo mirato ridurrebbe i costi di effettuazione ed aumenterebbe le probabilità di ridurre i danni. Si auspica che questo modello possa essere messo in atto, inoltre sarebbe utile proseguire la ricerca partendo dalle stesse aree campione ma aumentandone la superficie in modo tale da identificare ulteriori “nuclei” di riproduttori in collegamento tra loro. 22 2. Caratterizzazione del gene del citocromo b nel coniglio selvatico (Oryctolagus cuniculus) in Sicilia Orientale Introduzione Il coniglio selvatico (Oryctolagus cuniculus) è l'unica specie esistente del genere Oryctolagus. Ritrovamenti fossili datano la sua comparsa nel tardo Miocene in un ristretto areale comprendente la Penisola Iberica e il sud della Francia. Durante il Medioevo, le attività umane hanno contribuito alla sua diffusione in numerose aree. Ad oggi la specie risulta diffusa più o meno in tutto il mondo. Studi su polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione, effettuati sull'intero mtDNA del coniglio hanno evidenziato l'esistenza di due ben distinte linee materne, una esclusiva del sud ovest della Spagna e l'altra presente nel resto d'Europa ed anche in esemplari domestici. In questo lavoro ci siamo occupati dell'analisi tramite sequenziamento, del gene mitocondriale del citocromo b, al fine di collocare filogeograficamete 23 gli esemplari del nostro studio relativo alla provincia di Catania, questo marcatore, utilizzato anche in altri studi, si è rivelato efficace anche in questo caso. Materiali e metodi Reperimento dei campioni Campioni di sangue o di tessuto sono stati raccolti da 4 aree della Sicilia orientale (N = 46; Fig. 1). Il sangue è stato prelevato da una vena marginale dell'orecchio in animali catturati con uso di reti e furetti. Campioni di tessuto (fegato) sono stati ottenuti da animali abbattuti durante l'attività venatoria. Il sangue è stato posto in provette contenenti K3 EDTA, il tessuto è stato posto in etanolo assoluto. Entrambe le tipologie di campioni sono state conservate a 20°C fino all'uso. Fig. 1. Rappresentazione delle aree di campionamento per l'analisi genetica. Dall'area 1 provengono n. 32 campioni, dalla 2 n. 4, dalla 3 n. 7 e dalla 4 n. 3. 24 Estrazione del DNA Il DNA è stato ottenuto dal fegato o dal sangue mediante digestione con proteinasi K, estrazione fenolo/cloroformio e precipitazione in etanolo, o m e d i a n t e l ' u s o d i c o l o n n i n e ( M B I O T E C H ) . Amplificazione E' stato amplificato un frammento di 1093 bp comprendente la maggior parte del gene del citocromo b. Sono stati utilizzati i primer: cytb1 (5'ctaattgaccttcctgctcc3') e cytb2(3'ccattcctggcttacaagac5'). La miscela di reazione conteneva GoPhorIT™ Taq DNA Polymerase (Mbiotech),200µM di dNTP's, 20µmol primers, 10x Buffer +MgCl (Mbiotech) 50ng di temprato, H2o fino a 50µl. La PCR (Polimerase Chain Reaction) è stata eseguita in un termociclatore AB 2720 (Applied Biosystems). Il disegno di PCR era il seguente: 94°C per 3 min. seguiti da 30 cicli di 92°C per 1 min, 64°C per 1 min., 72°C per 1 min, e l'estensione finale 72°C per 5 min. Il prodotto amplificato è stato caricato su un gel di Agarosio all'1% con presenza di Etidio Bromuro, che ha permesso la visualizzazione di una singola banda delle dimensioni previste (Fig.2). Fig. 2. Elettroforesi su gel di agarosio all'1% di alcuni dei prodotti di PCR da noi ottenuti. 25 Fig. 3. Esempio di sequenza ottenuta dall'analisi dei campioni. Sequenziamento E' stato effettuato il sequenziameto diretto dei prodotti di PCR, opportunamente purificati (Mbiotech Kit), tramite il metodo di Sanger in un apparato ABI 310 (applied Biosystems). Sono stati utilizzati entrambi i primer sopra descritti. Le sequenze sono state processate con i software Gen Scan e analizzate con Bio Edit (Fig. 3). Risultati Nella tabella delle pagine successive è mostrato l'allineamento della sequenza nucleotidica dell'aplotipo da noi descritto (query) con quelle presenti in banca dati (sono riportati i numeri di accesso), relative al gene del citocromo b del coniglio europeo. 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Analisi del risultato e discussione Branco, uno dei maggiori studiosi del coniglio europeo, che ha svolto studi sulle popolazione spagnole ed anche francesi, afferma che esistono due linee mitocondriali denominate A e B. la linea A é presente solo in Spagna e Portogallo, la linea B é invece diffusa nel resto d' Europa ed anche in animali d'allevamento. Fig. 4. Distribuzione geografica delle linee A e B nella penisola Iberica (The Genetical Society of Great Britain, Heredity, 85: 307317). Dalle analisi e comparazioni effettuate è emerso che gli animali da noi catturati in provincia di Catania, ed utilizzati in questo studio appartengono alla linea materna denominata di tipo B presente in tutta Europa. Questi dati confermano quindi quanto descritto da Branco et al. (Heredity 85: 307317). Infatti nella figura 5 si può evidenziare che dall'analisi aplotipica le due linee risultano notevolmente distanti l'una dall'altra e che l'aplotipo da noi descritto è riconducibile alla B. La figura 6 mostra in maggiore dettaglio la linea B. 35 Fig. 5. Il grafico mostra la distanza genetica tra le due linee mitocondriali A e B. la freccia rossa rappresenta l'aplotipo da noi descritto. 36 Fig. 6. Aplotipi relativi alla linea B. 37 La linea B raggruppa diversi aplotipi, quello da noi rilevato risulta come si può evincere dalla stessa figura pare essere uno nuovo. Fig. 7. Ulteriore rappresentazione grafica delle linee A e B. la freccia rossa indica l'aplotipo da noi descritto. Poiché i prelievi sono stati fatti su individui provenienti per lo più da una singola area non è possibile dire con certezza che sia l'unico aplotipo presente nella provincia di Catania. Ulteriori campionamenti in aree diverse sono auspicabili per permettere una visione più ampia della reale situazione in Sicilia Orientale. 38 Bibliografia A.A.V.V. 2001. Studio della stima della popolazione cunicola (conigli) e determinazione del carico faunistico sopportabile dagli ambienti protetti della R.N.S.B. “Macchia Foresta del Fiume Irminio” e R.N.O. “Pino d'Aleppo” finalizzato alla predisposizione di una bozza di piano di prelievo”. Relazione dattiloscritta. Dipartimento di Biologia Animale (Università di Catania) e Provincia Regionale di Ragusa. Allen, A. W. 1985 Habitat Suitability Index Models: Swamp Rabbit. U.S. Fish Wildlife Service Biol. Rep. 82 (10. 107) 20 pp. Branco, M., Ferrand, N., Monnerot, M. 2000 Phylogeography of the European rabbit (Oryctolagus cuniculus) in the Iberian Peninsula inferred from RFLP analysis of the cytochrome b gene. Heredity, 85: 307-317. Caruso, S., Siracusa, M.A. & Leonardi, G. 1999. Coniglio selvatico, Ghiandaia, Gazza negli agro-ecosistemi del Parco dell'Etna. Relazione dattiloscritta. Università di Catania ed Ente Parco dell'Etna, Nicolosi (Catania). Carvalho, J.C. & Gomes, P. 2003 Habitat Suitability Model for European Wild Rabbit (Oryctolagus cuniculus) with implication for restocking. Game and Wildlife Science 20: 287-301. Carvalho, J.C. & Gomes, P. 2004 Influences of herbaceous cover, shelter and land cover structure on wild rabbit abundance in NW Portugal. Acta Theriologica 49: 63-74. Eberhardt L. & Van Etten R. C., 1956 - Evaluation of the Pellet Group Count as a Deer Census Method. J. Wildl. Manage., 20: 70-74. Litvaitis, J., Titus, K. & Anderson, E.M. 1996 Measuring vertebrate use of terrestrial habitats and foods. In: Research and management techniques for wildlife and habitats. The Wildlife Society, MD, pp. 254-274. 39 Manel, S., Williams H.C. & Ormerod, S.J. 1999 Comparing discriminant analysis, neural networks and logistic regression for predicting species distributions: a case study with a Himalayan river bird. Ecol. Model. 120: 337347. Moreno S. & Villafuerte R., 1992 - Seguimiento de las poblciones de Conejo en le Parque Nactional de Donana. Estaction Biologica de Donana. Morrison, M.L., Marcot, B.G. & Mannan, R.W. 1998 Wildlife-Habitat relationships: Concepts and Applications. The University of Wisconsin Press, USA. Palomares, F. 2001 Vegetation structure and prey abundance requirements of the Iberian Lynx: implications for the design of reserves and corridors. J. Appl. Ecol. 38: 9-18. Taylor R.H. & Williams R.M., 1956 - The use of pellets counts for estimating the density of populations of wild rabbit, Oryctolagus cuniculus. New Zealand Journ. Scient. Techn., 38: 236-256. Villafuerte, R. 1994 Riesgo de predacion y estrategias defensivas del Conejo, Oryctolagus cuniculus, en el Parque Nacional de Donana. PhD Thesis, Universidad de Cordoba. 229 pp. Wood D. H., 1988 - Estimating rabbit density by counting dung pellets. Austr. Wildl. Res. 15: 665 671. 40 realizzazione a cura di: Via Gabriello Carnazza, 27 95129 Catania tel. 0349 36 95 541 fax 095 7110485 email: [email protected]