Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto di Chimica Biomolecolare – Valverde CT Giuseppe Ruberto La ricerca multidisciplinare a sostegno della filiera delle piante officinali DIVERSITA’ BIOMOLECOLARE DI PIANTE OFFICINALI SICILIANE Aspetto salutistico delle Piante Officinali e loro utilizzo in naturopatia Catania, 24 Novembre 2008, Le Ciminiere, V.le Africa, Piazzale Asia LA CHIMICA DEI PRODOTTI NATURALI La chimica dei prodotti naturali è probabilmente la più vecchia branca della chimica organica. Il suo sviluppo si deve alla curiosità verso l’attività biologica manifestata da questi composti, l’ampia diffusione delle medicine popolari, il loro aroma, etc., che inizialmente ha indotto al loro isolamento e determinazione strutturale, e successivamente alla loro sintesi e allo studio dei meccanismi biosintetici che li producono. Con il rapido sviluppo, in questi ultimi decenni, delle tecniche di isolamento, della cromatografia e della spettroscopia, la determinazione della struttura, in molti casi, è divenuta quasi una metodologia routinaria, anche se rimane il primo ed essenziale passo per qualsiasi ulteriore sviluppo. Dopo un iniziale periodo in cui l’isolamento è stato principalmente casuale, oggi si persegue sempre più un isolamento guidato dall’attività biologica, e dato che la maggior parte delle sostanze naturali esercita qualche tipo di bioattività, l’interesse oggi è rivolto verso le origini di tale bioattività e sulle interazioni che intercorrono fra i prodotti naturali e i siti recettoriali. COSA SONO I PRODOTTI NATURALI Metabolismo Primario •carboidrati •lipidi FUNZIONI NUTRIZIONALI •proteine •acidi nucleici •coenzimi Metabolismo Secondario •alcaloidi •antrachinoni •flavonoidi PRODOTTI NATURALI FUNZIONI NON NUTRIZIONALI •polifenoli •steroidi •terpeni Oli essenziali Sono i prodotti naturali, noti anche come metaboliti secondari, i responsabili delle attività fitoterapeutiche di tutti i prodotti a base di erbe. Sono ancora i prodotti naturali, intesi anche come “marker biomolecolari”, a stabilire la ‘bontà’ di una specie vegetale officinale, ed allo stesso tempo quella di un suo qualsiasi derivato erboristico. PROGETTO PIANTE OFFICINALI SICILIANE finocchio (frutti) rosmarino LE SPECIE ANALIZZATE finocchio (foglie) origano coriandolo timo zafferano salvia elicriso Finanziato da “Assessorato Agricoltura e Foreste – Regione Siciliana” Salvia officinalis Olio Essenziale Monoterpeni Ossigenati O O -thujone -thujone O O 1,8-cineole HO camphor borneol Monoterpeni idrocarburi -pinene -pinene camphene Sesquiterpeni idrocarburi myrcene Sesquiterpeni Ossigenati H trans-caryophyllene globulol OH Sette differenti popolazioni di Salvia officinalis (A – G) sono coltivati in tre differenti ambienti: Catania, Troina EN, Avola SR. Globulol S. officinalis tipo A Borneol -Pinene S. officinalis tipo C Pimaradiene -Pinene -Thujone -Thujone Camphene a-Pinene -Thujone 1,8-Cineole 1,8-Cineole Camphor a-Thujone Camphor 0 10 20 -Caryophyll a-Humulene 30 40 0 S. officinalis tipo E 20 (wild) -Thujone Borneol Camphene Pimaradiene M ircene -Thujone Camphene -Pinene 1,8-Cineole a-Thujone 10 30 Salvia triloba Globulol -Pinene 0 10 20 Camphor Camphor 30 0 10 20 1,8-Cineole 30 40 50 ESTRATTI DI SALVIA -Carotene OH Metaboliti secondari in estratti di salvia. Marker HO Classe M. W. Carotenoide 536 “ 568 HO Flavonoide 286 HO Hispidulin “ 300 Cirsimaritin “ 314 Genkwanin “ 284 MeO Salvigenin “ 328 MeO Terpene 330 -Carotene Luteina Scutellarein Carnosol Carnosic Acid “ 318 Methyl Carnosate “ 332 Ethyl carnosate “ 346 Acido Organico 180 “ 360 Caffeic Acid Rosmarinic Acid Luteina OMe OH OH MeO O HO O MeO MeO OH O OH O OH O Salvigenin Hispidulin Scutellarein OH OH MeO O OH O O O OH Cirsimaritin Genkvaninn O OH OH OH HO HO O HO HO CO MeO CO O Metil Carnosate Carnosic Acid Carnosol O O HO HO OH HO OH O OH O HO Acido Caffeico OH Acido Rosmarinico Profili HPLC-UV-DAD di estratti di Salvia Carotenoidi1 #24 [modif ied by HPLC] mA U SA spA V 12 mg A 700 600 UV _V IS_5 WV L:450 nm Carotenoidi 500 450 nm 2 - Beta-carotene - 17,514 800 1 - Luteina(est) - 7,728 400 300 200 100 min -50 11,0 12,0 13,0 SaECT AcOEt B Flavonoidi e Terpeni 5,0 10,0 1 - Acido Caffeico - 15,268 300 200 100 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 UV_VIS_1 WVL:280 nm 280 nm 11 - Methyl Carnosate - 59,201 10,0 10 - Carnosol - 57,268 9,0 8 - 55,468 9 - Salvigenin - 56,201 8,0 6 - Cirsimaritin - 49,601 7,0 7 - 50,468 6,0 5 - Hispidulin - 44,935 5,0 4 - Naringenin - 44,068 4,0 2 - Acido Rosmarinico - 32,135 400 3,0 3 - Quercetin - 40,468 0,0 1,0 2,0 500 PPO #25 [modif ied by HPLC] mAU min -50 0,0 1 - PPO #20 [modif ied by HPLC] 2 - PPO #23 3.500 3 - PPO #26 mA U 2.500 20,0 25,0 30,0 SaspA v EtOH SaBCT EtOH SaECT EtOH 35,0 40,0 45,0 50,0 55,0 60,0 65,0 UV _V IS_2 UV _V IS_2 UV _V IS_2 WV L:330 nm 330 nm C 3.000 15,0 Acidi organici 2.000 1 - A cido Rosmarinico - 32,201 1.500 1.000 3 500 0 2 1 -500 0,0 min 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 50,0 A (n-esano), B (etil acetato), C (etanolo) 55,0 60,0 65,0 Confronto tra i valori dei 13 markers chemotassonomici per 3 diversi genotipi di Salvia SaspAv SaBCT SaECT 0,26 0,3 0,2254 0,25 0,212 0,176 0,283 0,2 0,15 0,2164 0,1 SaECT 0,05 SaBCT SaspAv 0 C b- e en ot ar a in te Lu A do ci o ic ffe a C Ac o id sm Ro in ar o ic Sc re la el ut in H in ul id si p n iti C irs ar im G kw en in an in en vig l Sa C ol os n ar C c si no ar Ac M te sa o n id l hy et C ar Ca yl h Et e at os rn ot it ol n Fe 0 00 il /1 a C (F ) Confronto quali/quantitativo del contenuto di 13 markers biomolecolari in tre differenti popolazioni di S. officinalis ORIGANO - ORIGANUM Gli oli essenziali dei taxa di Origano sono caratterizzati dalla presenza dominante dei seguenti gruppi di composti: OH O. vulgare subsp. hirtum (syn. O. heracleoticum), O. onites OH thymol carvacrol p-cimene -terpinene HO OH O. majorana (syn. Majorana hortensis) OH linalool terpinen-4-ol sabinene sabinene hydrate O. vulgare subsp. vulgare HO trans-caryophyllene germacrene-D spathulenol GLI OLI ESSENZIALI DELL’ORIGANO SICILIANO 51 campioni di Origano provenenti da differenti ambienti Siciliani 1.8 – 6.6 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 4.1% 81 componenti identificati; 34 – 54 il range di componenti identificati nei 51 campioni - media 47. Selezionati Componenti dei 51 Campioni di Origano #a a Composto Range %b Inc #a Composto Range %b Inc 8.29 - 53.47 51 4 -Thujene 1.25 - 3.17 51 21 -Terpinene 5 -Pinene 0.65 - 2.23 51 22 cis-Sabinene hydrate 0.12 - 2.28 51 7 Sabinene n.d. - 5.02 43 25 Linalol 0.15 - 3.88 51 8 -Pinene 0.23 - 2.18 51 26 trans-Sabinene hydrate n.d. - 12.82 40 10 -Myrcene 2.07 - 4.79 51 34 Terpinen-4-ol 0.50 - 9.58 51 14 -Terpinene 2.53 - 6.80 51 38 -Terpineol n.d. - 3.18 40 15 p-Cimene 3.15 - 18.67 51 42 Thymol methyl ether 0.13 - 6.05 51 16 Limonene 0.63 - 1.64 51 48 Thymol 10.52 - 54.42 51 17 1,8-Cineole n.d. - 3.32 17 49 Carvacrol 0.19 - 8.28 51 18 -Z-Ocimene n.d. - 3.29 47 54 -Caryophyllene 0.57 - 3.97 51 20 -E-Ocimene 0.14 - 6.61 51 65 -Bisabolene 0.23 - 3.61 51 Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = non determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente. Analisi cluster degli oli essenziali di origano thymol>> -terpinene≥p-cymene thymol> -terpinene>t-sabinene hydrate>terpinen-4-ol thymol≥ -terpinene> p-cymene thymol>> -terpinene> p-cymene thymol> -terpinene> p-cymene -terpinene>> thymol> p-cymene -terpinene> thymol≥ p-cymene ESTRATTI DI ORIGANO OH O HO OH O HO OH OH O Naringenin Metaboliti secondari in estratti di origano. O OH Aromadendrin OH OH OH Marker Vanillic Acid Rosmarinic Acid Aromadendrin Classe M.W. Acido Organico 168 “ 360 O HO O HO OH MeO O HO OH O O OH Apigenin OH Luteolin Flavonoide 288 Naringenin “ 272 Luteolin “ 286 MeO Sorbifolin “ 300 MeO Apigenin “ 270 Cirsimaritin “ 314 Xanthomicrol “ 344 OH O O Sorbifolin OH OMe O MeO MeO O OH OH Cirsimaritin O Xanthomicrol O O OH HO HO HO OMe Vanillic Acid OH O OH OH O Rosmarinic Acid Confronto di tre profili cromatografici (HPLC-UV-DAD) di tre differenti estratti in acetato di eile di campioni di Origano provenienti da differenti ambienti. TIMO - THYMUS Thymus vulgaris L. è la più conosciuta specie di questo genere. Nella Farmacopea Europea è incluso solo il chemiotipo timolo/carvacrolo, le cui quantità oscillano fra 30-70% e 3-15%, rispettivamente. In Sicilia, la specie T. capitatus è quella spontaneamente più diffusa, essendo caratterizzata da un alto contenuto di carvacrolo. Olio essenziale Monoterpeni Ossigenati OH OH OH carvacrol terpinen-4-ol Monoterpeni idrocarburi p-cymene -terpinene -terpinene myrcene linanool Sesquiterpeni trans-caryophyllene Z--bisabolene Principali componenti degli oli essenziali di Timo. GLI OLI ESSENZIALI DEL TIMO SICILIANO 41 campioni di Timo provenienti da differenti ambienti Siciliani 3.9 – 8.8 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 6.2% 38 componenti identificati; 27 – 37 il range di componenti identificati nei 41 campioni - media 33. Selezionati Componenti dei 41 Campioni di Timo a #a Composto range %b inc #a Composto range %b inc 3 -Pinene 0.56 - 1.04 41 19 Borneol n.d. - 1.13 40 6 Myrcene 1.16 - 2.10 41 20 Terpinen-4-ol 0.58 - 0.80 41 10 -Terpinene 1.00 - 2.22 41 26 Thymol 0.14 - 0.39 41 11 p-Cymene 4.63 – 11.45 41 27 Carvacrol 65.26 - 81.27 41 14 -Terpinene 2.10 - 9.09 41 29 -Caryophyllene 1.34 - 4.25 41 17 Linalool 0.27 - 0.95 41 33 Z--Bisabolene n.d. - 0.75 35 Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = not determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente. 0 carvacrol ≈ 73% -terpinene ≈ 5% P-cymene ≈ 8% carvacrol ≈ 80% -terpinene ≈ 3% p-cymene ≈ 5% 5 carvacrol ≈ 70% -terpinene ≈ 8% p-cymene ≈ 10% 10 Timo028 Timo031 Timo008 Timo030 Timo036 Timo035 Timo026 Timo024 Timo023 Timo022 Timo034 Timo011 Timo043 Timo039 Timo032 Timo019 Timo 007 Timo033 Timo015 Timo016 Timo006 Timo045 TImo038 Timo021 Timo009 Timo020 Timo005 Timo018 Timo002 Timo027 Timo012 Timo010 Timo044 Timo041 Timo004 Timo029 Timo014 Timo003 TImo037 Timo013 Timo001 Distanza Legame Analisi cluster degli oli essenziali di timo Dendrogramma per 41 Variabili Legame Completo Distanze euclidee 20 carvacrol >> p-cymene > -terpinene 15 carvacrol ≈ 77% -terpinene ≈ 4% p-cymene ≈ 6% carvacrol ≈ 75% -terpinene ≈ 4% p-cymene ≈ 6% OR' MeO ESTRATTI DI TIMO R'O O OR Metaboliti Secondari negli Estratti di Timo. Marker O 7 6 OH O R = R' = H Apigenin R = C-glc; R' = H Vicenin-2 R = H; R' = glu Apigenin 7-O-glucoronide Acido Organico 360 Flavonoide 446 Vicenin-2 (Apigenin 6,8 di-C-glc) “ 594 Taxifolin di-O-glc* “ 628 Gardenin B glucoside* “ 520 Genkwanin rutinoside* “ 592 Apigenin “ 270 MeO Eriodictyol “ 286 HO 6-OH Luteolin “ 302 Luteolin “ 286 Thymusin “ 330 Cirsilineol “ 344 Diosmetin “ 300 OH OH M.W. Apigenin 7-O-glucuronide 8 OH Classe Rosmarinic Acid R Genkwanin rutinoside in R o R' O OH R OMe O HO R OH O HO R = H Luteolin R = OH 6-Hydroxyluteolin O Diosmetin O OH OMe OH MeO O MeO MeO O MeO Cirsilineol OH OMe OMe O OR O OH OMe O Thymusin O OH OH OH OH OH O HO OH O HO OH O Taxifolin di-O-glucoside (in due degli OH) OH O O HO *corretto isomero non determinato HO Gardenin B glucoside R = glc OH O OH OH O Rosmarinic Acid Eriodictyol ROSMARINO - ROSMARINUS Sono noti tre differenti chemiotipi di olio essenziale di Rosmarinus officinalis: cineoliferum alta % O 1,8-cineolo camphoriferum % > 20% O canfora verbenoriferum % > 15% O verbenone Tuttavia, l’olio essenziale, secondo la X F.U.I., deve contenere borneol (10 – 15%) e bornyl acetate (1.5 – 5.5%): RO R=H borneol R=Ac bornyl acetate GLI OLI ESSENZIALI DEL ROSMARINO SICILIANO 41 campioni di Rosmarino provenienti da differenti ambienti Siciliani 0.7 – 2.8 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 1.2% 93 componenti identificati; 30 – 67 il range di componenti identificati nei 41 campioni - media 49. Selezionati Componenti dei 41 campioni di Rosmarino Inc #a Composto range %b 2,21 - 39,83 41 24 Terpinolene n.d. - 3,55 26 0,79 - 12,09 41 25 Linalool n.d. - 5,45 38 Thuja -2,4(10) Diene n.d. - 2,00 23 31 Camphor 2,55 - 30,53 41 -Pinene n.d. - 5,10 17 34 Isoborneol n.d. - 4,37 5 12 -Myrcene n.d. - 1,85 37 35 trans-3-Pinocamphone n.d. - 2,78 28 14 D-2-Carene n.d. - 2,83 10 37 Borneol n.d. - 17,72 36 15 -Terpinene n.d. - 2,70 40 41 -Terpineol n.d. - 4,65 40 16 p-Cymene n.d. - 2,61 39 45 Verbenone n.d. - 13,73 28 17 Limonene n.d. - 7,90 19 50 trans-Myrtanol n.d. - 2,68 26 18 1,8-Cineole 0,11 - 62,74 41 64 Caryophyllene –Z n.d. - 2,91 36 #a Composto range %b 3 -Pinene 4 Camphene 5 9 a Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = non determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente. Inc Analisi cluster degli oli essenziali di rosmarino a-Pinene 1,8-Cienolo Verbeneone Canfora Canfene Borneolo -pinene Canfora 1,8-Cineolo Borneolo Verbenone 16.55 13.13 10.49 10.88 9.98 -Pinene 33.03 Canfora 19.64 Canfene 9.96 Borneolo 7.78 Limonene 6.10 Verbenone 4.96 1,8-Cineolo -Pinene Canfora Borneolo Canfene 43.62 15.55 10.94 8.90 5.83 30.52 25.37 5.62 5.53 5.52 5.44 1,8-Cineolo 59.49 -Pinene 13.25 Canfene 4.79 -Terpineolo 4.27 Isoborneolo 4.02 ESTRATTI DI ROSMARINO O O HO Metaboliti Secondari negli Estratti di Rosmarino. O HO Marker Acido Caffeico Classe MW Acido organico 180 Acido Rosmarinico “ 360 Luteolin glucoside Flavonoide 624 Luteolin glucuronide “ 630 Eupafolin-glucoside “ 478 Sorbifolin-glucoside “ 462 Luteolin-glucuronide “ 462 Luteolin-glucuronide (acetil) 1 “ 504 Luteolin-glucuronide (acetil) 2 “ 504 Luteolin “ 286 Scutellarein “ 286 Hispidulin “ 300 Cirsimaritin “ 314 Cirsimaritin isomero “ 314 Genkwanin “ 284 Salvigenin “ 328 Terpene 330 Carnosic Acid “ 318 Methyl Carnosate “ 332 Carnosol OH O HO Acido Caffeico Acido Rosmarinico MeO O HO O OMe OH OH HO OH O OH O OH OH MeO O Salvigeni Hispidulin Scutellarein O MeO MeO HO OH OH OH OH HO MeO O O MeO OH O OH Cirsimaritin O Genkvaninn OH OH MeO O MeO OH O MeO OH O OH Lutolin e derivati Eupafolin glucoside OH OH HO HO O O HO CO OH HO MeO CO O Carnosol Carnosic Acid Metil Carnosate Studi molecolari e valorizzazione di risorse per il settore biomedico Individuazione e caratterizzazione di nuove molecole da specie vegetali per applicazioni in campo fitoterapico La liquirizia (Glycyrrhiza glabra L.) è una delle più conosciute piante medicinali nel mondo. La parte della pianta utilizzata come droga è rappresentata dalle radici (stoloni) essiccate. Essa è inclusa in molte farmacopee ufficiali di svariati paesi orientali dove sono descritti i principali usi terapeutici delle radici. Svariati composti triterpenici quali saponine(acido glicirrizico, acido glicirrizinico) e sapogenine (glicirretina, acido glicirretinico), insieme a flavoni, isoflavoni, calconi e composti correlati, sotto forma anche di glucosidi, sono stati isolati dalle radici di G. glabra e di specie congeneri. Questi composti sono considerati i principi attivi a cui si deve il largo numero di attività biologiche di questa pianta, i cui estratti sono utilizzati come tonici, antiflogistici, espettoranti ed analgesici. 90 PV (meq/kg) Al contrario, le parti aeree della pianta sono scarsamente utilizzate, e considerate un prodotto di scarto. Abbiamo pertanto analizzato l’estratto lipidico delle foglie di G. glabra raccolta in Sicilia. Esso è stato sottoposto alla valutazione della sua efficacia antiossidante misurando il valore dei perossidi (PV) in olio di semi di girasole commerciale. Questa indagine ha permesso di stabilire che la capacità protettiva dell’estratto lipidico di foglie di liquirizia è paragonabile a quella del 2,6-di-tertbutil-4-metilfenolo (BHT), uno dei più comuni antiossidanti sintetici (v. grafico). 72 54 36 18 0 10 20 30 40 giorni Variazione del valore dei perossidi (PV) di olio di semi di girasole con BHT (▲), estratto lipidico di foglie di liquirizia (■), bianco (♦). Studi molecolari e valorizzazione di risorse per il settore biomedico Individuazione e caratterizzazione di nuove molecole da specie vegetali per applicazioni in campo fitoterapico Inibizione della COX-2 120 100 80 60 40 20 M 2µ µM Ni m es ul id e3 33 6 -8 2 -8 2 PA PA 16 8 µM µM µM 59 23 7 -0 7 DO DO -0 7 µM 76 -2 3 -2 3 GA 30 5 µM 0 GA Inibizione (%) Sulla base degli incoraggianti risultati sull’attività antiossidante, i diidrostilbeni più abbondanti (GA-23, PA-82, DO-07) sono stati sottoposti ad una serie di saggii per verificarne l’attività inibente sulle cicloossigenasi, COX-1 e COX-2, che come è ben noto sono coinvolte nei processi infiammatori. I composti finora analizzati hanno mostrato un’attività inibente, più o meno marcata, sulle COX-2 ma non sulla COX-1. Ulteriori studi sono in corso per confermare questa selettività, e stabilire delle correlazioni fra struttura ed attività. Percentuale di inibizione della COX-2 indotta dal lipopolisaccaride (LPS) da parte di alcuni stilbeni su sangue intero umano. OH Inibizione della COX-1 120 HO OH OH HO 80 60 40 20 0 OH GlcO OMe DO-07 3 G A -2 OMe GA-23 30 OH 5 G µM A -2 3 76 µM D O -0 7 23 7 D µM O -0 7 59 µM PA -8 2 PA 336 µM -8 2 16 8 µM In do m et ac in a 28 µM PA-82 Inibizione (%) 100 OH Percentuale di inibizione della COX-1 da parte di alcuni stilbeni su sangue intero umano. Mappatura per specie e per aree geografiche di provenienza dei campioni spontanei di piante officinali Origano Salvia Finocchio Rosmarino Timo 2006-2007 Alcune considerazioni 1051 campioni sono finora pervenuti a questa U.O. • 941 (ca. 90%) sono stati gli essenziali ottenuti ed analizzati: origano, timo, rosmarino, finocchio, salvia, coriandolo; • 386 gli estratti ottenuti ed in parte analizzati: salvia, timo, origano, rosmarino, zafferano. Emerge un quadro fitochimico abbastanza ampio, anche se ancora con alcune lacune, della flora aromatica aromatica siciliana sia allo stato spontaneo che coltivato. La tipicità e ricchezza fitochimica delle specie spontanee, evidenziate in questo studio, costituiscono un patrimonio da salvaguardare ed, allo stesso tempo, sfruttare. Per quel che concerne i campioni coltivati, studiati in misura minore, emerge un quadro non del tutto omogeneo, essendo il settore ancora caratterizzato da ampi livelli di improvvisazione, ed incertezze e di una ancora non adeguata conoscenza di quelli che possono essere gli sviluppi potenziali di questo settore. Dott. Edoardo Napoli Dott.ssa Laura Siracusa Dott.ssa Giusy Curcuruto Dott. Andrea Pasquale Sig.ra Tonia Strano Sig.ra Concetta Rocco Sig. Agatino Renda Sig. Antonio Giuffrida Assessorato Agricoltura e Foreste - Regione Siciliana Rao Erbe – San Gregorio CT