Valutazione dei parametri di efficienza di un nuovo metodo rapido quantitativo
per la determinazione delle micotossine nei cereali
Carlo Breraa, Antonella Nigria, Francesca Debegnacha, Elena Pannunzia, Emanuela Gregoria, Elisabetta Pranteraa, Barbara De Santisa
a.Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Sanita’Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare – Reparto Ogm e Xenobiotici di Origine Fungina
INTRODUZIONE
L’analisi quali/quantitativa rappresenta il centro dell’intero processo di determinazione delle micotossine, come dimostrano i numerosi sforzi fatti negli anni passati per l’ottimizzazione di questo passaggio. Monitoraggi, controllo
ufficiale ,valutazione dell’esposizione e controllo di qualità aziendale sono tutte attività che richiedono metodi appropriati. Gli elementi principali da valutare sono il limite di quantificazione richiesto, il tempo di analisi, il numero di
campioni da analizzare, la necessità di ottenere risposte rapide e non ultimo i costi associati. La sfida è quella di avere metodi rapidi e metodi di screening facili da usare e veloci ma con parametri di efficienza rispondenti ai criteri
di rendimento richiesti dalla legislazione vigente. Tali metodi consentono analisi quantitative di un elevato numero di campioni anche se, per avere una stima della attendibilità dei risultati ottenuti, è sempre raccomandabile
eseguire un’analisi di conferma sui positivi.
In questo studio sono stati valutati i parametri di efficienza di un nuovo metodo rapido, ovvero di un test immunocromatografico - Lateral Flow Device (LFD), per la determinazione delle micotossine nei cereali caratterizzato da
una procedura di estrazione estremamente veloce e una lettura dei risultati eseguita su un sistema scanner pratico, maneggevole che può codificare i campioni in automatico. In particolare sono stati valutati la deviazione
standard di ripetibilità percentuale (RSDr) e l’esattezza intra-laboratorio su campioni analizzati in replicato; inoltre, è stato fatto un confronto delle analisi di campioni di riferimento con valore assegnato eseguite in due laboratori.
Tali parametri sono stati valutati per il Deossinivalenolo (DON) nel grano e per le Fumonisine (FBs) nel mais.
Deossinivalenolo (DON)
Fumonisine (FBs)
è una micotossina prodotta da alcune specie di Fusarium, principalmente da F. graminearum, F.
culmorum e F. cerealis, e appartiene al gruppo dei tricoteceni di tipo B. La distribuzione geografica
delle specie di Fusarium è legata alla temperatura, infatti il F. graminearum risulta predominante nelle
regioni temperate centro-meridionali.
La matrice alimentare più suscettibile alla contaminazione del DON è il grano e conseguentemente i
suoi prodotti derivati, quali pasta, pane e altri prodotti da forno.
I principali effetti tossici sull’uomo sono nausea, vomito, diarrea, gastroenteriti, malfunzionamento del
sistema ematopoietico, immunosoppressione e glomerulonefropatia.
L’Agenzia Internazionale per la ricerca sul cancro (IARC) ha classificato il DON nel gruppo 3 ovvero
“ non classificabile in base alla sua cancerogenicità per l ’ uomo ” . Inoltre il Comitato Scientifico
dell’Alimentazione Umana (SCF) ha stabilito una dose massima giornaliera tollerabile (Tollerable Daily
Intake-TDI) pari a 1 g/kg pc/die.
sono micotossine prodotte principalmente da Fusarium verticilloides e proliferatum, che si sviluppano
prevalentemente sul mais contaminando anche i prodotti derivati quali farina per polenta, mais dolce
e cereali per la prima colazione. Le fumonisine hanno mostrato epatotossicità e nefrotossicità in diverse
specie animali e sono responsabili della leucoencaflomalacia negli equini.
Lo IARC ha classificato la Fumonisina B1 (FB1) nel gruppo 2B, ovvero come potenzialmente
cancerogena per l’uomo. Il JECFA ha attualmente individuato una TDI per la somma delle fumonisine
pari a 2 g/kg pc/die.
μ
μ
MATERIALI E METODI
Per il DON, il medesimo campione naturalmente contaminato è stato impiegato per valutare la precisione e, tramite esperimenti di fortificazione, ovvero mediante l’aggiunta di opportune quantità di standard (spiking
procedure), l’esattezza. Il test ha un campo di applicazione che varia tra 0.2 e 5 mg/kg e che può essere esteso fino a 10 mg/kg attraverso opportuna diluizione. Per le fumonisine, invece, sia la precisione che l’esattezza
sono state valutate mediante l’analisi di un materiale di riferimento. Il test ha un campo di applicazione che varia da 0.20 a 6.0 mg/kg e che può essere esteso fino a 20 mg/kg attraverso opportuna diluizione.
In seguito sono state eseguite analisi per la determinazione del DON e delle FBs presso due diversi laboratori. La precisione e l’esattezza sono state valutate attraverso l’analisi ripetuta (10 estrazioni con lettura in doppio)
di materiali di riferimento.
PROTOCOLLO DI ANALISI
Macinare il campione e
pesare un’aliquota tra
20 e 50 g
DON: aggiungere 5 mL
di H2O per grammo di
campione pesato
FBs: aggiungere 2 mL
di EtOH:H2O (50:50,
v/v) per grammo di
campione pesato
Agitare per circa 1
minuto
Far decantare il
campione estratto,
l’analisi sarà condotta
sul surnatante
Aggiungere 100µL di
Buffer e 100µL di
surnatante e miscelare
con la pipetta
Immergere la strip test
nella vial
DON: aspettare 10 minuti
FBs: aspettare 5 minuti
Eseguire la lettura
RISULTATI E DISCUSSIONI
VALUTAZIONE INTRA-LABORATORIO
CONFRONTO FRA LABORATORI
Valore medio, precisione ed esattezza ottenute per la determinazione del deossinivalenolo e delle
fumonisine con i kit QuickToxTM
Parametri statistici dei kit QuickToxTM per DON e FBs. Prove esguite presso due diverse strutture (LAB A
e LAB B) sui materiali di riferimento indicati in tabella.
DON
Nat. contam.
Fortificato**
FBs
RM (3.036 mg/kg)
* Numero di analisi in replicato = 10
**0,501 mg/kg aggiunti
x* (mg/kg)
0.40
0.89
2.4
RSDr (%)
10
10
17
R (%)
98
80
Sia per quanto riguarda i valori ottenuti per il DON, sia per quanto riguarda quelli relativi alle
fumonisine, i valori ottenuti sono risultati soddisfacenti ed in linea con i criteri di rendimento
riportati nel Regolamento CE 401/2006. Tali valori sono poi stati confrontati con i parametri
ottenuti in sede di validazione dei corrispondenti metodi in HPLC.
DON
FBs
HPLC-UV
QuickScan
HPLC-FLD
QuickScan
LOQ (mg/kg)
0.07
0.20
0.04
0.20
R (%)
91
98
96
80
x assegnato
x* (mg/kg) s (mg/kg)
(mg/kg)
DON
LAB A
2.010
2.2
0.1
LAB B
0.807
0.9
0.1
FBs
LAB A
3.630
2.5
0.5
LAB B
3.630
3.7
0.2
* Numero di analisi in replicato = 10
DON Andamento dei valori delle analisi replicate (N=10). Le barre
indicano la deviazione standard della coppi di letture.
RSDR (%)
4
10
10
17
CONCLUSIONI
Per entrambe le fusariotossine il test immunoenzimatico ha mostrato valori di efficienza in termini
di ripetibilità, ed esattezza, ampiamente compresi nei valori di riferimento fissati dal Regolamento
comunitario 401/2006. Inoltre, nel confronto fra le analisi dei materiali di riferimento eseguite fra i
due laboratori, si hanno elementi di riproducibilità accettabili. Questa condizione unita alla estrema
facilità d’uso del kit ed ai ridotti temi di esecuzioni delle analisi rendono il test adatto agli scopi
nell’ambito sia delle attività di controllo ufficiale sia di quelle inerenti i controlli aziendali.
FBs Andamento dei valori delle analisi replicate (N=10). Le barre
indicano la deviazione standard della coppi di letture.
DIPARTIMENTO DI SANITA’ PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE
RSDr (%)
R (%)
6
12
18
4
109
115
69
103