Diagnostica di laboratorio della tubercolosi: le antiche
certezze e le nuove frontiere
Il laboratorio di Microbiologia
Paglia Maria Grazia
26 novembre 2011
Co.Pr. CRI-Roma
INMIINMI-Lazzaro Spallanzani
L’analisi fenotipica
(caratteri colturali e biochimici)
e genotipica
(regioni conservate)
ci consente di identificare circa
130 specie nel genere
Mycobacterium
Mycobacterium tuberculosis complex
e
Micobatteri non tubercolari (MNT)*
patogenicità
habitat
contagiosità
sensibilità ai chemioterapici
*L’acronimo MOTT (Mycobacteria other than tuberculosis) è meno usato
Identificazione dei Micobatteri
RACCOMANDAZIONI GENERALI
• Ogni test e procedura relativa deve essere eseguita da
personale adeguatamente formato
• Seguire le Standard Operating Procedures (SOPs) interne
• Svolgere i test in laboratori equipaggiati
• Partecipare a “Controllo di Qualità” nazionale ed internazionale
La tubercolosi è causata da Mycobacterium tuberculosis
complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M.
africanum, M. caprae, M. pinnipedii, M. microti e M. canettii)
Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium microti causano
malattia occasionalmente
La diagnosi microbiologica di tubercolosi o di micobatteriosi
richiede un campione biologico in cui:
rilevare la presenza di micobatteri
isolarli ed identificarli
determinarne la sensibilità agli antimicobatterici.
L’attendibilità dei risultati dipende dalle modalità con
cui i campioni sono stati raccolti, conservati e
trasportati.
Il laboratorio deve fornire istruzioni operative per la
raccolta, la conservazione e il trasporto dei campioni.
Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (I)
Tipo di campione
Aspirato gastrico
Broncoaspirato, lavaggio
bronco-alveolare,
spazzolatura bronchiale,
aspirato trans-tracheale
Espettorato
Espettorato indotto
Requisiti
Istruzioni speciali
Campioni non
idonei
neutralizzare (pH 7) con
≥ 5-10 mL raccolto al
mattino, dopo almeno 8 ore carbonato di sodio
di digiuno, per 3 giorni
consecutivi
≥ 3 mL
disinfettare accuratamente
il broncoscopio
campioni non neutralizzati
5-10 mL raccolto al mattino
da espettorazione
profonda, per 2-3 giorni
consecutivi
5-10 mL raccolto al mattino,
per 3 giorni consecutivi
saliva; pool di campioni
Feci
almeno 1 g in contenitore
senza conservanti
Linfonodo
linfonodo o porzione di
esso in contenitore sterile,
senza fissativi o
conservanti
istruire il paziente su come
espettorare correttamente
specificare chiaramente
nella richiesta, e sul
contenitore, che si tratta di
espettorato indotto
per la diagnosi di
tubercolosi intestinale
ricorrere al prelievo bioptico
aggiungere una piccola
campioni in formalina o altri
quantità di fisiologica sterile fissativi; campioni inclusi in
paraffina
Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (II)
Tipo di campione
Liquidi cavitari: pleurico,
pericardico, peritoneale
ecc.
Requisiti
Istruzioni speciali
Liquor
10-15 mL in provetta sterile per la diagnosi di pleurite
(con eparina o citrato)
tubercolare sono più
indicati biopsia pleurica ed
espettorato indotto
³ 2 mL
Materiale da lesioni
cutanee
la massima quantità
possibile
Materiali necroticoascessuali
Midollo emopoietico
Campioni non
idonei
utilizzare tamponi senza
tamponi con terreno di
terreno di trasporto solo se trasporto
non è possibile eseguire il
prelievo con siringa o
biopsia
la quantità massima
se non è possibile usare la
possibile in siringa con
siringa utilizzare più
copriago
tamponi ed inserirli in un
contenitore sterile con una
piccola quantità di
fisiologica sterile
la massima quantità
campione coagulato;
possibile, direttamente nel
campione in provetta con
EDTA
flacone da emocoltura, o in
provetta con eparina, o in
provetta Isolator
Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (III)
Tipo di campione
Prelievi tissutali e biopsie
Sangue mestruale
Sangue periferico
Urine
Requisiti
almeno 1 g di tessuto
in contenitore senza
fissativi o conservanti
alcuni mL, raccolti al 2°-3°
giorno del flusso mestruale,
in provetta con eparina
direttamente nel flacone da
emocoltura, o in provetta
con eparina od in provetta
Isolator
la prima urina del mattino
ottenuta anche mediante
cateterizzazione (almeno 50
mL)
Istruzioni speciali
Campioni non
idonei
aggiungere una piccola
campioni in formalina o altri
quantità di fisiologica sterile fissativi; campioni inclusi in
paraffina
sangue coagulato
sangue coagulato; sangue
in provetta con EDTA
un campione in 3 giorni
consecutivi; il mitto
intermedio è sconsigliato
urine delle 24 ore; urine da
sacca; volumi inferiori a 50
mL
Conservazione e trasporto dei campioni biologici:
conservare il campione a 4°C , non congelare
spedire secondo le modalità previste dalla Circolare del Ministero della Sanità N° 16
del 20/07/1994.
MICROSCOPIA
•
•
•
•
Pos
Rapido
Poco costoso
Specificità > 95%
Ottimo test per il controllo della TB in Paesi ad alta incidenza
Neg
• Non permette l’identificazione di specie
• Non fornisce informazioni sulla vitalità dei micobatteri
• Sensibilità 25-65%
• Anche dopo tecniche di concentrazione del campione biologico
la soglia di positività rimane alta (1.000-10.000 batteri/ml)
• La sensibilità aumenta con il numero dei campioni esaminati
1° diretto AAR 80-82%
2° diretto AAR 10-14%
3° diretto AAR 5-8%
Definizione di caso (Microscopia)
Secondo OMS (2007): “Soggetto con almeno 1 vetrino
positivo (1 bacillo è sufficiente) su un totale di due
esaminati”.
Tale definizione è applicabile a Paesi assistiti da un buon
sistema di controllo qualità.
COLTURA: IL “GOLD-STANDARD”
Pos
• E’ il test di riferimento
• Richiede 10-50 micobatteri vivi
• Comporta un aumento dei casi di TB rilevati (30-50%)
• Diagnosi definitiva di TB
• Punto di partenza per i saggi di sensibilità ai farmaci
Neg
• Tempi lunghi di risposta (6-8 settimane se negativo)
• Alto livello di bio-sicurezza: per colture da campione BSL2,
per antibiogrammi BSL3
Gli attuali standard internazionali raccomandano l’uso di due
terreni (terreno liquido e terreno solido) per l’isolamento
dei micobatteri da campioni biologici.
Terreni all’uovo: Löwenstein-Jensen
Contengono uova fresche, fecola di patate, sali e glicerolo, preparati a
becco di clarino, in provette con tappo a vite, e fatti solidificare per
coagulazione al calore. Contengono come inibitore della flora residente
verde di malachite (0,025%).
Terreni liquidi: Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT)
Consentono un rilevamento più sensibile e precoce della crescita rispetto ai
terreni solidi. Abbreviano sensibilmente i tempi della coltura (15-20 giorni).
Test Immunocromatografici per
l‘identificazione di M.tuberculosis complex
• Semplici da eseguire e rapida risposta (15 minuti)
• Rilevano l’antigene MPB64 specifico per TB complex
• Antigene trattenuto da un anticorpo monoclonale
anti-MPB64
• Non richiedono strumentazioni particolari
• Sensibilità del 100% (da coltura)
Metodi Molecolari (Nucleic acid Amplification test,
NAAT) per la ricerca e l’identificazione dei Micobatteri
(campione biologico e coltura)
Identificazione attraverso test commerciali:
- Ibridazione in fase liquida
Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD),
Gen-Probe
- Ibridazione in fase solida
InnoLipa, Innogenetics
GenoType Mycobacterium, Hain Diagnostika
- PCR
Cobas Amplicor, Roche
- Strand Displacement Amplification (SDA)
BD ProbeTec ET assay (Becton Dickinson)
- Real Time
Identificazione attraverso test “in-house”
Identificazione attraverso analisi di restrizione (PRA)
Identificazione per sequenziamento
Tutti i metodi molecolari necessitano di DNA estratto
PCR real time
Vantaggi:
• Rapidità
• Ampio range di quantificazione del target
• Riduzione della contaminazione
• Alta sensibilità intesa come piu basso limite di detection
American Thoracic Society. Am.J.Respir.Crit.Care Med.2000
Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico positivo
SENSIBILITA’ 95%
SPECIFICITA’ 98%
Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico negativo
SENSIBILITA’ 48-53%
SPECIFICITA’ 95%
Amplificazione genica, alternativa all’esame:
Microscopico ?
Colturale ?
Vantaggi
Vantaggi
-Sensibilità superiore
-Specificità di specie
-Molto più rapida
-Positiva rende superflua l’identificazione
-Contaminazione indipendente
Svantaggi
-Esecuzione complessa
-Costo elevato
Svantaggi
-Non altrettanto sensibile
-Non rivela i MNT
-False negatività/positività
-Costo elevato/esecuzione complessa
-Non DST
M. tuberculosis: le resistenze
• Dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche
• Mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente con
frequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra 1/106 e 1/108
• La resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguito
di mono-terapie o per difetto di compliance
• L’uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di
resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in una
singola lesione (108 - 1010 UFC)
• Una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel
ceppo responsabile dell’infezione
• Una resistenza si definisce secondaria quando insorge durante la
terapia
Un ceppo di M. tuberculosis viene
comunemente definito multidrug-resistant
(MDR) quando è resistente ad almeno
isoniazide e rifampicina
Un ceppo di M. tuberculosis viene definito
XDR (extensively drug-resistant) quando è
resistente ad isoniazide e rifampicina + un
fluorochinolone ed almeno un farmaco di
seconda linea iniettabile
Metodi fenotipici: valutazione della crescita in coltura in
terreni con e senza farmaco
• Bilancio costo-efficacia buono
• Facili da eseguire ma poco standardizzabili
• Risultati disponibili in settimane/mesi
Metodi molecolari: (identificazione delle mutazioni
responsabili di resistenza)
• Generalmente costosi
• Non richiedono ceppi vivi
• Disponibilità di risultati entro ore
• Più complicati da eseguire, e con relativamente pochi
farmaci testabili
LINE PROBE ASSAY (LIPA)
TEST DI IBRIDAZIONE INVERSA
su un supporto di nitrocellulosa sono immobilizzati oligo-probes
una miscela di primers marcati con biotina amplificano target di DNA
l’ibridazione tra amplificato e probe è evidenziato da un segnale visibile
Vengono identificate le più comuni mutazioni che conferiscono resistenza a
farmaci di I e II linea
Permette di definire casi di MDR ed XDR
Semplice da eseguire
MA
• Numero limitato di sonde
• Possibilità di errore nell’interpretazione
• Richiesto laboratorio BSL2
Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience)
farmaci I LINEA (rifampicina, isoniazide)
Genotype MTBDRsl (Hain Lifescience)
farmaci II LINEA (fluorochinolonici, kana/amikacina, etambutolo)
Gene-Xpert System (Cepheid)
Real-Time PCR per la diagnosi di M. tuberculosis
complex e sensibilità alla rifampicina
Resistenza alla Rifampicina = “gold target”
• Key-drug per il regime di trattamento
• la resistenza alla RIF è il marcatore surrogato per TB-MDR,
80-95% of ceppi RIF-resistenti sono anche INH-resistenti
• le mutazioni sono concentrate in una regione di 81 paia di
basi“hotspot” del gene rpoB
Candidato ottimale per la diagnosi molecolare di
resistenza al farmaco
• Closed reaction tube
• Use proprietary dried reagent technology
• Utilize dedicated of cartridges
• Proprietary filter capture/lysis
technology, purification resins, integrated
ultrasonics
• Total internal control of reagent system
• Automated data reduction and results
interpretation
•sputum and other samples
•simple 1-step external sample prep. procedure
•time-to-result < 2 h
•no need for biosafety cabinet
•integrated controls
•specific for MTB
•sensitivity similar to culture
•detection of rif-resistance via rpoB gene
•~1 day technician training for nonmycobacteriologists
GeneXpert® system
Automated sample processor and quantitative thermal cycler
Single-use, disposable cartridges
Boheme at al, NJM 2010
Xpert MTB Quality Controls
• Sample-processing control (SPC) — Ensures the sample was
correctly processed.
• Internal control (IC) —Verifies the performance of the PCR
reagents and assesses the presence of sample inhibitors.
SPC and IC should be positive in a negative sample and can be
negative in a high-positive sample.
• Probe check —Before the start of the PCR reaction System
measures the fluorescence signal from the probes to monitor
bead re-hydration, reaction-tube filling, probe integrity and dye
stability.
Xpert MTB/RIF Analytical Studies
• Analytical Sensitivity of approximately approx 150 cfu/ml (Smear 10,000
cfu/ml)
• Specificity tested with high concentrations of MOTT (Mycobacteria Other
ThanTuberculosis)
• No evidence of amplicon cross-contamination
• Perfect score on QCMD TB Proficiency Panel
• Mutation detection capability confirmed with isolate DNA and artificial
targets having a global frequency reported at > 0.005
Recommended use of Xpert MTB/RIF
• The Xpert MTB/RIF Assay is intended for rapid detection of M.
tuberculosis complex and rifampicin resistance in adult patients in
respiratory specimens with clinical suspicion of tuberculosis
• The assay can be use on smear-positive and smear-negative samples
• The assay is a semi-quantitative in-vitro diagnostic test
• The Xpert MTB/RIF assay is not intended for use in
treatment monitoring
Amplification plot – TB not
detected
Amplification plot – TB
positive/Rif sensitive
Xpert MTB/RIF
Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B)
in campioni respiratori
A
Colture
positive
Colture
negative
B
Colture
positive
Colture
negative
Xpert MTB
presente
22
2
Xpert RIF
sensibile
18
2
Xpert MTB
assente
0
5
Xpert RIF
resistente
4
0
Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B)
in campioni non respiratori
A
Colture
positive
Colture
negative
B
Colture
positive
Colture
negative
Xpert MTB
presente
2
2
Xpert RIF
sensibile
2
2
Xpert MTB
assente
0
3
Xpert RIF
resistente
0
0
Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B)
di colture in terreno solido LJ (7 campioni) e liquido MGIT (5 campioni)
A
Colture
positive
Colture
negative
B
Colture Colture
positive negative
Xpert MTB
presente
11
0
Xpert RIF
sensibile
11
0
Xpert MTB
assente
1
0
Xpert RIF
resistente
0
0
AnyplexTM plus MTB/NTM Detection (Seegene)
AnyplexTM plus MDR-TB Detection (Seegene)
Real-time detection of MTB, NTM and DR-TB (DR-TB; INH-R, RIF-R)
Simultaneous screening of 6 mutation sites (INH-R) and 15 mutation sites
(RIF-R)
Various specimen (Sputum, Culture, Fresh tissue)