Diss. ETH Nr. 10177
Functional expression cloning of the
canalicular sulfate transport system
of rat liver
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH
for the
degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
MARCO ANTONIO BISSIG
farmacista.
dipl.
fed.
26th September
1964
citizen of Schattdorf
(UR)
born
accepted
on
the recommendation of
Prof. Dr. T. Roller, examiner
Prof. Dr. P.J.
Meier-Abt, co-examiner
1993
7
Summary
Hepatocytes
endogenous
maintain
secretory
endothelial
cells
that
exogenous
substances
from
blood
are
and
these
vectorial
transport systems
functional
a
and
by
sulfate
uptake
similar
to
previously
cholate.
with
those
of
the
Km
described in isolated
of 367
signal
at
predicts
75.4
reading
open
bp,
and
kDa,
3689
total
was
region
by
the
11-16
putative
spanning
sites
no
are
detected
sulfate transport system
proteins.
mouse
the
plasma
not
a
very
system
membrane
pairs (bp),
with
a
region
polyadenylation
The
coding region
mass
of
experiments. Computer
protein suggests
domains.
are
exchange
calculated molecular
the presence of
Furthermore, three potential
Asn-587).
Database
of the cloned transporter to
Asn-163,
previously
proteins indicating
might belong
fiM), but
5'-untranslated
with
poly-A tail).
a
(Asn-158,
significant homology
identified membrane transport
a
bp,
in vitro translation
of the cloned
searches reveal
bp,
of 1250
hydrophobicity analysis
glycosylation
canalicular
2109
based
transmembrane
by 4,4'-
properties
of 3726 base
length
bp upstream
confirmed
28
=
sulfate/bicarbonate
encompassing
16
encoding
laevis oocytes
oxalate and
by
of 0.14 mM. These
of 703 amino acids with
protein
which
(i.e.
cDNA
Xenopus
(DIDS, IC5Q
highly purified
a
3' untranslated
a
position
a
frame
using
single
a
the
the cloned cDNA expresses saturable
canalicular
vesicles. The cloned cDNA has
predicted
acid
Furthermore,
apparent
an
of
cloning
be inhibited
can
diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic
or
to
distinct
The cloned transporter mediates sodium
expression system.
independent sulfate uptake
succinate
order
In
localize
their basolateral and canalicular surface domains. The
on
the canalicular sulfate transporter of rat liver
as
of
variety
a
into bile.
hepatocytes
transport processes,
reports the identification and
present study
transport
to
a new
that the
gene
family
hepatocanalicular
of anion
exchange
The message for this transporter is found also in the liver of the
and in different rat organs
expression
(kidney,
but is present in other tissues and
species
as
brain), suggesting that
only restricted to the rat liver,
muscle and
of the cloned transporter is not
well.
9
Riassunto
Gli
epatociti
cellule
sono
endoteliali
endogene
localizzati
selettivamente
sia
nella
membrana
canalicolare, le cellule epatiche riescono
vettoriali diretti
l'interno
verso
presenta, mediante 1'
di
di
capaci
uso
o
l'identificazione
espressione funzionale,
rana
il
e
sostanze
specifici trasportatori
sia
basolaterale
une
di
clonaggio
un
quale sistema
singolo cDNA,
che, nel ratto, codifica il trasportatore canalicolare degli ioni solfato.
clonato
e
responsabile
del
sodio
trasporto
attraverso la membrana canalicolare.
ossalico che dal
ma non
grado
esprimere
0.14 mM. Queste
precedentemente
essere
quello colico.
funzionali
proprieta
per lo
canalicolari altamente
con
molto simili
sono
un
a
Km
II clone
possiede
=
28
/jM),
lunghezza
una
e
in
apparente di
quelle gia
"scambiatore" solfato/bicarbonato in
puri.
solfato
inibito sia dall' acido
Inoltre il cDNA clonato
trasporto di solfato saturabile
un
II sistema
ioni
4,4'-diisotiocianatostilbene-2,2'-disulfonato (IC5Q
dall' acido succinico nd da
di
indipendente degli
Questi pud
quella
trasporti
Questo studio
laevis
Xenopus
in
rete di
l'esterno della cellula stessa.
ovociti della
degli
a
mantenere
a
varie
secernere
ed esogene dal sangue nella bile. Grazie
descritte
proteoliposomi
totale di 3726
nucleotidi, 2109 dei quali codificano la proteina. La regione antecedente il
iniziale
codone
verso
il
di
poliadenilazione
denominata
amino
poli-A).
e
verso
6 stata in
localizzata in
costituita
e
polo
3'
ne
posizione
una
indicano la presenza di 11-16
Sono
state
con
1'
segmenti
inoltre
alle diverse banche di
clonata
e
geni
le altre
non
comprende
3689
nucleotidi,
quella
1250. Una sequenza
(16 basi prima
proteina
della coda
si estende
su
703
di traslazione in vitro.
aiuto di
in
programmi computerizzati
grado di attraversare la membrana
localizzate
tre
posizioni potenziali
di
Da analisi effettuate accedendo
risulta alcuna
proteine
367
esperimenti
glicosilazione (Asn-158, Asn-163, Asn-587).
proteina
da
molecolare calcolata di 75.4 kDa.
massa
confermata da
seguito
Analisi di idrofobicitd effettuate
citoplasmatica.
il
La parte di cDNA codificante la
acidi, corrispondente ad
Questa cifra
5'
polo
susseguente il codone finale
omologia significativa
fra la
della membrana finora identificate.
Ci6
10
significa
che
appartenere
messaggero
topo
e
tratta
ma
di
il
ad
un
di
organi
un
di
famiglia
nuova
corrispondente
in diversi
quindi
trasportatore epatocanalicolare degli ioni
un
a
questa
del ratto,
cosiddetti
proteina
quali
i
solfato
"scambiatori".
6 anche presente nel
potrebbe
II
reni, i muscoli ed il cervello.
sistema di trasporto unicamente situato nel
sistema presente anche in altri tessuti
e
specie animali.
fegato
RNA
fegato del
Non si
del ratto,