Terapia genica
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte teorica I (14-14.15):
Dal DNA alla terapia genica.
Umori sulla terapia genica
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E.WFW. Alton, London ESGT Meeting 99
Cures all known diseases
Ridiculous
idea
Good treatment
Woudn’t give it to my dog
What
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Il DNA come l’aspirina
Why
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Vantaggi teorici:
•
•
•
•
Lunga durata
Trattamento della causa
Specificita’
Assenza di effetti collaterali
Why not
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• Danno (inefficienza) da protocollo terapeutico
• Dato il rischio quando e’ giustificata la terapia?
• Trasduzione della linea germinale (eugenetica)
How
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Primo step:
Scegliere, manipolare il DNA da usare come
medicina
D
D
N
How
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Secondo Step:
Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)
ND
N D
ND
How
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Terzo Step:
Fare in modo che il processo funzioni in tutte le cellule e
per la durata di vita dell’individuo (cervello=100x10e9
neuroni).
Terapia genica
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Parte pratica I (14.15-15.30):
Manipolazione del DNA
How
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Primo step:
Scegliere, manipolare il DNA da usare come
medicina
D
D
N
Procedura sperimentale per l’estrazione di
DNA umano
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1. Congelamento/scongelamento per rompere le
cellule (aliquote da 4x10e6 cellule in 500ul)li
2. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare i
detriti cellulari
3. Recupero supernatante e trasferimento in una
nuova eppendorf
4. Aggiunta di 50 ul di NaAcO 3M(formazione di
complessi )
Procedura sperimentale per l’estrazione di
DNA umano
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5. Vortex
6. Aggiunta di 1 ml di EtOH 100% (formazione
del precipitato di DNA)
7. Vortex
8. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare il
pellet di DNA
Procedura sperimentale per l’estrazione di
DNA umano
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9. Eliminazione del supernatante
10. Incubazione del campione 3’ a temperatura
ambiente per far evaporare l’EtOH
11. Pellet in 1 ml di H2O sterile
Procedura sperimentale per l’analisi di
DNA umano
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1. Preparazione aliquote da 15 ul di DNA estratto
dalle cellule
2. Aggiunta di 3ul loading buffer
3. Caricamento su gel con controlli
4. Corsa a 100 volts per 15’
Terapia Genica
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Parte teorica II (9.15-9.45 e 11.3012):
Gli esperimenti di terapia genica sull’
uomo.
La terapia genica oggi
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•
•
•
•
636 protocolli clinici
> 3496 pazienti
> 20 paesi
Ampio spettro di target terapeutici (AIDS,
fibrosi cistica, emofilia, diabete, cancro…)
http://www.esgt.org
Protocolli clinici approvati
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Fasi dei protocolli clinici approvati
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•Fase I: pochi pazienti per stabilire la safe dose
•Fase II: piu’ pazienti seguiti per piu’ tempo
•Fase III: grande numero di pazienti seguiti per mesi o
anni
•Fase IV: fase 'post-marketing'
Protocolli clinici in funzione del tempo
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Caratteristiche dei target terapeutici
“ideali”
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•
•
•
•
•
Malattie mortali
Gene noto
Accessibilita’ del tessuto colpito
Regolazione del gene non determinante
Stato clinico del malato reversibile
Malattie trattate con terapia genica
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Geni usati nei protocolli di terapia genica
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Sistemi di trasferimento genico usati nei
protocolli clinici di terapia genica
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Protocolli clinici di terapia genica in (nord!)
Italia
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#
author
illness
gene
system
phase
comments
IT 001
C. Bordignon
San Raffaele Milano
C. Bordignon
San Raffaele Milano
C. Bordignon
San Raffaele Milano
Natale Cascinelli
Istituto Tumori, National Cancer Inst.
Milano
Natale Cascinelli
Istituto Tumori, National Cancer Inst.
Milano
V. M. Fazio
Istituto Medicina Sperimentale CNR
Roma
Giorgio Parmiani
Istituto Tumori, National Cancer Inst.
Oncologia Sperimentale
Milano
A. Aiuti
San Raffaele Telethon Institute for Gene
Therapy (HSR-TIGET)
Milan
M Maio
Centro di Riferimento Oncologico
Aviano
F. Belli
National Cancer Institute
Milan
Italy
ADA
ADA gene/ neo
gene
TK/neo gene
Retrovirus in PBL ex
vivo
Retrovirus in PBL
I/II
open
I/II
open
TK/neo gene
Retrovirus in PBL
I/II
open
IL-4
Retrovirus in melanoma
cell line
I/II
2/11 patients
clinical effect
IL-2
Retrovirus in melanoma
cell line
I/II
open
Naked vector
intramuscolar
I
open
IT 002
IT 003
IT 004
IT 005
IT 006
IT 007
IT 008
IT 009
IT
0010
Precautional for Immunomodulation of Donor
Anti-Tumor Immunity
Precautional for Immunomodulation of Donor
Anti-Tumor Immunity
melanoma
melanoma
Lymphoma leukemia
Metastatic melanoma
IL-4
Retrovirus
I/II
2/11 patients
clinical effect
ADA
ADA gene
Retrovirus in stem cells
I
open
melanoma
IL-2, IL-4
I
open
melanoma
IL-2, IL-4
I
Closed (results?)
Liposomi (8.6 %)
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+
+
+
_
DNA
_
+
+
_
DNA
_
_
+
+
+
+
_
_
_
_
_
Liposomi: durata
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Trasferimento di un gene reporter nel topo con
liposomi (intraven.)
Andamento in funzione del tempo.
Liposomi: tossicita’
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Tossicita’ dose dipendente di liposomi-DNA iniettati
nella cavita’ nasale di topi di Laboratorio (sezioni
polmonari 48h p.i.)
Why Virus (70.6%)
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Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo
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Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo
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Ex-vivo Retrovirus-mediated gene therapy:
ADA protocolli 1990
NIH, USA (Science 1995, Blaese et al)
• Sicuro
• Inefficiente
• Risultati non definitivi: trattamento parallelo con
proteina
Virus ricombinante ex vivo: efficacia e tossicita’
sull’uomo
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G
1998
Successo o catastrofe?
2 pazienti / 11, 1 protocollo / 263
Virus ricombinante in vivo: tossicita’ sull’uomo
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Adverse event (1 caso/ 256 protocolli clinici)
Wilson and coworkers; Science 2000
Winstar Institute U-Penn USA
•
•
•
•
•
OCT deficienza, X-linked
Adenovirus E2tsE1-/OCT
Iniettato nella vena epatica 3.8x1013 particles
4 giorni dopo l’iniezione il paziente muore
WHY?
Virus ricombinante in vivo: la risposta
immunitaria
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Inflammation
48h
CTL
7d
Abs
21 d
Risposta immunitaria: dal male il bene?
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Topi di Laboratorio con tumore trattati con virus
(AdIL-2)
Virus ricombinante ex vivo su cellule staminali
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Valutazione del rischio
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Virus:
•RC virus (problema nel paziente e nell’ambiente)
•Immunogenicita’
•Creazione di nuovi virus
•Mutagenesi inserzionale
•Danno da prodotto genico
•Irreversibilita’
Non-virus:
•Immungenicita’, tossicita’
•Danno da prodotto genico
Come si controlla il rischio biologico
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In Laboratorio
• Inattivazione del virus (delezioni, targeting, controllo trascrizionale,
cell marking)
• Manipolazione sotto cappe Biohazard
• P2, P3
• Isolatori per gli animali
• Analisi dei preparati da usare per I trattamenti (presenza di
materiale batterico, presenza di RCA)
Sul paziente
•
•
•
•
•
Selezione del target
Isolatori per i pazienti trattati con virus
Analisi della risposta immunitaria/infiammatoria
Analisi della presenza di virus circolante
Follow up clinico su lunghi tempi
Organismi di controllo giuridico dei protocolli
clinici di terapia genica
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•Italia: Ministero della salute
•Europa:The European Agency for the evaluation of
Medicinal products (EMEA) http://www.emea.eu.int/sitemap.htm
•USA: FDA
Terapia genica
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Parte pratica II (9.45-11 e 1213.15):
Trasferimento genico nella
cellula umana mediante virus
How
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Secondo Step:
Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)
ND
N D
ND
Procedura sperimentale per la
trasduzione di DNA in cellule umane
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1. Visualizzazione al microscopio di cellule umane. (12
piastrine 6well con 24 pozzetti contenenti ciascuno
5x10e6 cellule HeLa). (10’)
2. Cenni sulla quantita’ di virus da usare, sul vettore e sul
transgene in uso. (5’)
3. Aspirazione del mezzo di coltura dalle cellule da trasdurre.
(15’)
4. Aggiunta alle cellule del virus ricombinante (2000 opu per
pozzetto in 500ul, tot. 2.4x10e10 opu). ( 15’)
Terapia genica
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte pratica III (9.30-10-30 e
12-13):
Analisi della cellula umana
geneticamente modificata
Procedura sperimentale per la visualizzazione
della cellula umana geneticamente modificata
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1. Trasferimento su vetrino delle cellule trasdotte
2. Visualizzazione al microscopio del transgene
(GFP) espresso dalle cellule con microscopio a
fluorescenza
Terapia genica
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Si ringraziano
Gioia Cherubini
Stefania Piersanti
Per il prezioso contributo alla parte sperimentale di
questa sezione del corso Open Lab