Il conteggio e la identificazione
delle cellule ematiche
Malattie ematologiche attese nel
Salernitano
N.casi/anno
L.A. Mieloide
L.A. Linfoide
Altre
M.di Hodgkin
Linfomi non-H
Mieloma Multiplo
L.Linfatica Cronica
L.Mieloide Cronica
Totale
25
10
10
35
100
50
70
15
315
PROBABILITA’ DI CURA IN ONCOEMATOLOGIA
LEUCEMIE ACUTE
ANZIANI
10-20%
ADULTI
30-40%
GIOVANI
50%
LINFOMI NH
30-50%
L. DI HODGKIN
70-90%
MIELOMA MULTIPLO
BMT
20-30%
CT
3-4 anni
ABMT
x 2 o più
Speranza di guarigione
%Remissione % Guarigione
L.A. Mieloide
L.A. Linfoide
M.di Hodgkin
Linfomi non-H
Mieloma Multiplo
L.Linfatica Cronica
L.Mieloide Cronica
: bambini
adulti
70
90
80
95
70
70
90
95
40
70
30
85
50
0
0
TMO 60
IFN 15
Inibitori tirosinkinasi ?
L’obiettivo della terapia è sempre
la guarigione ?
Scelta del trattamento più adeguato vuol
dire fare un bilancio fra rischi e benefici
attesi.
I trattamenti intensivi aumentano le
possibilità di guarigione, ma:
– espongono a maggiori rischi
– peggiorano la qualità di vita
Quanto costa curarsi ?
Leucemia - chlorambucil
Linfatica - fludarabina
Cronica: - fluda+rituximab
6 mesi di terapia
Euro
72
- trapianto autologo
Leucemia - idrossiurea
Mieloide - interferone alfa
Cronica: - trapianto allogenico
- Glivec
8.622
36.294
40.000
3 anni di terapia
Euro 600
60.000
60.000
101.304
DIAGNOSTICA DELLE PATOLOGIE
ONCOEMATOLOGICHE
MORFOLOGIA
CITOFLUORIMETRIA
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECOLARE
BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE
VALUTAZIONE MASSE (ecografia,
tac….)
Antonj van Leeuwenhoek nel 1674 trasmise in una
lettera alla Royal Society di Londra la prima descrizione
dei globuli rossi
Ma molto probabilmente Marcello Malpighi, di
Bologna, fu il primo ad osservare i Globuli Rossi
nel 1661 nel lume dei capillari di uomo e animale.
Egli li descrisse come “globuli rubescenti” e li localizzò
nelle arterie e nelle vene che aveva appena scoperto.
Nel 1877, con la scoperta della colorazione triacida
comincia l’era della MORFOLOGIA EMATOLOGICA
Giulio Bizzozero
1846 - 1901
Nel Dicembre 1881 comunicò all'Accademia di Medicina la
sua grande scoperta: le piastrine come terzo componente
morfologico del sangue e la loro importanza nel processo della
trombosi.
Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi
del secolo scorso
Per ematocrito si intende il volume compresso (PCV:packed cell
volume) occupato dai globuli rossi rispetto al volume totale di sangue
Si esprime in percentuale (Ht %).
È evidente che il valore dell’Ematocrito è funzione del numero e del
volume dei Globuli Rossi
Hct = MCV x n. GBR
Nel 1930, Maxwell
Wintrobe
standardizza la
procedura per
l’esecuzione
dell’EMATOCRITO
Indici di Wintrobe
MCV
Hct / n. GBR
Normocitica
MCHC 34 g/L
normocromica
MCH 29 pg
MCHC
Hb / Hct (GBR x MCV)
Macrocitica
MCHC 30 g/L
Ipocromica
MCH 29 pg
MCH
Hb / n. dei GBR in milioni
Microcitica
MCHC 38 g/L
Ipercromica
MCH 29 pg
La variazione d’Impedenza
Principio di Coulter (1956)
Elettrodo interno
U
Vuoto regolato
Elettrodo
esterno
Temps
Conta del numero di
particelle nell’unità di
tempo
Flusso del diluente
Volume delle particelle
Calcolo automatico
del Hct e degli Indici di
Wintrobe
Metodo Ottico
La misura ottica associa la citometria a
flusso e la diffrazione luminosa.
Si basa sulla rilevazione dei cambiamenti
e sulla deviazione che un fascio di luce
subisce quando colpisce una particella
Metodo ottico : due parametri di
riconoscimento per il globulo rosso :
Raccolta del segnale a
definiti intervalli angolari
Low angle scatter 2o - 3o
High angle scatter 5o - 15o (HGB
(Volume)
concentration)
Tutto ciò rappresentò la prima rivoluzione della
ematologia di laboratorio.
Quindi, negli anni ’60 si cominciarono a
costruire strumenti che fornivano in tempi
brevi misurazioni precise, riproducibili ed
accurate.
Da 10-20 test al giorno
a centinaia di test al giorno
Correzione della coincidenza
• Occasionalmente 2 o 3 cellule possono
passare attraverso l’orificio di conta nello
stesso tempo
U
• Viene quindi generato un impulso di grande
ampiezza
Temps
• La frequenza di questo passaggio in
coincidenza è statisticamente prevedibile ed è
funzione del numero delle cellule. La
correzione viene quindi realizzata
automaticamente per gli analizzatori che usano
questa tecnologia.
Focalizzazione Idrodinamica
Flusso
di
guaina
Flusso del campione
Flusso
di
guaina
Flusso del
campione
Flusso
di
guaina
Per ottenere degli impulsi coerenti, viene utilizzato un principio
complementare: la focalizzazione idrodinamica.
Le cellule sono messe in fila le une dietro le altre e spinte verso la
zona di conta.
CURVA DI DISTRIBUZIONE DEL VOLUME
ERITROCITARIO
La formula leucocitaria
I motivi che hanno portato al tentativo di
automatizzare la formula leucocitaria sono:
• Alto costo
• Problemi organizzativi
• Utilità diagnostica dubbia
• Scarsa precisione
• errori statistici
TIPO
CELLULARE
100c
500c
1.000c
10.000c
BASOFILI
0-5.4*
0.3-2.3*
0.5-1.8*
0.8-1.3*
EOSINOFILI
1.1-9.9*
2.5-6.1*
2.9-5.4*
3.6-4.5
MONOCITI
4.2-16.4*
6.6-11.9*
7.3-10.9
8.4-9.6
LINFOCITI
35-55.3*
40.6-49.5
41.9-48.1
44.0-46.0
49.7-69.7*
55.6-64.3
56.9-63.1
59.0-61.0
NEUTROFILI
HOUWEN B.
Laboratory Hematology 7:89-100
Formula leucocitaria basata sul volume cellulare (3 popolazioni)
30
100
200
300
400
fL
Volume / Citochimica (perossidasi) / Citolisi
(SIEMENS)
Densità Nucleare
Attività perossidasica
V
O
L
U
M
E
Mn
Pmn
Volume / Conduttività / Scatter (Coulter)
V
o
l
u
m
e
conduttività
Diffrazione : Superficie; granulazioni
Impedenza
Conduttività
Scatter
Volume / Citochimica / Citolisi (ABX Pentra)
A
S
S
O
R
B
A
N
Z
A
VOLUME
VOLUME
Diffrazione luminosa a 3 diversi angoli (Abbott-Cell-Dyn)
90°Pol/ 90°dep
Granulazioni
10° Struttura
Fascio laser
P
o
l
a
r
i
z
z
a
z
i
o
n
e
1°/3° (0°) dimensione
1°/3° (0°) dimensione
10° Struttura
Scatter / Fluorescenza / Citolisi / Dimensioni (Dasit-Sysmex)
1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Precisione: si esprime come Coefficiente di Variazione
È la capacità di un metodo di ripetere un valore costante
CV per il metodo manuale:
Neutrofili e Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
tra 5 e 10%
25%
40%
95%
CV per i metodi automatici:
Neutrofili e Linfociti
Monociti
Eosinofili
Basofili
< 4%
< 10%
< 10%
< 50%
1) Conta e classificazione dei leucociti normali
Accuratezza: è la corrispondenza al vero di una misurazione
Il vero in ematologia è rappresentato dal metodo di riferimento che per
la conta differenziale dei leucociti consiste al momento attuale nella
conta microscopica effettuata:
• in condizioni standardizzate
• da operatori qualificati
• su un numero sufficiente di leucociti (400).
L’accuratezza degli strumenti analitici più evoluti è
• molto elevata per Neutrofili, Linfociti ed Eosinofili
• meno buona per Monociti (dipendente dalla tecnologia analitica)
• poco accurata per i Basofili (difficilmente valutabile per la bassa
frequenza di questa classe di leucociti).
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le cellule atipiche ed immature
Sensibilità: capacità di riconoscere i campioni contenenti cellule anomale
Specificità: capacità di non segnalare i campioni normali
Valore predittivo positivo: indica la probabilità che un risultato positivo
segnali realmente la presenza di cellule anomale;
Valore predittivo negativo: indica la probabilità che un risultato negativo
sia indice affidabile della assenza di anomalie.
WBC
Campione emolizzato
WBC
PLT
Aggregati piastrinici
T° < 37°C
a 37°C
PLT
Presenza di crioglobuline
GBR
2.400.000
HCT
24.3
Hb
13.0
MCV 101.5
MCH
54.1
MCHC 53.0
CHCM normale
Presenza di crioagglutinine
Neonati
Iperazotemia
Iperbilirubinemia
Hb patologiche
Pseudoleucocitosi da mancata lisi dei globuli rossi
Gli strumenti ematologici non fanno diagnosi e
non sono in grado di contare e classificare in
modo accurato le cellule patologiche.
Essi devono:
1) Contare e classificare in modo preciso ed
accurato le 5 classi di leucociti normali
2) Segnalare in modo sensibile ed accurato le
cellule atipiche ed immature
Lo striscio di sangue periferico
Lo striscio di sangue periferico
che ci vuole?
niente!....
La quantità di sangue da strisciare è, entro certi limiti,
variabile in funzione delle caratteristiche del
campione e di quello che si vuole cercare
Dopo aver appoggiato il vetrino il sangue si estende
lungo (quasi) tutta la superficie di contatto
Difficile fare di peggio…
Troppe curve
Troppo lungo
Troppo corto e sottile
Troppo corto e spesso
Troppo corto
COLORAZIONE
I preparati per la colorazione variano spesso da lotto a lotto insieme a
qualità dell’acqua, temperatura ed umidità dell’aria
I segreti:
1) Asciugare bene
2) Coprire bene
3) Sciacquare bene
• errori metodologici
MONOCITI ++
I
D
E
A
L
E
CORPO
GRANULOCITI ++
Area densa
T
E
S
T
A
LINFOCITI ++
Zona marginale
Area sottile
B. Bain NEJM 2005
Nuovi parametri ematologici
FUNZIONI DI UN NUOVO PARAMETRO
Migliorare la capacità del laboratorio nel
fornire dati accurati
Indirizzare il laboratorista o il clinico verso
un sospetto di patologia
Fornire uno strumento di monitoraggio di un
percorso clinico-terapeutico
Aprire nuove frontiere diagnostiche
Un nuovo parametro nasce dalla ricerca industriale
La ricerca industriale ha una indiscutibile (ed
accettabile) motivazione economica
Raramente un nuovo parametro nasce da
una richiesta clinica
Il primo target della ricerca industriale è il
laboratorista
Il passaggio al campo clinico non ha alcun
percorso strutturato e consolidato
OSTACOLI NELLA VITA DI UN NUOVO PARAMETRO
Analizzatore dipendenza
Scarso impatto della cultura di laboratorio
Difficoltà del laboratorista a comprendere il reale potenziale
clinico
Scarsa pubblicizzazione in campo clinico
Sviluppo della ricerca
industria
laboratorio
clinica
nuovi
parametri
nuovi farmaci
“clinici” - laboratoristici
sperimentazione
preclinica e clinica
sperimentazione
esportazione
Paziente
Parametri emocitometrici “tradizionali”
Operatore
Analizzatore
“Nuovi” parametri ematologici
Operatore
Analizzatore
L’allarme strumentale
non è un parametro
comunicare un allarme
strumentale vuol dire
comunicare incapacita’ a
definire la presenza o meno
di quanto suggerito dallo
strumento
CITOGRAMMA ERITROCITARIO DI VOLUME E
CONCENTRAZIONE DI EMOGLOBINA
macrocitosi
ipocromia
ipercromia
microcitosi
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA
NOCERA INFERIORE ASL SALERNO 1
V
O
L
U
M
E
Densità (concentrazione Hb)
Caratteristiche degli eritrociti fra microscopia
e automazione
MICROSCOPIA
AUTOMAZIONE
Anisocitosi
Alterazioni morfologiche
Microcitosi – Macrocitosi
Ipocromia – Ipercromia
Poichilocitosi
Inclusi eritrocitari
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA
INFERIORE ASL SALERNO 1
Acantocito
= aculeo
Codocito
= campana
cellula a bersaglio
Dacriocito
= lacrima
Drepanocito = falce
Ellissocito
= ovale
Cheratocito
= corno
Cnizocito
= fossetta
Megalocito
= gigante
Schizocito
= taglio
Stomatocito = bocca
Sferocito
= sfera
emazie a fungo
DIAGNOSTICA EMATOLOGICA NOCERA
INFERIORE ASL SALERNO 1
RDW
Parametro sintetico (o riduttivo?): è una rappresentazione numerica
della ampiezza di una curva di distribuzione volumetrica
Manca di standardizzazione metodologica, pur avendo una univocità
terminologica rara nei nuovi parametri strumentali
Ha trovato posto in molte pubblicazioni cliniche, con scarso
approfondimento fisiopatologico
normale
elevato
Am J Clin Pathol. 1983 Sep;80(3):322-6.
Improved classification of anemias by MCV and RDW.
Bessman JD, Gilmer PR Jr, Gardner FH
Arch Intern Med. 1988 Apr;148(4):822-4.
Erythrocyte anisocytosis. Visual inspection of blood films vs automated
analysis of red blood cell distribution width.
Simel DL, DeLong ER, Feussner JR, Weinberg JB, Crawford J.
Health Services Research Field Program, Durham Veterans
Administration Medical Center, NC 27705
RDW E CELIACHIA
Increased Red Cell Distribution Width and coeliac disease
Brusco G. et al
Dig. Liver Dis. 2000
RDW: new screening test for coeliac disease?
Guglielmi V. et al
L’incremento di RDW risulta la
ematologica (57.9 - 67%) in adulti CD
più
Minerva Med 2002
frequente
anormalità
L’incremento di RDW può essere considerato predittivo di CD ed
autorizzare alla ricerca di anticorpi specifici
L’RDW elevato è più frequente dell’anemia sideropenica nei
pazienti CD
L’RDW diviene normale dopo dieta priva di glutine
RDW E PATOLOGIE CARDIOLOGICHE
Exp Clin Cardiol. 2010 Fall;15(3):37-40.
High red blood cell distribution width is closely associated with risk of
carotid artery atherosclerosis in patients with hypertension.
Wen Y.
Am J Cardiol. 2010 Oct 1;106(7):988-93. Epub 2010 Aug 11.
Red cell distribution width and risk of coronary heart disease events.
Zalawadiya SK, Veeranna V, Niraj A, Pradhan J, Afonso L.
Department of Internal Medicine, Wayne State University Detroit Medical Center,
Detroit, Michigan, USA.
In conclusion, a higher RDW appears to be a powerful independent
predictor of future CHD risk.
Arch Intern Med. 2009 Mar 9;169(5):515-23.
Red blood cell distribution width and the risk of death in middle-aged
and older adults.
Patel KV, Ferrucci L, Ershler WB, Longo DL, Guralnik JM.
Laboratory of Epidemiology, Demography, and Biometry, National Institute on
Aging, 7201 Wisconsin Ave, Ste 3C309, Bethesda, MD 20814, USA
CONCLUSION: Red blood cell distribution width is a widely available
test that is a strong predictor of mortality in the general population of
adults 45 years or older
RDW
Reticolociti
È una piccola porzione dei Globuli Rossi circolanti che contiene
residui di organuli citoplasmatici (soprattutto di derivazione
ribosomiale).
Questi precipitano, per effetto dei coloranti sopravitali, formando
un reticolo di granuli e filamenti basofili che è alla base della loro
denominazione.
Definizione morfologica
Per NCCLS e ICSH i reticolociti sono Globuli Rossi che
contengono 2 o più particelle (o anche una particella legata ad un
filamento) di materiale che ha assunto un tinta blu dopo
colorazione con un colorante sopravitale e che corrisponde a
particelle di RNA ribosomiale.
Reticolociti e Corpi di Heinz
Contengono RNA
(colorazioni sopravitali con
blu di metilene o blu di
Cresile)
sono più grandi dei
globuli rossi
MCVr > MCVgbr
possono avere un diverso
contenuto di RNA (cioè un
diverso contenuto di granuli e
filamenti) e un diverso volume in
rapporto al loro grado di
maturazione
D’Onofro e Zini
“Morfologia del Sangue”
Sui preparati fissati e colorati con tecniche panottiche (ad es. M-G-G) i
reticolociti non si distinguono dai GBR maturi (anche se le loro
dimensioni sono maggiori e possono avere un contorno policiclico).
Quando la sostanza filamentosa è abbondante, possono assumere
l’aspetto di emazie policromatofile, con sfumature di colore bluastro
Anche la punteggiatura basofila è un aspetto dei residui di RNA
ribosomiale che precipitano dopo fissazione in condizione di
eritropoiesi anomala.
Reticolociti nel
Sangue Periferico
Reticolociti
Midollari
Eritroblasti
Ortocromatici
Tempo di
Permanenza
2-3 giorni
Barriera
EMATO- MIDOLLARE
Tempo di
permanenza
1-1.5 giorni
La determinazione dei Reticolociti permette una valutazione della
eritropoiesi senza il ricorso a manovre invasive
CONTEGGIO DEI RETICOLOCITI
Dacie & Lewis
MANUALE DI TECNICA EMATOLOGICA 1986
.…strisci non troppo sottili, ma non con cellule
sovrapposte….
....oculare con diaframma regolabile o diaframma
di cartone con foro rettangolare di circa 4mm…
….fattori importanti sono l’acutezza visiva, la
pazienza del tecnico, la qualità ed il potere
risolvente del microscopio….
….nel caso che ci siano pochi reticolociti, è
necessario contare un numero elevatissimo di
cellule….
Metodi manuali-visuali
I coloranti hanno la capacità di indurre l’aggregazione e la
precipitazione dei ribosomi, in modo da renderli visibili sullo sfondo
chiaro del citoplasma.
I coloranti oggi in uso sono:
• Il blu brillante di cresile (della famiglia delle oxazine)
• il nuovo blu di metilene (metodo di riferimento)
• l’Azur B
Metodi citofluorimetrici
RBC
Reticolociti
Usano coloranti fluorescenti che sono eccitati ad
una data lunghezza d’onda ed emettono ad una
lunghezza d’onda maggiore
PLT
Auramina-O
Inizialmente venivano usati citofluorimetri non
dedicati, sostituiti poi da emocitometri dedicati
I parametri misurati sono:
• l’intensità della diffusione luminosa frontale
(FSC) proporzionale alle dimensioni cellulari;
• l’intensità della fluorescenza proporzionale al
contenuto di RNA.
Arancio di Tiazolo
Viene costruito così un citogramma
bidimensionale sul quale vengono
visualizzate:
• le soglie automatiche che separano i
reticolociti dai globuli rossi non colorati e
dalle piastrine
• le soglie che suddividono la popolazione
reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con
intensità di fluorescenza crescente in
rapporto con la maturazione.
Vantaggi
• notevole diminuzione dei CV rispetto alle metodiche manuali
• obiettività più elevata
• velocità di esecuzione
Svantaggi
• la mancanza di calibratori stabili e affidabili
• la mancanza di materiale di riferimento
• autofluorescenza dei Globuli Rossi (assenza di un “zero”)
• Interferenze
Leucocitosi specie
Linfocitosi della LLC
Aggregati piastrinici e
macrotrombociti
Heinz
Jolly
plasmodi
Medodi ottici (coloranti sopravitali)
Fanno uso di coloranti sopravitali con
metodiche conosciute da tempo e modificate
per essere applicate a cellule in sospensione
La presenza di RNA nei reticolociti viene
individuata mediante misurazione
dell’assorbimento luminoso
Oxazina 750
Viene costruito così un citogramma
bidimensionale sul quale vengono visualizzate:
• le soglie automatiche che separano i reticolociti
dai globuli rossi non colorati e dalle piastrine
Nuovo blu di metilene
• le soglie che suddividono la popolazione
reticolocitaria in 3 sottopopolazioni con intensità
di assorbimento crescente in rapporto con la
maturazione.
Lo studio dei reticolociti in automazione
fornisce 3 tipi di informazioni:
1)Valori numerici (% e assoluti)
2)Indici di maturazione (LFR, MFR, HFR e IRF)
3)Indici qualitativi
a) prevalentemente volumetrici
(MCVr, MRV,…)
b) prevalentemente indicanti il contenuto di
emoglobina
(CHr, Ret He,…)
citogenetica
LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA,
CROMOSOMA PHILADELPHIA POSITIVA (Bcr/Abl)
Traslocazioni cromosomiche
• Per traslocazione si intende il trasferimento di DNA da un
cromosoma all’altro
• Le traslocazioni sono frequenti in oncoematologia
(Altre anomalie cromosomiche sono rappresentate dalle
delezioni, dalle inversioni e dalle inserzioni)
• Nella traslocazione un gene si giustappone ad un altro
gene presente su un altro cromosoma e ciò può
comportare conseguenze: se il gene trasferito è un
oncogene non trascritto (protoncogene) e si giustappone
ad un gene normalmente e attivamente trascritto, può
risultare la trascrizione del protoncogene o di un ibrido
• Questa è la situazione in molte delle traslocazioni
descritte fino ad oggi
Traslocazioni cromosomiche
• Deregolazione dell’espressione genica:
overespressione o espressione aberrante in un
tessuto che normalmente non esprime quel gene
• Espressione di una proteina di fusione:
giustapposizione di sequenze geniche codificanti di
due geni localizzati su differenti cromosomi
Specificità delle traslocazioni
Alcune traslocazioni sono specifiche di una
malattia, si trovano nella gran maggioranza
dei casi e non si trovano nella popolazione
normale: esempio tipico la t(15;17) della APL
Altre traslocazioni sono molto frequenti in
particolari patologie come la t(14;18) nel
linfoma follicolare, ma è presente anche in
altri NHL e nei soggetti normali, sebbene il
numero di copie sia molto basso
Traslocazioni cromosomiche
I geni coinvolti sono per lo piu’ fattori di
trascrizione, ma anche tirosin o serin
protein chinasi, recettori di membrana
cellulare, fattori di crescita, con ruoli
critici nella differenziazione e sviluppo
cellulare
9
9q+
Ph
22q-
22
Traslocazione
BCR
ABL
BCR
-ABL
ABLBCR
Gene di fusione BCR/ABL
Il gene che si forma sul cromosoma Ph1 non esiste
nelle cellule normali
Origina dalla fusione di un oncogene cellulare (ABL) normalmente situato
nelle braccia lunghe del cromosoma 9, con sequenze geniche normalmente
situate in una regione precisa del cromosoma 22 detta “breakpoint cluster
region” (BCR) perché è in essa che avvengono con maggiore frequenza le
rotture del cromosoma.
Il gene di fusione BCR/ABL è specifico di queste cellule neoplastiche e ne
costituisce il principale marker biologico e diagnostico
Le prove che la malattia leucemica Ph1+ nasce da una cellula staminale
totipotente stanno nella dimostrazione che l’alterazione cromosomica Ph1 e
genica (BCR/ABL) si ritrovano contemporaneamente nelle cellule di tutte le
linee ( granulomonocitica, eritrocitica, piastrinica e linfocitica B)
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE (FAB M2)
Nelle leucemie acute mieloblastiche,
la traslocazione t(8;21) induce il
riarrangiamento AML1-ETO e la
formazione di una proteina ibrida.
Leucemia M3 APL O PROMIELOCITICA
t(15;17)(q22;q21)
La traslocazione t(15;17) coinvolge
il gene che codifica per il recettore alfa
dell'acido retinoico (RAR) sul
cromosoma 17, ed il gene PML
(promielocitica) sul cromosoma 15.
LAM M4
LEUCEMIA ACUTA
MIELOMONOCITICA
Con eosinofili
Inversione (16)
gene di fusione CBFβ-MYH11
Inv(16)(p13q22)
LIMITI DELLA CITOGENETICA
CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA
Il successso della citogenetica
convenzionale in oncoematologia è
strettamente correlato alla quantità e alla
qualità delle metafasi che si ottengono dal
campione da analizzare
LA FISH IN ONCO-EMATOLOGIA
- Definisce l’origine e la natura di cromosomi marcatori e di
-
-
-
cariotipi complessi
Identifica delezioni e amplificazioni di geni o di loci
polimorfici
Permette di stabilire quale filiera cellulare o quali filiere
cellulari sono coinvolte in un determinato disordine
oncoematologico se impiegata insieme all’immunofenotipo
Valuta la risposta ad una terapia evidenziando un’eventuale
Malattia Minima Residua
Definisce la chimera dopo trapianto allogenico di midollo
osseo da donatore di sesso diverso
FISH
(Fluorescent in Situ Hybridization)
- Applicabile a nuclei in interfase e su metafasi
- Elevata specificità, sensibilità e rapidità
- Dimostra anomalie cromosomiche non analizzabili
con le comuni tecniche di bandeggio
- Permette di analizzare un elevato numero di
nuclei in tempi brevi
ANOMALIE CROMOSOMICHE NELLA LEUCEMIA
LINFATICA CRONICA
Aberrazioni
cromosomiche
Frequenza (%)
Trisomia 12
Citogenetica
10-15
FISH
15
13q14
10
53
11q21
8
19
6q
6
9
17p
4
8
MALATTIA MINIMA RESIDUA:
DEFINIZIONE
Quota residua di cellule neoplastiche
non eradicate dalla terapia di
induzione della remissione o dalle
successive misure terapeutiche.
Tali elementi neoplastici sono spesso
in grado di espandersi e dare origine
alla recidiva.
Metodi per lo studio della MRD
Metodo
•Morfologia
•Immuno
Fenotipizzazione
•Citogenetica
•FISH
• PCR
Caratteristiche
bassa sensibilità e
specificità
scarsa specificità
Sensibilità
5%
lento, richiede
preparazione metafasi
lento, applicabile ai nuclei in
Iinterfase
conoscenza delle sequenze
falsi positivi
1-5%
1%
0.3-5%
>0.001%