Affidabilita` di un’analisi.
- Specificita`:
- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)
- controllo additivita` degli effetti interferenti
- Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria)
al valore vero (media della popolazione).
L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso:
- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.
- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero
- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme
al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici:
deviazione standard s 
 (x  x)
2
(n  1)
CV%=s/quantita` *100
La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi
- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.
concetti collegati sono:
- rapporto segnale/rumore (S/N)
- minima quantita` rivelabile (LOD)
- minima differenza rivelabile
Standardizzazione e Calibrazione
- Metodi Assoluti.
Sono metodi basati su una reazione chimica nota che va a completezza.
Peso: gravimetria; elettrogravimetria; trmogravimetria
Volume: titrimetria; gasometria
Carica tot: coulombometria
- Metodi Comparativi
Sono quei metodi analitici che richiedono una calibrazione con standard noti
al fine di ottenere risultati accurati.
La calibrazione consiste nel determinare la relazione tra la
Grandezza misurata (y) e la concentrazione dell’analita (C)
y = f(C)
y = mC [+b]
y = m log(C)
La calibrazione richiede la disponibilita` di standard primari.
Nei metodi classici di analisi si usano standard primari e secondari.
Funzioni di calibrazione lineari
y = mC + b
y=parametro misurato
C=concentrazione
m=costante di proporzionalita`
b=termine costante (es. valore del bianco, errore determinato)
ERRORE DETERMINATO - errore misurabile e definito di cui si puo` tenere conto
durante l’analisi.
ERRORE INDETERMINATO - errore che deriva dall’incertezza delle misure. E`
incongnito e non puo` essere controllato dall’analista. Produce una dispersione
dei risultati di misure ripetute che puo` essere valutata solo tramite test
statistici.
Poiche` i punti di una calibrazione non cadono mai precisamente su una retta, si
cerca la retta migliore col metodo della regressione lineare basata sul metodo
dei minimi quadrati.
Presupposti del Metodo dei minimi quadrati:
- le variabili indipendente (C) e dipendente (y) sono legate da una
relazione lineare;
- non vi sono errori associati ai valori noti di C degli standard.
Tutto l’errore sta nella misura di y;
- non vi sono dati che cadono fuori dal pattern statistico di
distribuzione normale.
Coefficiente di correlazione
(Pearson):
Grafici di calibrazione non lineari
quando vi sono deviazioni dalla linearita` si puo`
operare in modo da:
1) trasformare una o entrambe
le variabili (indip. e dipend.) e rendere la
relazione tra le due di nuovo lineare
y  k 10 aC 
 log y  log k  aC
10ay  kC 
 ay  log k  log C
2) ricorrere alla regressione nonlineare
svantaggi legati al punto 2):
maggiore complessita` del metodo;
errori maggiori legati alla procedura;
necessaria buona conoscenza del metodo e dell’algoritmo applicato
Metodi di aggiunta standard
Non potendo eliminare o tenere esattamente conto di tutte le interferenze dovute alla matrice,
la calibrazione viene svolta in presenza della matrice stessa.
Presupposti:
- relazione lineare tra parametro misurato (y) e concentrazione (C) dell’analita (y=mC)
- il metodo analitico non deve avere metodo determinato.
Se la relazione e` del tipo y=mC+b, m deve essere nota.
-la matrice non deve contenere specie che rispondolo come l’analita (ma con m in genere
differente).
AGGIUNTA DI STANDARD SINGOLA
se
si ha
y 0 = misura prima dell’aggiunta
C = conc. incognita dell’analita
C s = conc. dello standard nella soluzione dopo aggiunta
yi = misura dopo aggiunta
y0  mC
yi  m(C  Cs )
si ricava
C
y0 C s
yi  y 0
se le variazioni di volume non sono significative
volendo tener conto anche del volume dello standard aggiunto:
y0  mC


V
yi  m C 0  Cs 
 Vo  v

C
y0Cs (V0  v)
yi (V0  v)  y0V0
SVANTAGGI:
- nessun controllo su eventuali errori commessi durante la misura o l’aggiunta
- nessuna media che “abbatta” gli errori indeterminati
- nessun modo di rivelare agenti interferenti o mascheranti
METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD
si eseguono n aggiunte di standard contenente l’analita.
dopo ogni aggiunta si ha (transcurando le variazioni di volume):
si riarrangia in yi 
per
yi  0
si ricava
y0Cs ,i
C
C
yi
 y0
y0 C
y0
C s ,i  C
C
volendo tener conto della diluizione, si ha:
da cui riarrangiando
yi
C s ,i
C
y0Cs ,i (V0  v)
yi (V0  v)  y0V0
V0  v y0 V0  v

C s ,i  y0
V0
C V0
y0Cs ,i
yi  y0
METODO DELL’AGGIUNTA MULTIPLA DI STANDARD
VANTAGGI:
- l’errore indeterminato viene mediato dall’interpolazione grafica (regressione)
- e` spesso possibile rivelare errori dovuti all’operatore (es. discontinuita` della retta)
- e` spesso possibile identificare la presenza di interferenti e/o effetto matrice
- permette una determinazione quantitativa senza conoscere la matura della matrice
SVANTAGGI:
- e` un metodo di estrapolazione e quindi meno preciso di quelli per interpolazione
(regressione)
- ogni determinazione richiede la ripreparazione degli standard e la costruzione della curva di
calibrazione
Le aggiunte sono in genere tutte uguali e il loro numero dipende da:
- estensione del campo di linearita`
- precisione richiesta
La quantita` aggiunta e` solitamente dello stesso ordine di grandezza di quella del campione.
CONFRONTO TRA PROCEDURE DI CALIBRAZIONE.
curva di calibrazione
(validita` limitata all’immediata determinazione)
(influenza dell’effetto matrice)
Metodo delle Aggiunte Standard
Metodo dello Standard Interno
Metodi dello Standard Interno
I metodi di costruzione della curva di calibrazione e di aggiunta standard presuppongono:
1) precisa conoscenza dei volumi di campione e di standard
2) costanza e ripetibilita`dei fattori che influenzano la misura
Poiche` per alcune tecniche analitiche questo non e` sempre vero
(vedi stabilita` nel tempo del detector), nasce la necessita` di confrontare la misura con
quella fornita da uno standard interno aggiunto sia agli standard della calibrazione, sia
al campione da analizzare.
Conseguenze: la variabilita` dei fattori che influenzano la misura si esplicitano sia sull’analita
sia sullo standard interno e il rapporto delle loro risposte si mantiene costante
(a parita` di concentrazione): maggior affidabilita` analitica e durata della curva di calibrazione.
consideriamo
y  kmC
come l’equazione che esprime la risposta strumentale ad una certa concentrazione di due
composti chimici diversi 1 e 2. Si avra` quindi:
analita
st. interno
se y1 e
R
y2
y2  k 2 m2C2

derivano dalla stessa analisi, si ha
m1
 cost
m2
da cui:
y1  k1m1C1
y1 m1k1 C1

y 2 m2 k 2 C 2
k1  k2
e
FATTORE DI RISPOSTA
y1
C
R 1
y2
C2
METODO DELLO STANDARD INTERNO SINGOLO:
1) si determina il valore di R da un’analisi fatta su un campione (+standard) noto
2) si aggiunge una quantita` nota di standard al campione e si determina:
C1 
y1 C2
y2 R
METODO DELLO STANDARD INTERNO MULTIPLO:
si ripete la misura su soluzioni contenenti conc. variabili di analita
e conc. costante di standard interno C2
C1
Il METODO DELLO STANDARD INTERNO puo` essere applicato attraverso:
- l’uso dei fattori di risposta:
y A mA C A

y IS mIS C IS

yA
C
R A
y IS
C IS

R
y A C IS
y IS C A
partendo da un campione incognito, si prepara un campione in cui l’analita e` presente in
quantita` incognita x e lo standard interno e` presente in quantita` nota z
yx
C
R x
yz
Cz

Cx 
yx Cz
yz R
-l’uso della retta di calibrazione:
si preparano vari campioni contenenti quantita` note di analita e la stessa quantita` di
standard interno
CONFRONTO FRA METODO DELLO ST. INTERNO SINGOLO E MULTIPLO:
- tempi di analisi: il metodo dello st. singolo e` molto piu` rapido: una volta determinato R basta
una sola misura, anche per piu` analiti (di cui sia noto il rispettivo R) in simultanea
- affidabilita` dei risultati: il metodo dello st. singolo e` meno affidabile perche` basato su una singola
misura che puo` contenere errori casuali gravi, non mediati
- importanza della linearita`: nel caso dello st. singolo R e` assunto rigorosamente costante, mentre
con lo st. multiplo si costruisce una curva di calibrazione che potrebbe anche non essere lineare.
Le condizioni necessarie per poter applicare questi metodi sono:
- disporre di uno st. interno molto simile all’analita (chimicamente oppure in funzione della tecnica di analisi)
- lavorare all’interno del range operativo lineare
- se si utilizza un metodo di trattamento del campione e` necessario conoscere i recuperi relativi
per l’analita e lo st. interno e correggere quindi le concentrazioni per tali fattori.
SCELTA DELLO STANDARD INTERNO:
un buon St. Interno deve essere:
- omologo all’analita (proprieta` chimiche e fisiche simili)
- separabile dall’analita e dagli altri componenti del campione
- non presente nel campione originale
- non deve dare reazioni chimiche o altre interferenze col campione
- miscibile col solvente impiegato per l’analisi
maggiore accuratezza e precisione
(~0.5%) rispetto ad altre
procedure di calibrazione (~1-2%)
METODO DELLA NORMALIZZAZIONE INTERNA:
Non e` previsto confronto con alcun standard.
La somma delle aree dei picchi (es. analisi cromatogr.) e` posta = 100 e le aree dei singoli picchi
sono riportate come %
CASO 1: la risposta del rivelatore e` la stessa per tutti i campioni.
In questo caso la conc. % dei componenti = AREA%
CASO 2: i componenti danno risposte diverse.
Si devono determinare i fattori di correzione o fattori di risposta da un cromatogramma
di composizione nota. I fattori di correzione possono anche essere non assoluti ma relativi
a quello di un componente, posto = 1.
Requisiti. tutti i componenti devono essere:
- presenti e visibili nel cromatogramma
- disponibili e reperibili per poter determinare il fattore di risposta
Affidabilita` di un’analisi.
- Specificita`:
- esistenza di sostanze interferenti (dovrebbero essere assenti o in conc. nota)
- controllo additivita` degli effetti interferenti
- Accuratezza: bonta` di approsimazione del valore sperimentale (media campionaria)
al valore vero (media della popolazione).
L’accuratezza di una procedura analitica viene stabilita attraverso:
- metodo assoluto: analisi campioni noti; analisi di standard.
- metodo comparativo: confronto con altre tecniche; metodo del recupero
- Precisione: ripetibilita` del metodo analitico. La precisione deve essere fornita insieme
al risultato dell’analisi ed e` valutata per mezzo di parametri statistici:
deviazione standard s 
 (x  x)
2
(n  1)
CV%=s/quantita` *100
La precisione ottenuta dipende da quella di tutti gli strumenti impiegati per l’analisi
- Sensibilita`: rapporto tra risposta strumentale e quantita` dell’analita.
concetti collegati sono:
- rapporto segnale/rumore (S/N)
- minima quantita` rivelabile (LOD)
- minima differenza rivelabile
METODO DEL RECUPERO:
Il recupero si valuta misurando concentrazioni di analita aggiunte a campioni reali (campioni
spiked).
Recupero(%) = [( C1 - C2 ) / C3 ]·100
dove:
•C1: concentrazione dell'analita misurata dopo l'aggiunta
•C2: concentrazione dell'analita misurata prima dell'aggiunta
•C3: concentrazione aggiunta
Tanto più il recupero è prossimo al 100% tanto il risultato è buono sebbene un recupero del
100% non indichi necessariamente l'assenza di errori. Il risultato finale dell'analisi può essere
espresso tenendo conto della correzione apportata in funzione del recupero. È possibile
ottenere anche valori superiori al 100%.
Solitamente un metodo analitico prescrive che si debba rientrare entro un ben definito
intervallo di valori di recupero.
CONFRONTO FRA TECNICHE ANALITICHE.
(validazione di metodi)
RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N)
RAPPORTO SEGNALE/RUMORE (S/N) e
LIMITE DI RIVELABILITA` (LOD)
LOD e` definito come:
se non e` presente un bianco da
analizzare si puo` utilizzare
la dev. st. della regressione
questo e` il metodo piu` preciso per determinare LOD
perche` utilizza insieme retta di regressione e concetti di statistica