Quando degenerano intere popolazioni neuronali nel SNC?
Possibilita’ di trapianto di cellule o tessuto embrionale….
e piu’ di recente, trapianto di cellule staminali
La rigenerazione assonale dei neuroni del SNC dei
mammiferi adulti potrebbe essere indotta da un
appropriato “ambiente” cellulare
Studi condotti sul midollo spinale (Aguayo’s group, 1981) e sul nervo
ottico (Aguayo’s group, 1991) sostengono questa ipotesi
RICRESCITA ASSONALE ALL’INTERNO
di UN INNESTO di NERVO PERIFERICO
CNS: L’innesto di ponti costituiti da segmenti di nervo
sciatico permettono la crescita assonale di neruroni
posti in vicinanza del punto di inserzione
Riconnessione della retina con
il collicolo superiore attraverso
il trapianto di un nervo
periferico in un ratto adulto.
I nervi ottici sono stati tagliati, ed uno e’
stato rimpiazzato da un segmento di nervo
periferico lungo 3-4 cm. La rigenerazione
e’ stata testata iniettando traccianti
retrogradi nell’occhio o registrando nei
neuroni del collicolo superiore delle
risposte ad un flash di luce sulla retina.
Autoradiografia (EM) di un terminale
assonico di una cellulare gangliare retinica
nel collicolo superiore. Aminoacidi triziati
erano stati iniettati nell’occhio 2 gg prima
la fissazione e taglio delle fettine di
encefalo. I grani d’argento delle proteine
marcate trasportate dall’occhio iniettato
identificano i terminali assonici ricresciuti
delle cellule gangliari (…Aguayo, 1991)
Studi cellulari/molecolari hanno messo in evidenza
che il fallimento della rigenerazione nel SNC di
mammiferi adulti è dovuto a:
¾ Mancanza di fattori “positivi” (fattori neurotrofici)
in grado di promuovere sopravvivenza cellulare e
ricrescita assonale
¾ Presenza di un ambiente “inibitore” costituito da
inibitori associati alla mielina e dalla cicatrice gliale
PRIME EVIDENZE DI MOLECOLE CHE INIBISCONO LA
CRESCITA ASSONALE UTILIZZANDO α-IN1:
CAROLI AND SCHWAB 1988
Identificazione di molecole inibitrici
associate alla mielina
- Myelin-associated glycoprotein (MAG)
- Oligodendrocyte myelin glycoprotein (Omgp)
- Nogo
Myelin-associated glycoprotein (MAG)
Prima proteina della mielina ad essere stata caratterizzata come
un potente inibitore della crescita assonale in coltura
(McKerracher et al., 1994)
Sialic acid
binding
domain
¾ Espressa sia in SNC sia in SNP
¾ Effetto inibitore di MAG in vitro è
limitato ai neuroni adulti (livelli di
cAMP)
¾ L’inibizione esercitata da MAG in vivo
è meno chiara
¾ Nonostante l’espressione di MAG
nella mielina del SNP si hanno
fenomeni rigenerativi (macrofagi)
Oligodendrocyte myelin glycoprotein (Omgp)
E’ l’inibitore associato alla mielina identificato più recentemente
(Kottis et al., 2002; Wang et al., 2002)
¾ E’ una GPI-linked protein (proteina
ancorata alla membrana da glicosil
fosfatidilinositolo)
¾ E’ espressa ad alti livelli negli
oligodendrociti (vicino ai Nodi di Ranvier),
ma anche nei neuroni
¾ Si è vista l’azione inibitrice di Omgp in
vitro ma non è ancora stato studiata in
vivo
Nogo
E’ l’inibitore associato alla mielina più ampiamente studiato ed è
stata identificata più di 10 anni dopo i primi esperimenti condotti
da Schwab con α-IN1 (Chen et al., 2000; Grandpre et al., 2000)
¾ Le 3 isoforme sono dovute a splicing alternativo (A e B) e
all’utilizzo di un diverso promotore (C)
¾ Tutte le isoforme hanno un dominio C-term comune di 188aa
(omologo a quello della famiglia delle proteine reticolari)
Nogo A
¾È
espressa
maggiormente
dagli
oligodendrociti sia in associazione con
la membrana del RE sia nel loop più
interno della guaina mielinica
¾ Contiene una sequenza C-term comune,
un dominio inibitore comune di 66 aa
detto Nogo-66 e una sequenza N-term
specifica con un secondo dominio
inibitore detto amino-Nogo
¾ Sembra che le 2 diverse topologie
coesistano
contemporaneamente,
inoltre sia Nogo-66 che amino-Nogo
sono in grado di indurre il collasso del
cono di crescita
Ruolo della proteina Nogo
¾ Diversi studi hanno evidenziato il ruolo inibitore di Nogo in
vitro
¾ Coerentemente con questo ruolo la proteina Nogo è altamente
espressa nelle cellule mielinizzanti del SNC mentre è assente o
presente a bassi livelli nelle cellule di Schwann
¾ L’inibizione esercitata da Nogo in vivo è dimostrabile ma
l’effetto non e’ mai totale
Topi transgenici che sovraesprimono Nogo A (Pot et al., 2003) o
Nogo C (Kim et al., 2003) a livello delle cellule di Schwann
Ruolo della proteina Nogo C in vivo
Topo transgenico che esprime Nogo C (Kim et al., 2003) sotto il
controllo del promotore e dell’enhancer del gene oct-6. Questi
elementi regolatori sono altamente specifici per le SCs
Resezione del nervo sciatico ed analisi degli assoni rigeneranti
(SPRR1A, marker specifico per gli assoni periferici rigeneranti)
La presenza di Nogo nel SNP è in grado di
ritardare ma non di impedire la rigenerazione
Il processo rigenerativo, e
di conseguenza il recupero
funzionale, nel topo
trangenico che esprime
Nogo C è più lento rispetto
al WT
Anche nel caso del topo transgenico che esprime Nogo A si ha un
ritardo del processo rigenerativo dopo la lesione del nervo sciatico
Ruolo inibitore di Nogo in vivo
Per chiarire precisamente il ruolo di Nogo nel SNC sono stati
costruiti topi KO per questa proteina. Tre laboratori
contemporaneamente hanno generato topi KO usando strategie
diverse
¾ Topi KO per Nogo A e B (Kim et al., 2003): fenomeni
rigenerativi solo in topi giovani
¾ Topi KO per Nogo A (Simonen et al., 2003): modesto fenomeno
rigenerativo forse dovuto all’aumento dell’isoforma B
¾ Topi KO per Nogo A, B e C (Zheng et al., 2003): non si hanno
fenomeni rigenerativi rilevanti
L’assenza di inibitori individuali ha un modesto
effetto sulla rigenerazione del SNC
Recettore Nogo
¾ Nogo receptor (NgR) è partner di legame per
Nogo-66 (Strittmatter et al., 2001)
¾ Proteina di 85 KDa legata alla membrana
tramite glicosilfosfatidil inositolo (GPI-linked
protein), contiene 2 regioni ricche di leucina
¾ Interagisce direttamente con Nogo-66 ma non
lega amino-Nogo
NgR
Complesso recettoriale
NgR-p75
Da studi di co-immunoprecipitazione
si è visto che il partner di NgR, in
grado di trasdurre il segnale
attraverso la membrana, è il
recettore a bassa affinità per le
Neurotrofine (p75)
Nogo-A
Omgp
NgR-p75 lega anche
Omgp e MAG
Mag
Nogo-66, Omgp e MAG legano il
recettore NgR-p75
¾ Questa ridondanza funzionale dei 3 inibitori può spiegare molti
dei risultati ottenuti in vivo (es KO di Nogo)
¾ La presenza di un unico recettore rende possibile l’utilizzo di
antagonisti di NgR
L’utilizzo dell’antagonista, contenente 40aa N-term del
peptide Nogo-66, blocca l’azione di Nogo ed interferisce
con la capacità di MAG e OMgp di legare NgR,
permettendo così la rigenerazione assonale
In vitro (GrandPre et
al., 2002)
Trasduzione
del segnale
In vivo (Li et al., 2003)
Ruolo di cAMP negli effetti di Mag
¾ MAG durante lo sviluppo promuove la ricrescita assonale,
mentre nell’adulto la inibisce
¾ Questo cambiamento è dovuto al livello di cAMP che è molto
alto durante lo sviluppo (sovrastando l’effetto inibitore di
MAG) e poi decresce spontaneamente
¾ Il trattamento con le Neurotrofine innalza i livelli di cAMP
¾ La somministrazione di dibutirril-cAMP è in
promuovere la rigenerazione sia in vitro, sia in vivo
Aumento di cAMP
grado
Attivazione di PKA
Trascrizione genica (ArgI)
di