Argomenti di Patologia Clinica
Introduzione agli esami
Immunologici
Laboratorio ed immunologia
Reazione Ag-Ab

Concetto chiaveserratura
– Porzione Fab
– Regioni ipervariabili


Legami non covalenti
multipli
Reversibilità del
legame
Affinità



Forza della reazione fra
un singolo
determinante
antigenico e un singolo
sito di legeme
sull’anticorpo
Somma di forze di
attrazione e di
repulsione
Rappresenta una
costante di equilibrio
Avidità


Misura la forza di
legame totale di un
Ag con molti
determinanti
antigenici con gli Ab
> della somma
delle singole affinità
Specificità e cross
reattività

Specificità
– Capacità di un singolo Ab di
legarsi con un solo
determinante antigenico o di
una popolazione di Ab di
legarsi con un solo Ag.

Cross reattività
– Capacità di un singolo Ab di
legarsi a più di un
determinante antigenico o di
una popolazione di Ab di
reagire con più antigeni
– Cause:


Epitopi in comune
Epitopi strutturalmente
simili (multispecificità).
Capacità di
riconoscimento di un Ab



Struttura primaria
Isomeri di un Ag
Struttura secondaria e terziaria
Test per la determinazione
della reazione Ag-Ab
Tipi di test anticorpali

Ag particolato  agglutinazione
– Valutazione gruppi sanguigni
Agglutinazione/emoagglutinazione


IgM: agglutinine migliori
(polivalenti)
Test qualitativo
– Valuta la presenza di un
Ag o di un Ab
Agglutinazione/emoagglutinazione

Test semi-quantitativo
– Diluizioni seriate del siero
– Quantità note di GR o
batteri
– Titolo:

reciproco della massima
diluizione a cui si ha
agglutinazione
– Effetto prozona:

Mancanza di agglutinazione
ad alte concentrazioni 
eccesso di Ab
Emoagglutinazione passiva


Basato sul legame
degli eritrociti con
Ag solubili =
“coattazione”
Usi:
– Rilevazione di Ab
contro Ag virali
Coombs diretto


Legame AbEritrociti mancata
agglutinazione = AB
INCOMPLETI
Aggiunta Ab anti FC
 agglutinazione
Coombs indiretto

Usi: determinazione
di ab anti Rh
Inibizione
dell’emoagglutinazione





Determinazione di Ag
solubili
Quantità nota di Ab e
di Ag “coattati”
Quantità ignota di Ag
solubile
Basato sul principio
della competizione
anticorpale
Possibile
determinazione del
titolo (diluizioni seriate)
Tipi di test anticorpali

Ag particolato  agglutinazione
– Valutazione gruppi sanguigni

Ag solubile  precipitazione di
complessi Ag/Ab
– Immunoprecipitazione
Immunodiffusione radiale




Ab incorporato in un gel
di agarosio
Diluizioni differenti di Ag
aggiunte in pozzetti 
diffusione 
precipitazione al punto di
equivalenza
 anelli proporzionale al
logarismo della
concentrazione di Ag
Possibile realizzazione di
una curva standard 
test quantitativo
Immunoelettroforesi




Miscela complessa di
Ag  elettroforesi su
agar  Diffusione Ab
 linee di
precipitazione (zona di
equivalenza)
Misura qualitativa
Possibile stima
quantitativa (spessore
delle bande di
precipitazione)
Analisi delle
componenti seriche
Immunoelettroforesi
Elettroforesi controcorrente




Ag ed Ab in pozzetti in
un gel di agarosio 
elettroforesi  linea di
precipitazione
Occorre che l’Ag e l’Ab
possiedano cariche
opposte
Test qualitativo
Rapido
Tipi di test anticorpali

Ag particolato  agglutinazione
– Valutazione gruppi sanguigni

Ag solubile  precipitazione di complessi
Ag/Ab
– Immunoprecipitazione


RIA ed ELISA
Ag fisso  legame con Ab marcati
– Immunoflurescenza
– Immunoistochimica
Test RIA ed ELISA

Radioimmunoassays (RIA):
– Misurano la radioattività associata agli
immunocomplessi
– Il marcatore radioattivo può essere associato
all’Ab o all’Ag

Enzyme Linked Immunosorbent assay
(ELISA)
– Valutano quantitativamente una reazione
enzimatica associata ad immunocomplessi
– L’enzima può essere associato all’Ab o all’Ag
ELISA e RIA di tipo competitivo


Quantità standard
di Ag non marcato
 Curva di
riferimento 
determinazione Ag
in un campione
sconosciuto
Test quantitativo
usato per proteine
sieriche, ormoni,
farmaci, …
ELISA e RIA di tipo competitivo:
problematiche

Separazione degli
immunocomplessi dagli Ag e
dagli Ab liberi:
1.
2.
3.
Precipitazione con solfato
d’ammonio 33-50% (Tecnica di
Farr)  precipita Ig ma non gli
Ag  separa ICs dagli Ag
liberi
Ab anti FC  precipitazione
degli ICs
Immobilizzazione degli Ab su
plastica (RIA ed ELISA in fase
solida) eliminazione Ag non
legati mediante lavaggio
RIA/ELISA non competitivi




Si “coatta” l’Ag con su una
superficie plastica
Determinazione di Ab in
campioni sconosciuti
Si usa in Ab secondario
marcato
Esempi
– Determinazione autoanticorpi
specifici
– Determinazione Ige rivolte
verso Ag specifici (RAST)
reagent. It is called the RAST
test (radioallergosorbent test).
RIA/ELISA metodica sandwich



Ab primario “coattato”
su una superficie
solida
Ag a concentrazione
non nota
Ab secondario
marcato che si lega in
quantità proporzionale
alla quantità di Ag
ELISA: metodologia
ELISA: metodologia
ELISA: metodologia
ELISA
Enzime Linked Immunosorbent Assay

Ha sostituito i metodi di indagine che
impiegano sostanze radioattive (RIA):
– più sicuro
– economico
– sensibile
Western immunoblotting
ANODO (+)
BLOTTAGGIO
CATODO (-)
SPUGNA
CARTA ASSORBENTE
MEMBRANA DI
NITROCELLULOSA
GEL DI
POLIACRILAMIDE
Western immunoblotting
ANTICORPO PRIMARIO
ANTICORPO
SECONDARIO
PEROSSIDASI
Tipi di test anticorpali

Ag particolato  agglutinazione
– Valutazione gruppi sanguigni

Ag solubile  precipitazione di complessi
Ag/Ab
– Immunoprecipitazione


RIA ed ELISA
Ag fisso  legame con Ab marcati
– Immunoflurescenza
– Immunoistochimica
Immunofluorescenza


Immunofluorescenza
diretta
Immunofluorescenza
indiretta
Citofluorimetria