METODO NAZIONALE STANDARD
CONTEGGIO DI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
W 10
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Specialist and Reference Microbiology Division
CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
Revisione no: 3.3 Data di revisione: 03.05.05 Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory in collaborazione con il Water
Working Group and the Environmental Surveillance Unit, CDSC.
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle
informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza
sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del
paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard minimo
per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali Standard, i
laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche addizionali. I
metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di consenso
ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti elaborati
riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina, sono
membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del logo di una
organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi
standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi Nazionali
Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle dell’organizzazione di cui sono
membri. L’elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può essere ottenuto tramite e-mail
all’indirizzo [email protected].
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure
commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state validate e
dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità interno ed
esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la
Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile
dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle informazioni
contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa generale per i
professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà ricorrere ad altri
consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si deve porre in
evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection Agency (HPA) dovrà
essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad essa
confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni riferibili
alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò significa
prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo sviluppo
dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected].
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se
si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non
sarà aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2004). Enumeration of Staphylococcus aureus by membrane filtration. National
Standard Method W 10 Emissione 3. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD .............................................................................................
2
INDICE ............................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ..........................................................................................................................
4
INTRODUZIONE ..............................................................................................................................................
5
SCOPO ………………………………………………………………………………………………………………
GENERALITA’ ……………………………………………..…………………………………………………………
5
5
DEFINIZIONI ...........................................................................................................................................
6
STAPHYLOCOCCUC AUREUS …………………………………………………………………………………………
6
2.0
PRINCIPIO ............................................................................................................................................
6
3.0
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..............................................................................................
6
1.0
3.1 PRELIEVO DEL CAMPIONE ……………………………………………………………………………………
3.2 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ……………………………………………………………
3.3 PROCEDURA SUL CAMPIONE ……………………………………...…………………………………………
6
6
6
4.0
ATTREZZATURA ...................................................................................................................................
6
5.0
TERRENI DI COLTURA E REAGENTI ...................................................................................................
7
6.0
PROCEDURA SUL CAMPIONE ...........................................................................................................
8
6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ………………………………………………………………………………
6.2 FILTRAZIONE ED INCUBAZIONE ………………………………………..………………………………………
6.3 CONTEGGIO DELLE COLONIE ……………………………………….…………………………………………
6.4 PROVE DI CONFERMA …………………………………………………………………………………………
8
8
8
8
7.0
CALCOLO DEI RISULTATI .................................................................................................................
9
8.0
REFERTO ..............................................................................................................................................
9
9.0
CONTROLLO DI QUALITA’ ..................................................................................................................
9
DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA PER CONTEGGIO DI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE .......................................................... 11
BIBLIOGRAFIA
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento
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controllato
Titolo del documento controllato Procedura Operativa Standard per Conteggio di Staphylococcus aureus
con membrana di filtrazione
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di
questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
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Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento
controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio.
Modifica
Numero/
Data
5/
03.05.05
Emissione no.
Scartata
3.2
Inserita
Emissione
no.
3.3
Pagina
Sessione(i)
interessate
Modifica
1
Prima pagina
Modificata
2
Stato del
documento
Revisionato
4
Pagina della
procedura di
modifica
Ridisegnata
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PROCEDURA OPERATIVA STANDARD PER
CONTEGGIO DI STAPHYLOCOCCUS AUREUS CON
MEMBRANA DI FILTRAZIONE
INTRODUZIONE
Scopo
Il presente metodo è applicabile al conteggio di Staphylococcus aureus in campioni d’acqua di piscine, bagni
idroterapici ed acque delle stazioni termali.
Generalità
S. aureus appartiene alla flora residente dell’uomo in sede nasale, cutanea, del tratto respiratorio ed intestinale, e
diffonde immediatamente quando si immerge il corpo nell’acqua. E’ abitualmente presente in ambiente
ospedaliero e sono note le sue potenziali capacità di causare infezioni; è presente anche negli animali. S. aureus
è stato considerato un indicatore nelle acque di balneazione, incluse quelle di piscina e di mare. S. aureus non è
di solito presente nelle forniture di acque potabili, ma la sua ricerca può essere richiesta negli stabilimenti
alimentari, farmaceutici e negli ospedali. Nessun metodo è stato diffusamente accettato per l’isolamento
dall’acqua di S. aureus .
Il metodo di seguito riportato è di tipo sperimentale e si avvale di quello descritto nel Report 711 per il conteggio
degli stafilococchi.
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1.0 DEFINIZIONI
Staphylococcus aureus
Microrganismo che forma tipiche colonie sulla membrana trasferita sul terreno selettivo descritto in questo
metodo e che presenta reazioni positive alla DNasi ed alla coagulasi o a prove commerciali equivalenti.
2.0 PRINCIPIO
Il volume di acqua in prova è filtrato e la membrana trasferita su un agar sale mannite modificato con
aggiunta di sodio azide allo 0.005 % (5ASM). Questo è il terreno M-5LSMA di Stengren e Starzyk2
modificato, privo di tuorlo d’ovo. Il terreno contiene cloruro di sodio (7.5%) e sodio azide (0.005%) che, in
associazione, consentono la selezione degli stafilococchi e sopprimono micrococchi e bacilli Gram
positivi. Contiene mannitolo come carboidrato fermentabile, rosso fenolo come indicatore di produzione di
acido. L’incubazione a 30°C per 42 – 44 ore consente allo S. aureus di sviluppare la caratteristica
pigmentazione.
6-15
3.0 CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA
Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia.
3.1
Prelievo del campione
N/D
3.2
Trasporto e conservazione del campione
E’ essenziale l’adeguamento alle attuali regolamentazioni della posta e del trasporto.
3.3
Procedura sul campione
•
•
Deve essere posta attenzione nella rimozione di oggetti dai bagni di bollitura dopo disinfezione
In questo metodo il sodio azide è utilizzato come componente del terreno. Questo composto, se ingerito o
inalato, è molto tossico, e si deve prestare attenzione quando lo si manipola. Le soluzioni che contengono
azide non devono essere smaltite in scarichi metallici perché possono formare composti esplosivi. Le
azidi possono essere neutralizzate con abbondante trattamento per mezzo di soluzioni contenenti nitrito.
Il sodio azide è contenuto nel terreno a concentrazione molto ridotta e la tossicità è scarsa; la sua
manipolazione è comunque sicura e può essere smaltito dal laboratorio in modo normale
Le seguenti indicazioni devono essere supplementate con le indicazioni del COSHH locale e con
la valutazione del rischio
4.0 ATTREZZATURA
Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere:
•
•
•
•
Membrane di filtrazione di tipo diverso
Imbuti da filtro graduati da 50 e 100 mL
Recipienti di pirex per il vuoto con rivestimento protettivo: ampia capacità, 5L
Pompa a vuoto, con raccoglitore di umidità o filtro protettivo, o sorgente alternativa di vuoto
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•
•
•
•
•
•
•
Termostato: 30°C ± 1°C
37°C ± 1°C°
Pinze di acciaio inossidabile a punta piatta
Bagno per bollitura (strumento di sterilizzazione)
Piastre di Petri
Filtri di estere di cellulosa da 0.45 µm con griglia
Pipettatori automatici e punte di pipette sterili associate per la distribuzione fino a 10 mL ed 1 mL
(opzionali)
Pipette (sterili a svuotamento totale) da 10 mL ed 1 mL graduate a 0.1 mL di volume (opzionale)
5.0 TERRENI DI COLTURA
Si possono utilizzare terreni disidratati pronti all’uso disponibili in commercio con formulazione
equivalente; seguire le indicazioni della ditta produttrice.
Diluente peptone salino (Diluente di maggior isolamento)
Peptone
Cloruro di sodio
Acqua
pH 7.0 ± 0.2 a 25°C
1.0 g
8.5 g
1L
Soluzione di Ringer a un quarto di concentrazione
Cloruro di sodio
Cloruro di potassio
Cloruro di calcio, anidro
Bicarbonato di sodio
Acqua
2.25 g
0.11 g
0.12 g
50 mg
1L
Agar sale mannite con 0.005% di sodio azide (5ASM))
Estratto di manzo
Peptone
D(-) mannitolo
Cloruro di sodio
Sodio azide
Rosso fenolo
Agar
Acqua
pH 7.4 ± 0.2 a 25°C
1.0 g
10.0 g
10.0 g
75.0 g
50 mg
1 25 mg
15.0 g
1L
Agar sangue
Agar Columbia o qualsiasi altra base disponibile con 5% di sangue di cavallo
Agar DNasi
Triptosio
Acido desossiribonucleico
Cloruro di sodio
Agar
Acqua
pH 7.3 ± 0.2 a 25°C
0
20.0 g
2.0 g
5.0 g
12.0 g
1L
Acido cloridrico (1 N)
o
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Soluzione di blu di toluidina
Blu di toluidina
Acqua
0.1 g
100 mL
Reagente per la coagulasi
Plasma di coniglio o altre alternative commerciali equivalenti al plasma di coniglio.
6.0 PROCEDURA SUL CAMPIONE
6.1
Preparazione del campione
I campioni idrici devono essere ricevuti e manipolati come descritto nella SOP: W 1 Sezione 5. In breve, la
tipologia della richiesta e le condizioni del campione devono essere registrate alla sua accettazione e
conservati a 2° - 10°C. I campioni devono essere analizzati il più presto possibile, nel giorno del prelievo.
In circostanze eccezionali, se si verifica un ritardo, la conservazione, nelle condizioni indicate in
precedenza, non dovrebbe prolungarsi oltre le 24 ore prima dell’inizio delle analisi.
Seguire le procedure descritte nella SOP: W 1 Sezione 5; selezionare volumi idonei per le analisi e
approntare le diluizioni richieste.
6.2
Filtrazione ed incubazione
Seguire le procedure descritte nella SOP 1 Sezione 5; filtrare un determinato volume di campione con una
membrana.
Per le acque di qualità potabile utilizzare 100 mL. Trasferire la membrana su agar sale mannite con
0.005% di sodio azide (5ASM) ed inserire in termostato a 30°C ± 1°C per 48 ± 2 ore.
6.3
Conteggio delle colonie
Dopo incubazione, contare tutte le colonie sospette positive per S. aureus che assumono colori con
gradazioni dal bianco al crema al giallo.
6.4
Prove di conferma
Selezionare le colonie per la conferma come descritto nella SOP 1 Sezione 5; utilizzare le prove di
conferma della DNasi e produzione di coagulasi. Seminare le colonie su una piastra di agar DNasi e sulla
sezione di una piastra di agar sangue. Inserire le piastre in termostato a 37 ± 1°C per 18 – 24 ore.
Produzione di DNasi
Ricoprire la piastra DNasi con soluzione di blu di toluidina (SBT) o con acido cloridrico normale (HCl).
Dopo circa 30 secondi scartare l’eccesso del reagente (SBT o HCl) in un contenitore per rifiuti chimici.
Le reazioni positive si manifestano nel modo seguente:
Soluzione blu di toluidina: colonie circondate da una zona rosa su fondo blu.
Acido cloridrico: colonie con zona di chiarificazione delimitata.
Produzione di coagulasi
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Utilizzando la crescita su agar sangue (AS), eseguire la prova della coagulasi sui ceppi che hanno fornito
positività alla prova della DNasi. Portare il plasma di coniglio a temperatura ambiente, (10 – 15 minuti)
prima dell’uso, e procedere come di seguito descritto:
Porre due gocce di acqua su un vetrino da microscopio e preparare in ciascuna una sospensione densa
con una colonia prelevata da AS. Miscelare un’ansata di reagente non diluito della coagulasi in una delle
due gocce. La presenza di coagulasi legata è dimostrata dalla comparsa di agglutinazione entro 5 –10
secondi con assenza di autoagglutinazione nella seconda sospensione batterica.
Per le confezioni di prodotti commerciali seguire le indicazioni del produttore.
Le colonie sono confermate come S. aureus se sull’agar sangue presentano l’aspetto caratteristico e
sono positive alle reazioni della DNasi e coagulasi.
7.0 CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolare il numero delle colonie sospette nel modo seguente:
Numero delle colonie presunte positive / 100 mL =
Numero di colonie contate x 100
Volume analizzato
Seguire le procedure descritte nella SOP 1 Sezione 7, calcolare il numero di S. aureus confermati rilevati
nel campione originale.
8.0 REFERTO
Refertare i risultati secondo le procedure descritte nella SOP 1: W 1 Sezione 9.
Se non sono riscontrati S. aureus refertare:
‘Non riscontrati in 100 mL’
Se il microrganismo ricercato e presente, refertare:
‘a in 100 mL’
Ove a è il numero confermato.
9.0 CONTROLLO DI QUALITA’
Membrana di filtrazione
Quando si utilizza la tecnica di filtrazione con membrana, devono essere eseguite le procedure per il
controllo di qualità interno almeno una volta al mese in funzione del carico di lavoro del laboratorio. Se in
una sessione analitica si utilizza più di un lotto di terreno, è necessario ripetere il controllo di qualità per
ciascun lotto.
I controlli di qualità interni qualitativi sono eseguiti utilizzando sospensioni di microrganismi di controllo
positivi e negativi noti per contenere meno di 100 unità formanti colonia per il volume filtrato.
Controllo positivo
Preparare una sospensione di S. aureus NCTC 6571
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Controllo negativo
Preparare una sospensione di Escherichia coli NCTC 9001
Bianco di controllo
Filtrare 1 L di acqua distillata sterile, diluente peptone salino o soluzione diluente di Ringer ad un quarto di
concentrazione utilizzando lo stesso imbuto usato per il controllo positivo dopo la sua sterilizzazione.
Incubare tutte le prove e processare in modo contemporaneo con quelle dei campioni di routine.
Prove di conferma
La piastra di DNasi deve essere seminata con S. aureus NCTC 6571, come controllo positivo, e con S.
epidermidis NCTC 11047 come controllo negativo.
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Diagramma di flusso che illustra la procedura di conteggio di Staphylococcus aureus
con membrana di filtrazione
Trasportare in laboratorio a 2°C –10° C senza esporre alla luce solare diretta
Ø
Conservare a 2 oC – 10oC al buio ed analizzare i il più presto possibile, nel giorno del prelievo,
altrimenti
entro 24 ore dal prelievo
Ø
Miscelare il campione in modo adeguato e preparare le diluizioni necessarie
Ø
Filtrare
Ø
Trasferire la membrana su mannitol salt agar con 0.005% di sodio azide (5ASM)
Ø
Incubare a 30oC per 48 ore
Ø
Contare le colone che presentano colore da bianco al crema giallo.
Ø
Eseguire sottocolture si agar DNasi ed agar sangue, incubare a 37 oC per 18-24 ore
Ø
Identificare le colonie di S. aureus usando la coagulasi su vetrino e la prove della DNasi
Ø
Calcolare il conteggio di S. aureus confermati
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Associated Materials .London; 2002. See http://www.environmentagency.gov.uk/science/219094/399393/401849/?lang=_e&region=&projectstatus=&theme=&s
ubject=&searchfor=SCA&topic=&area=&month
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hazard and categories of containment, 4 ed. Suffolk: HSE Books; 1995 (with supplements 1,
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Code of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; 2002
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healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; April 2002
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NHS Estates. Health Building Note 15. Accommodation for pathology services. 1st ed. London:
Her Majesty’s Stationary Office (HMSO); 1991 (Out of print – 2nd edition in press)
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London: British Standards Institution (BSI); 2000
10
BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to
be exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation.
London: British Standards Institution (BSI); 1992
11
BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use
and maintenance. London: British Standards Institution (BSI); 1992
12
Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of
microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; 2001
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