DISS. ETH. No 21227
EXPLORING SPATIAL DIVERSITY OF NEURAL STEM CELLS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc ETH Zurich)
presented by
ROBERTO FIORELLI
M.Sc. in Biology
Marche Polytechnic University, Ancona (Italy)
Born on 15.12.1979
Citizen of Italy
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Martin E. Schwab, examiner
Dr. Olivier Raineteau, co-examiner
Prof. Dr. Sebastian Jessberger, co-examiner
2013
SUMMARY
The central nervous system (CNS) is composed by a great variety of cell types,
organized in a multitude of regions of competence. During embryonic development, a
large pool of multipotent neural stem cells (NSCs) is responsible for the generation of
this remarkable diversity. Through sequential events of cell division, NSCs give rise to a
progeny that is gradually specified towards the differentiation into defined neuronal
types. To this aim, the diverse lineages of stem and progenitor cells are defined by cellintrinsic genetic programs; for example, the transcription factors giving rise to
glutamatergic neurons are different than those specifying the inhibitory lineage. The
distribution of these transcription factors contributes to regionalize the developing CNS
into specialized germinal zones, and each of those zones is responsible for the
production of a given type of neurons.
After birth, NSCs persist in defined regions of the CNS; in some of these regions, stem
cells are actively proliferating, giving rise to new neurons throughout adult life. In
particular, the subventricular zone (SVZ), surrounding the lateral ventricles, harbors
NSCs that continuosly produce neurons of the olfactory bulb. Lineage studies have
shown that location of NSCs within the SVZ correlates with the generation of specific
olfactory neurons. Thus, these observations suggest that some of the aspects governing
the regional organization during development might be conserved in the adult germinal
zones.
In other regions of the CNS, including the adult spinal cord, NSCs are also present but
their existence can only be revealed in vitro, as neurogenesis doesn’t occur at any time
during adult life. Since these cells represent a potential target for repair in case of injury
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of the spinal cord, researchers have recently started to characterize them in detail;
however, their precise lineage identity (i.e. ependymal or glial) is still nowadays debated.
The aim and novelty of my scientific endeavor was to investigate the diversity and spatial
distribution of neural stem cells in the two mentioned regions of the CNS, i.e. the SVZ
and the spinal cord. To this aim, I used transgenic mouse models to label and fate map
different populations of stem and progenitor cells in the developing and adult CNS.
The work reported in Chapter I describes the regional distribution of stem and progenitor
populations in the adult SVZ. By adopting a novel method for the unbiased quantification
of the different progenitor subpopulations in the SVZ i could show that the threedimensional distribution of cycling progenitors is not homogeneous along the walls of the
lateral ventricles, but rather shows a rostro-caudal gradient. Within the SVZ, regional
microdomains are identified by the expression of defined transcription factors.
Exhaustive quantifications of expression of the lineage-specific markers Mash1, Dlx2 or
Tbr2 show that these populations greatly vary in their size, and occupy respectively the
ventral, dorsolateral, and dorsal aspects of the SVZ.
The study descripted in Chapter II focuses on the identity of spinal cord NSCs. Using a
transgenic mouse model for the fate mapping of astroglial lineage, I show that GFAPexpressing progenitors persist in the spinal cord, which are identified as central canalcontacting astrocytes (i.e. Acc). These cells are dormant under normal conditions but
resume proliferation after an injury of the spinal cord. Using an in vitro assay, I compare
the stem cells characteristics (i.e. multipotentiality and self-renewal) of SVZ NSCs and
spinal cord Acc. My results demonstrate that Acc are a population of progenitors with
limited self-renewal capacity, while non-glial populations are spinal NSCs. Hence, this
study reconciles divergent views on the identity of spinal NSCs and emphasizes the
cellular heterogeneity of NSCs along the CNS.
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Finally, Chapter III provides an example of how the diversity of NSCs can be exploited
through the use of transgenic model. In this study, I show that the lineage-restricted
transcription factor Ngn2 can be used to fate map embryonic glutamatergic progenitors
with great spatial and temporal resolution. The inducible transgenic model described in
this study allowed the labeling of specific populations of projection neurons in defined
embryonic timepoints. Given its specificity, it might be employed in the future for a broad
number of applications for the genetic manipulation of forebrain glutamatergic neurons.
Following the three main Chapters, Appendix I presents a published study in which I
contributed through confocal and light microscopy to compare the expression of the
markers Prominin-1, LeX and ALDH in SVZ and spinal cord NSCs.
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SINOSSI
Il sistema nervoso centrale (central nervous system, CNS) e’ composto da una grande
varietà di tipi di cellule, organizzati in una moltitudine di regioni di competenza. Durante
lo sviluppo embrionale, numerose cellule staminali neurali (neural stem cells, NSC) sono
responsabili della generazione della straordinaria diversità che caratterizza il sistema
nervoso. Attraverso una sequenza di divisioni cellulari, le NSC generano cellule
progenitrici che sono gradualmente specializzate verso la differenziazione in distinti tipi
di neuroni. Vengono quindi a crearsi diverse linee di cellule staminali e progenitrici,
definite dall’espressione di specifici programmi genetici; per esempio, i fattori di
trascrizione responsabili per la differenziazione in neuroni eccitatori sono differenti da
quelli che specificano la produzione dei neuroni inibitori. La distribuzione nello spazio di
questi fattori di trascrizione regionalizza il CNS in diverse aree germinali, ciascuna di
esse specializzata per la produzione di specifiche famiglie di neuroni.
Alla fine dello sviluppo embrionale, alcune cellule staminali persistono in regioni
specifiche del sistema nervoso; in alcune di queste regioni, le NSC continuano a
dividersi e a generare nuovi neuroni durante la vita adulta. In particolare, la zona
subventricolare (subventricular zone, SVZ), che circonda i ventricoli laterali, contiene
staminali neurali che sono specializzate a produrre definiti tipi di neuroni del bulbo
olfattivo. Alcuni studi hanno dimostrato che neuroni specifici vengono prodotti in diverse
sottoregioni
della
SVZ,
suggerendo
quindi
che
alcuni
aspetti
che
regolano
l’organizzazione regionale durante lo sviluppo potrebbero essere conservati anche
durante la vita adulta.
Cellule staminali multipotenti sono presenti anche in altre regioni del CNS, compreso il
midollo spinale: la loro esistenza può essere tuttavia dimostrata solo in vitro, poiché in
queste regioni la neurogenesi non sussiste durante la vita adulta. Dato il potenziale di
queste cellule per essere utilizzate nella terapia delle lesioni del midollo spinale,
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recentemente i ricercatori hanno cercato di caratterizzarne l’identità. Tuttavia, è a
tutt’oggi argomento di dibattito se le staminali spinali corrispondano a cellule ependimali,
o siano di natura gliale.
L’obiettivo del mio lavoro è stato quello di studiare la diversità e la distribuzione delle
cellule staminali neurali nelle due regioni menzionate, la SVZ e il midollo spinale. In
particolare, ho utilizzato tre modelli di topi transgenici per marcare in vivo diverse
popolazioni di cellule staminali e progenitrici sia nel CNS embrionale sia in quello adulto.
Il Capitolo I descrive la distribuzione delle popolazioni di staminali e progenitori nelle
sotto-regioni della SVZ adulta. A questo proposito, è stato applicato un metodo
innovativo per quantificare e comparare le diverse popolazioni. Questo studio mostra
che la distribuzione di progenitori in fase proliferativa non è omogenea lungo i ventricoli
laterali, ma mostra un chiaro gradiente rostrale. Lungo la SVZ, l’espressione di definiti
fattori di trascrizione (ovvero Mash1, Dlx2, e Tbr2) caratterizza la divisione in sottoregioni. Quantificazioni esaustive dell’espressione di questi fattori di trascrizione
dimostrano che le cellule positive per Mash1, Dlx2 e Tbr2 definiscono tre popolazioni
molto diverse per entita’ e distribuzione. Nella SVZ, Mash1, Dlx2 e Tbr2 sono circoscritti,
rispettivamente, alle regioni ventrali, ventro-laterali, e dorsali, dimostrando che la
regionalizzazione di questa zona germinale persiste nella vita adulta.
Nel secondo capitolo, ho concentrato l’attenzione sullo studio dell’identità delle staminali
del midollo spinale. Ho utilizzato un modello transgenico che mi ha permesso di marcare
specificatamente le cellule gliali, caratterizzate dall’espressione di GFAP. Questo lavoro
dimostra che progenitori che esprimono GFAP sono presenti nel midollo spinale adulto.
Queste cellule, denominate astrociti del canale centrale (central canal-contacting
astrocytes, Acc), sono quiescenti nel midollo intatto mentre proliferano attivamente dopo
una lesione. Le Acc sono state successivamente comparate in vitro con le cellule
staminali della SVZ, le quali a loro volta esprimono GFAP, per i segni caratteristici delle
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staminali (ovvero proliferazione indefinita e multi potenzialità). I miei risultati mostrano
che le Acc sono una popolazione di progenitori multipotenti incapaci tuttavia di
proliferare indefinitamente. Questo studio conferma l’ipotesi che le staminali del midollo
spinale non sono di tipo gliale, come invece è il caso nella SVZ del cervello adulto.
Il capitolo III riporta un esempio di come la diversità’ delle cellule staminali può essere
sfruttata tramite l’uso di modelli transgenici. In questo studio, mostro che il promotore per
il fattore di trascrizione Ngn2 può essere utilizzato in un modello transgenico inducibile
per studiare la generazione, durante l’embriogenesi, dei neuroni eccitatori del cervello.
La ricombinazione in queste cellule può essere controllata temporalmente con grande
definizione. Per questo motivo, si propone come un valido modello futuro per un numero
di metodi di manipolazione genetica dei neuroni glutamatergici telencefalici.
Infine, ai tre capitoli principali segue l’Appendice I che presenta uno studio recentemente
pubblicato al quale ho contribuito nella parte di microscopia confocale per comparare
l’espressione dei marker Prominin-1, LeX and ALDH nelle staminali neurali del cervello e
del midollo spinale.
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