Canali Voltaggio-dipendenti per il Ca2+
La struttura molecolare dei canali del Ca2+ è nel suo insieme del tutto simile a quella dei
NaV, sebbene (piccole) differenze nelle sequenze cambino profondamente la selettività, il
gating e la sensibilità ai farmaci.
Le subunità alfa sono costantemente associate a subunità accessorie, in numero maggiore
di quelle del Na+: α2, β, γ e δ.
I canali del Ca VD sono tutti bloccati (pur con sensibilità diverse) dal Cadmio (Cd2+) e
dai “metalli pesanti” (Ni2+, Co2+ e La3+).
Organizzazione strutturale dei canali del Ca VD
Subunità a1: 4 domini omologhi (IIV), con 6 segmenti transmembrana
ciascuno;
Subunità b: intracellulare, costituita
da più a eliche;
Subunità a2d: in giallo le regioni
idrofobiche;
I siti di interazione tra le subunità
sono indicati da frecce bipolari.
Classificazione in base alle proprietà elettrofisiologiche:
a) Canali LVA (low-voltage-activated (-70mV); avendo una spiccata
inattivazione voltaggio-dipendente, sono stati chiamati canali T (“transient”).
Sono sensibili all’amiloride.
b) Canali HVA (high-voltage-activated (-30m/-20V); hanno un’inattivazione
molto più lenta.
Correnti di Ca HVA
0 mV
Correnti di Ca LVA
-40 mV
400 pA
100 pA
30 ms
30 ms
Poi s’è visto che si tratta di una famiglia comprendente molti membri, che sono stati
indicati da lettere (P, Q, R ecc.)
I diversi sottotipi di canali del Ca inattivano in maniera differente
a1C (L)
a1E (R)
50 ms
a1G (T)
Possibile modello di inattivazione VD dei canali del Ca
Il linker intracellulare tra i domini (pseudosubunità) I e II potrebbe agire da particella
inattivante che fisicamente occluderebbe il poro del canale interagendo, almeno in parte,
con le regioni S6 dei domini II e III del canale. La subunità b del canale del Ca si associa
con il linker tra i domini I-II modificando le proprietà dell’inattivazione; essa potrebbe
interagire sia con la subunità a1 che con la membrana.
Possibile modello di inattivazione Ca-dipendente dei canali del Ca
Un’elevata concentrazione di Ca intracellulare innesca l’inattivazione dei canali di tipo L. Il
sensore per il Ca sarebbe una molecola di calmodulina (CaM). CaM è costitutivamente legata
al complesso del canale. L’inattivazione avverrebbe tramite un’interazione Ca-dipendente
della CaM legata con un motivo IQ-simile sulla coda carbossilica di a1C. È possibile che un
meccanismo analogo intervenga anche a livello dei canali N, P/Q ed R (Peterson, Neuron, 1999).
CHIUSO
APERTO
INATTIVATO
Ca2+
Voltaggio
•
•
•
•
Nello stato chiuso (iperpolarizzato) l’accesso della CaM alla regione IQ-simile è ridotto.
Nello stato aperto (depolarizzato) la CaM legata ha un rapido accesso al dominio IQ-simile.
L’accumulo di Ca2+ sulla bocca interna del canale porta all’attivazione Ca-dip. della CaM.
L’interazione di CaM-Ca2+ con la regione IQ-simile induce l’inattivazione del canale.
Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo L
I canali “L” o recettori per le di-idro-piridine (DHP, come la
Nifedipina o la nimodipina) hanno un’enorme importanza in
Fisiologia. Sono tipici del muscolo scheletrico, ma sono presenti
anche nel cuore (*), nella muscolatura liscia e nel sistema
nervoso.
Hanno un’inattivazione piuttosto lenta, che è anche Ca-dipendente.
(*) il bloccante Verapamil viene impiegato nella cura della tachicardia parossitica
Altri bloccanti selettivi sono naturalmente quelli appartenenti alle di-idropiridine
(nifedipina, nimodipina).
Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo liscio
Nel muscolo liscio, il reticolo sarcoplasmatico è praticamente assente. Qui
l’attivazione dell’apparato contrattile (non organizzato in sarcomeri) è totalmente
dipendente dal Ca2+ che entra attraverso i canali L della membrana plasmatica.
Il fenomeno dell’accoppiamento eccitazione  contrazione nei tessuti muscolari
illustra bene la doppia importanza dei canali del Ca2+:
• fanno entrare nella cellula ioni con carica positiva (similmente ai NaV)
• fanno anche comparire nella cellula un vero e proprio secondo messaggero (gli
ioni Ca2+) che ha uno straordinario potere regolatore di molti processi
intracellulari
Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo scheletrico
Nel muscolo scheletrico, i canali L sono addensati nei tubuli trasversi del reticolo
sarcoplasmatico, dove funzionano da “sensori del voltaggio”. Sono accoppiati
(con l’ansa di connessione II-III) ad altri canali del Ca2+ (Ca-dipendenti) presenti
nei tubuli longitudinali del ret.sarc., detti “recettori della Ryanodina”. Si attiva
così un il rilascio di Ca che attiva con grande rapidità (per feedback positivo)
l’apparato contrattile.
Modello per il rilascio voltaggiodipendente del Ca2+ (muscolo scheletrico)
RS
TT
-
+
+
A riposo
+
+
+
2+
Ca
-
Sensore
del volt.
Canale
di rilascio
Vm
-
Depolarizzata- +
-
+
+
2+
+
+
Ca
2+
Ca
Canali VD per il Ca2+ di tipo L nel muscolo cardiaco
Accoppiamento EC Cardiaco
(Ca2+-induced-Ca2+-release)
TT
+
SR
TT
Vm
Ca2+
Canale del Ca2+ Canale di rilascio
+ +
SR
Ruolo dei canali voltaggio-dipendenti per il Ca nel PdA cardiaco
(tessuto di lavoro)
Solitamente l’ingresso di Ca2+ attraverso canali VD accompagna (e prolunga) i pda al
Na+. E’ il caso delle fibrocellule muscolari scheletriche, ma soprattutto delle fibrocellule
muscolari cardiache.
Qui l’ingresso di Ca2+ non solo potenzia l’effetto
del Na+ nella fase iniziale del pda (depolarizzazione
ed overshoot), ma perdura anche quando i canali del
Na+ si sono inattivati (l’inattivazione dei canali del
Ca2+ c’è, ma è incompleta), dando luogo ad un
lungo “plateau”.
Domanda: ma se durante il plateau entrano cariche positive sotto
forma di ioni Ca2+, perché il pdm si mantiene costante <attorno
allo zero> ?
Risposta: perché durante il “plateau” la corrente entrante di Ca2+ è
esattamente controbilanciata da una corrente uscente di K+
<attraverso canali al K+ ultra rapidi
Questo lunghissimo “plateau” del pda cardiaco è funzionalmente importante per due
buone ragioni:
a) il Ca2+ che entra attraverso i canali (L) della membrana plasmatica attiverà il “Cainduced Ca-release” del reticolo sarcoplasmatico, quindi la contrazione del cuore;
b) mantenendo depolarizzata la membrana, la
rende ineccitabile per tutta la sua durata (perché
mantiene inattivati i canali del Na+).
In altre parole: durante il plateau, il cuore si
trova in uno stato di refrattarietà assoluta,
quindi per tutta la durata della contrazione (della
sistole) non può essere nuovamente eccitato.
La situazione è molto diversa da quella che si
ha nel muscolo scheletrico, nel quale la
refrattarietà assoluta termina ancor prima che
inizi la contrazione.
Il muscolo scheletrico infatti (per fortuna !) è
tetanizzabile, cioè le singole “scosse” possono
sommarsi tra loro fino alla completa fusione,
producendo un aumento della forza contrattile.
Di fatto, la maggior parte delle nostre contrazioni
sono dei “tetani”.
Il cuore invece (per fortuna !) non è
“tetanizzabile”:
qualunque stimolo “ectopico” è inefficace per
tutta la durata della sistole (I), e può produrre
una seconda contrazione (“extrasistole”) solo
mentre il cuore si sta rilasciando..
Potenziali d’azione al Ca2+ nelle cellule pacemaker cardiache
Questi pda al Ca2+ si generano spontaneamente (o meglio, per effetto dell’automatismo
tipico del pacemaker), e poi si propagano a tutte le fibrocellule del miocardio di lavoro
(che di per sé resterebbero in riposo). Queste, eccitate, genereranno i pda provvisti di
“plateau” che abbiamo visto prima.
Interazione tra canali “T” e canali “f”
L’esempio del pda (al Ca2+) del pacemaker cardiaco ci offre l’opportunità di parlare di un
altro tipo di canali voltaggio-dipendenti: i canali “f” (“funny”), espressi anche in molti
neuroni autoritmici del SNC (dove vengono chiamati canali “h”)
I canali del Ca2+ di tipo T (e in minor
misura L) sostengono il pda, ma per essere
attivati necessitano di una depolarizzazione
della membrana. Questa, nelle cellule
autoritmiche, avviene “spontaneamente” e
si chiama prepotenziale.
Nel tessuto pacemaker, il prepotenziale (e
con esso l’automatismo cardiaco) è
generato dall’apertura dei canali-f .
La struttura dei canali HCN
Appartengono alla classe dei canali HCN: “canali cationici attivati
dall’iperpolarizzazione”. Vengono attivati alla fine di ogni pda, quando la
membrana si iperpolarizza.
La loro apertura
genera una corrente
entrante
che,
depolarizzando
la
membrana, produce il
prepotenziale, quindi
il pda successivo.
Ciascuna delle 4 subunità presenta:

6-DTM come i canali Kv

S4 riconosciuto come sensore del voltaggio
nel C-terminale è presente un dominio CNB come nei canali CNG


si pensa che i canali siano formati da TETRAMERI come i canali Kv
indietro
Modulazione dei Canali “f”
Di grande importanza è la “modulazione” (variazione della sensibilità al voltaggio) dei canali f
operata dall’orto- e dal para-simpatico tramite i rispettivi neurotrasmettitori
<noradrenalina(+adrenalina) ed acetilcolina>.
Modulando i canali f, l’orto- ed il para-simpatico regolano la frequenza cardiaca (!!), come se fossero l’uno
l’acceleratore e l’altro il freno di un’automobile.
Questi neurotrasmettitori agiscono su recettori accoppiati a proteine-G e fanno rispettivamente aumentare e
diminuire il livello intracellulatre di AMPc. I canali f sono voltaggio-dipendenti, ma anche chemio-dipendenti (dal
versante intracellulare), una condizione tutt’altro che infrequente.
Canali voltaggio-dipendenti per il Ca2+ di tipo N e P/Q nell’esocitosi
Un altro esempio di enorme importanza funzionale è l’ “esocitosi regolata” di
vescicole (v. rilascio di insulina: qui sono implicati canali del Ca2+ di tipo L ) in
tutte le cellule secernenti.
Un caso particolarissimo di “esocitosi regolata” è la liberazione di vescicole
contenenti neurotrasmettitore nella trasmissione sinaptica.
Qui operano canali “N” (per neuronal, bloccati dall’ ω-Conotossina), che sono
esclusivi del SNC, ma
anche canali “P/Q” (bloccati dall’ ω-Agatossina)
ed R, per i quali non è noto alcun bloccante specifico.
La trasmissione sinaptica
La combinazione del neurotrasmettitore con i propri recettori presenti nella membrana
postsinaptica consentirà la trasmissione sinaptica
(una depolarizzazione [EPSP] nelle sinapsi eccitatorie o un’ iperpolarizzazione [IPSP]
nelle sinapsi inibitorie…)
Eventi pre-simnaptici
Questi canali sono addensati nelle terminazioni presinaptiche, dove sono essenziali per il
rilascio di neurotrasmettitore.
In particolare sono presenti al centro delle zone attive alle quali sono ancorate le vescicole
sinaptiche pronte al rilascio (“pool” di rilascio).
Le zone attive sono formazioni del citoscheletro altamente ordinate, visibili dal versante
citoplasmatico della membrana presinaptica). In corrispondenza delle zone attive, i lipidi
della membrana sono organizzati a formare dei “rafts” (zattere).
L’arrivo del pda e la conseguente depolarizzazione della membrana presinaptica apre i
canali del Ca2+ ….
…. ed il Ca2+ fa scattare un complesso sistema di controllo. La fusione delle vescicole
promossa dal Ca2+ è preceduta da fasi preliminari:
A) “Docking” (attracco) …
B) “Priming” (preparazione) …
C) “Fusione”. All’arrivo del pda si ha la fusione
Ca-dipendente, (preceduta dalla formazione di un
poro
attraverso
il
quale
passerà
il
neurotrasmettitore), che consente l’esocitosi delle
vescicole ancorate alle zone attive (“pool di
rilascio”).
Ruolo dei canali del Ca2+ al di fuori delle zone attive della membrana pre-sinaptica
Canali VD per il Ca2+ (solitamente del tipo L) sono anche presenti nella membrana
presinaptica al di fuori delle zone attive (A).
La loro attivazione (B) serve a distaccare le vescicole del “pool di deposito” dai filamenti
di actina del citoscheletro, quindi a rifornire il “pool di rilascio”.
Lo schema C illustra il processo in maggior dettaglio.
Anche in questo caso si mette bene in evidenza il ruolo del Ca2+ come secondo messaggero intracellulare !
Correnti T neuronali e spikes al Ca2+
Vhold-90 mV
Attività ritmica spontanea in un neurone talamico
Attività oscillatoria
Bursts di PdA dovuti
all’interazione della corrente di
Ca2+ IT con la corrente
pacemaker cationica entrante Ih
-65 mV
1s
-65 mV ------
Vedi
registrazione
attivazione IT
PdA al Na+
Spike al Ca 2+
Potenziale
pacemaker
rimozione
inattivazione IT
Quale meccanismo innesca questa attività autoritmica?
Organizzazione della corteccia cerebrale
La corteccia cerebrale è costituita da sei strati.
Le afferenze talamiche arrivano al IV strato.
Le fibre efferenti (motrici) partono dal V e VI strato
TALAMO
NRT
NUCLEI di RELAY
+
+
GLUT
+
GABA
afferenze
talamiche
GLUT
CORTECCIA
+
Il neurone GABAergico determina sul neurone del nucleo di relay un PPSI che genera
iperpolarizzazione e fa aprire i canali “h” innescando l’attività autoritmica in tali neuroni
NRT: nucleo reticolare del talamo
La genesi di un burst di pda in un singolo neurone del nucleo reticolare del talamo (NRT) può
generare un IPSP nelle cellule talamocorticali del nucleo di relay che è sufficientemente ampio da
generare uno spike al Ca2+ e un burst di pda.
Ampiezza e andamento temporale dell’IPSP generato nel neurone talamocorticale del nucleo di
relay dipendono fortemente dal tipo di scarica generata a livello del NRT, e viceversa.
In realtà, i neuroni talamocorticali
nei nuclei di relay del talamo
hanno due modalità di scarica
(vedi registrazioni)
In realtà, i neuroni talamocorticali dei nuclei di relè presentano anche
una seconda modalità di scarica (vedi registrazioni)
L’applicazione di ACh
o NE causa una simile
depolarizzazione dei
neuroni talamocorticali
attraverso la riduzione
di una corrente di K+ di
"leakage" attiva a
riposo.
La depolarizzazione di neuroni talamocorticali in seguito ad una iniezione intracellulare di
corrente provoca l’abolizione della scarica ritmica a burst e la sua sostituzione con un’attività
tonica. L’abolizione della scarica ritmica a burst è causata dall’inattivazione della corrente di
Ca2+ T e dalla mancata attivazione della corrente “Ih”.
Gli stadi del sonno sono caratterizzati da cambiamenti nelle registrazioni EEG
Veglia – occhi aperti
Veglia – occhi chiusi
Sonno non REM – stadio I
Sonno non REM – stadi II e III
Sonno non REM – stadio IV
Sonno REM
La sostituzione della scarica
ritmica con quella tonica è
simile alla modificazione
dell’attività elettrica che si
può registrare in corteccia
nella transizione dal sonno ad
onda lenta alla veglia (o al
sonno REM).
Sonno non-REM, Stadio IV
(SWS; Slow-Wave-Sleep ‘sonno
profondo’):
onde ampie a bassa frequenza (~1
Hz, ‘onde delta’) sono attivi pochi
neuroni ma altamente sincronizzati
Attività elettrica registrata contemporaneamente da neuroni corticali e talamici
coinvolti nel sonno SWS (Slow-Wave-Sleep) e durante la veglia
Registraz. extracell.
da neurone corticale.
Registraz. extracell.
da neurone del NRT
Registr. intracell
dal nucleo di relay.
Tali risultati indicano che tutte e tre le tipologie di neuroni esibiscono i due diversi stati dell’EEG:
Cosa suggeriscono tali risultati?
una scarica ritmica a burst durante il sonno ad onde lente, e un’attività tonica durante la veglia.
Cellule pacemaker talamiche: cosa le attiva e cosa le spegne?
• le cellule pacemaker del nucleo di relay del talamo che scaricano ritmicamente a
bursts inducono i neuroni corticali a scaricare in maniera sincrona nel pattern
dell’SWS (Slow-Wave-Sleep) dell’EEG
• durante la veglia: neuroni colinergici (ACh), noradrenergici (NE) e
serotoninergici (5-HT) sono attivi  inibiscono le cellule pacemaker talamiche
• durante il sonno SWS, l’attività delle cellule che liberano ACh, NE e 5-HT
diminuisce  le cellule pacemaker talamiche sono attive
Canali P e spikes complessi nelle cellule del Purkinje
Gli input delle fibre parallele e rampicanti hanno effetti molto diversi
sulle cellule del Purkinje
Molte fibre parallele (~200,000) prendono contatto
con una singola cellula del Purkinje (convergenza).
La scarica generata è di tipo tonico (spikes
semplici) e si sovrappone ad una attività spontanea
basale.
Un’unica fibra rampicante contatta un’unica
cellula del Purkinje formando molte sinapsi.
Ciascun singolo input genera una rapida
scarica di potenziali d’azione di latenza e
durata brevi (spikes complessi: azione
fasica rapida).
Si ritiene che l’attivazione delle fibre muscoidi possa rendere silente per alcune
centinaia di ms la scarica evocata nelle cellule del Purkinje dalle fibre rampicanti
Spikes semplici e complessi generati dalle cellule del Purkinje
Le cellule di Purkinje generano potenziali d’azione spontanei anche in assenza di
inputs sinaptici. La frequenza media durante la veglia è di circa 40 Hz (40 spikes
per sec). La frequenza può aumentare per stimolazione delle fibre parallele.
I treni in figura mostrano una mistura di cosiddetti spikes semplici e complessi.
Spikes semplici
50 ms
Gli spikes semplici sono prodotti da
una combinazione di attività basale
e di inputs dalle fibre parallele.
Apertura di
canali del Ca2+
P-type
S. complessi
Gli spikes complessi sono spesso
seguiti da una pausa di alcune
centinaia di msec durante la
quale l’attività degli spikes
semplici è soppressa.
Apertura di
+
canali del Na
Uno spike complesso
è una
sequenza
stereotipata di potenziali d’azione con
intervalli molto brevi tra uno spike e l’altro
e ampiezze decrescenti.
Gli spikes complessi, (che si susseguono ad
una velocità basale di circa 1 Hz, massimo
10 Hz) sono costantemente associati
all’attivazione delle fibre rampicanti.
Origine dell’attività autoritmica degli spikes semplici
Comportamento inusuale delle correnti di
Na+ in un neurone del Purkinje del
cervelletto dopo una forte depolarizzazione:
Correnti di Na+ risorgenti
Firing spontaneo in un neurone del Purkinje
generato dalla presenza di correnti di Na+
risorgenti
Effetto di uno spike complesso a diversi stadi
Ogni ione può essere trasportato da numerosi tipi di canali ionici, ognuno
con proprietà di attivazione distinte. Questo conferisce una grande
flessibilità alla codificazione dei pda da parte dei neuroni ed è un elemento
chiave per conferire al cervello una notevole capacità computazionale.
ripolarizzazione
aumentata
Rallentamento della
scarica; aumento dell’AHP
firing
ritardato
+ KCa1
diminuzione della
risposta alla
ripolarizzazione
velocità di
firing
rallentata
La KM determina
adattamento
+ KM
+ KCa2
firing a scoppio
(burst)
La KCa determina
adattamento e AHP di
lunga durata
mancanza
di burst
depolarizzazione
(inattiva IT)
È possibile regolare la frequenza, la durata, la regolarità, il ritardo delle
scariche di pda, generando le basi per costruire il codice neuronale.
FINE