Malattie da espansione di repeats instabili
• fenomeno scoperto nel 1991 (FraX, SBMA)
• inizialmente noto come “espansione di triplette”
• poi tetra- penta-nucleotidi: “repeats instabili”
Caratteristica comune:
fenomeno dell’anticipazione
Effetto biologico:
1. perdita di funzione della proteina
2. guadagno di funzione (CAG)
3. effetto tossico dell’mRNA
Malattie da espansione di repeats instabili:
perdita della proteina
Sindrome dell’X fragile E: CCGs del 5’UTR con iper-metilazione
e silenziamento del gene. Proteina ricca in serine e proline,
possibile fattore trascrizionale
Atassia di Friedreich: GAAs nel primo introne con ridotta espressione
e inibizione dell’elongazione. Proteina “fratassina” possibile trasporto
del Ferro nei mitocondri con riduzione delle ferro-proteine.
Sindrome dell’ X fragile
ripetizioni CGG nel 5’UTR
38 kb in Xq27.3
5 - 44 CGG con AGG ogni 9-10 triplette
da 54 – 58 fino a 200 - 230
> 200
Sindrome dell’X fragile
Caratteristiche cliniche
ritardo mentale
- moderato nei maschi
- lieve nelle femmine
altri segni
- macrocefalia, faccia allungata
- oriecchie sborgenti e basse
- lassità articolare
- macro-orchidismo
Biologia molecolare
99% dei casi: CGG >200
1% dei casi: delezioni, mut puntiformi
Prevalenza
16-25 su 100.000 maschi
Sindrome dell’ X fragile
Sindrome dell’ X fragile
94/25
96/25
90
111/31
> 500
31
85/25
85
118
83
• Maschi e femmine possono
trasmettere la pre-mutazione
• Durante la meiosi materna
la pre-mutazione
può espandersi a
“mutazione”
74
tremori intensi
90 CGG
60
Sede ignota
tremori intensi
45
POF 36
28-86 CGG
13
ritardo mentale
26-600 CGG
Sindrome dell’ X fragile:
portatori di pre-mutazione (1:300)
Sindrome FXTAS (maschi)
-
progressiva atassia cerebellare e tremore intenzionale
perdita della memoria a breve termine, declino cognitivo
parkinsonismo, neuropatia periferica
disfunzione autonomica
debolezza muscolare dei cingoli (arti inf.)
Penetranza: 17% a 60 aa
47% a 80 aa
38% a 70 aa
75% oltre gli 80 aa
2.2% delle atassie dell’età adulta
4.4% delle atassie ad esordio > 50 aa
POF (femmine)
- menopausa < 40aa nel 21% circa delle portatrici
Mutazioni dominanti
effetto “tossico” dell’RNA messaggero
Gene FMR1
CGG: 54-200
- POF
- FXTAS
CGG > 200
- FMR
Sindrome dell’ X fragile:
Analisi in PCR
Amplificazione della regione 5’UTR del gene FMR1
Sindrome dell’ X fragile:
Analisi in PCR
Maschio normale
29 CGGs
Femmina pre-M
29-58 CGGs
Femmina affetta
28 CGGs
Femmina normale
22-28 CGGs
Femmina pre-M
29-68 CGGs
In caso di full-mutation, l’allele
espanso NON è amplificabile
Sindrome dell’ X fragile:
Analisi in Southern blotting
EcoRI
EagI
EcoRI
2.8 kb X attiva
5.2 kb X inattiva
EcoRI
EagI
EcoRI
Allele pre-mutato
> 2.8 kb X attiva
> 5.2 kb X inattiva
EcoRI
EagI
EcoRI
Allele mutato
>> 5.2 kb
Endonucleasi di restrizione
Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici
Blunt Ends = estremità prive di estensione
L’ ibridazione del DNA
DNA a singolo filamento
DNA a doppia elica
Singolo
filamento
complementare
denaturazione
(soluzioni saline e/o calore)
SONDA
marcatura
radioattiva o
fluorescente
Southern Blotting (DNA)
Trasferimento di acidi nucleici
su filtro , ibridizzazione e
auto-radiografia.
Diagnosi mediante Southern blotting
di delezioni genomiche
•
•
•
•
•
digestione del DNA genomico
separazione in gel di agarosio
trasferimento su nitrocellulosa
ibridazione con sonda di cDNA
analisi dei frammenti riconosciuti
dalla sonda
Conclusione:
• il gene testato (X linked) è assente
nel figlio maschio
• la madre ha solo una copia del
gene (l’intensità delle bande è
simile a quella della padre).
Diagnosi mediante Southern blotting
di delezioni genomiche.
Perdita di un sito di restrizione -> banda di giunzione
mut
WT
mut
(eterozigote)
Sindrome dell’ X fragile:
Analisi in Southern blotting
RITARDO MENTALE
• Ritardo mentale di varia entità colpisce il 3% della
popolazione (si definiscono con R.M. pazienti con Q.I.
inferiore a 70)
• le cause eziologiche sono identificate in meno del 50% dei
casi
• cause esogene sono responsabili dal 18,6% al 44% dei casi
di R.M.
• cause genetiche sono responsabili dal 17% al 47,1% dei
casi di R.M.
– FRAX-A, FRX-E, anomalie cromosomiche
• queste variazioni nelle percentuali possono essere dovute:
– al grado di R.M.
– al criterio di selezione dei pazienti esaminati
– alla definizione delle diagnosi
Delezioni sub-telomeriche
Malattie da espansione di repeats instabili:
guadagno di funzione
Inclusioni citoplasmatiche
, nucleari
o entrambe
.
Corea di Huntington
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
difetti di coordinazione motoria
movimenti involontari coreici (arti, faccia, tronco)
difficoltà nella programmazione delle attività
depressione, irritabilità e demenza
difficoltà nei movimenti volontari
disartria e disfagia
bradicinesia, rigidità e distonia
tentativi di suicidio (28%)
infezioni polmonari e urinarie, insufficienza cardiaca
atrofia del caudato e putamen alla TC o RMN
Esordio : 35-44 anni (raramente infantile-senile)
Decorso : 10-20 anni (progressivo)
Gene HD
4p16.3
67 esoni – mRNA di 13654 basi – 3141 aa (350kD)
Trascritto gene HD
5’ UTR
Esone 1
21 CAG (10-26)
Esone 2
Esone 3…..
L’età di insorgenza correla con l’entità
dell’espansione
Le triplette CAG si espandono preferibilmente alla meiosi paterna
Range Normale: 10-26 Intermedio: 27-35 Patologico: > 36
Proteina “Huntingtina”
• proteina espressa nei neuroni di diverse aree
del SNC (citoplasmatica e nucleare)
• perdita di funzione della proteina mutata ?
• tossicità della proteina mutata ?
–
–
–
–
proteolisi
rilascio di un frammento N-term con poli-Glu
formazione di aggregati citoplasmatici e nucleari
sequestro di altre proteine e fattori di trascrizione
• prococe difetto del trasporto assonale
• segnale pro-apoptotico e morte cellulare
Malattie da espansione di repeats instabili:
alterata funzione dell’RNA
….ed effetto biologico sconosciuto !
(1:8.000-10.000)
Il fenomeno dell’anticipazione
nella distrofia miotonica
Da una generazione all’altra l’età di insorgenza diminuisce e la
gravità della malattia aumenta
Distrofia Miotonica:
correlazione tra fenotipo e lunghezza
del CTG repeat
3’UTR
introne 1