Il potenziale della microbiologia predittiva nelle strategie di problemsolving della tecnologia alimentare Come trasformare il costo analitico in un guadagno competitivo per l’impresa Un caso studio, ovvero: l’importanza della progettazione del disegno sperimentale !"#$%%&'())&*+%&',-.+"' /&0"*12'3+'4+"%0+-)5-'-'6-0)"*"7+-'(7."&*+8-)1&.+'-'(89+-)1&*+':;<=6>' &%-.+"?@)+1-$+1' ' ' Attività antimicrobica di estratto acquoso di bacche di mirto nei confronti di Listeria monocytogenes. A+)+8&'B")0-)1.&5+")-'=)+9-)1-' %# !"# !"# !$# "&'"# (# (&'"# )# Applicabilità dell’estratto di mirto in sistemi alimentari? 1.! Le concentrazioni efficaci in vitro devono essere aumentate fino a circa 10 volte per mantenere l’efficacia nell’alimento. 2.! La matrice può interagire con i componenti attivi degli estratti o può proteggere il microbiota. 3.! Fattori come il pH possono potenziare l’azione di alcune molecole attive. 4.! I microrganismi presenti negli alimenti possono essere stressati dalla presenza di altre sostanze antimicrobiche, di fattori intrinseci, di sale, ecc. B><6C(D'BEAFE,=6>'!>,=G<' !"#$%&'(#)$*"+$&,-.$(-(/(0-*"-1"."($(2(."0$.."3( (66><H=E<>I' ' 4! (**-'J&.+&9+*+'%-*-5+")&1-' 4! (7*+'+)1-.J&**+'3-**-'J&.+&9+*+'+)3+K-)3-)L'M+)1-.K"*&5+")-'-')")' -%1.&K"*&5+")-N' >O@&5+")-'K"*+)"8+&*-' ' P'Q'RS'T'UR+'V+'T'UR++'V+W'T''UR+X'V+'V'X'''''' B><6C(D'BEAFE,=6>'!>,=G<' !"#$%&'(#)$*"+$&,-.$(-(/(0-*"-1"."($(2(."0$.."3( Estratto di mirto: 0-1,0% Sale: 0-4% pH: 4,0-6,0 Parametri riscontrabili in alimenti Sviluppo di 6 ceppi (ATCC 7644, ATCC 19114 e 4 isolati) a 37°C per 5 giorni, monitorato mediante turbidometria automatizzata (Bioscreen), effettuando 5 ripetizioni per ciascuna combinazione. I risultati sono stati modellati secondo lequazione di Gompertz, modificata da Zwietering (1990): 5(6(17(8($9)(:4$9)(::1;(8(;<=7>;?17@(8(:1/4,@(A(7@@( dove : b1 corrisponde al parametro A, cioè al valore massimo di crescita b2 corrisponde a µ max, ovvero alla massima velocità di sviluppo b3 corrisponde a !, cioè alla durata della fase lag in ore RUN SALE pH ESTRATTO 1 3% 5,5 0,75% 2 1% 5,5 0,75% 3 3% 5,5 0,25% 4 1% 5,5 0,25% 5 3% 4,5 0,75% 6 1% 4,5 0,75% 7 3% 4,5 0,25% 8 1% 4,5 0,25% 9 2% 5,0 0,5% 10 2% 6,0 0,5% 11 2% 4,0 0,5% 12 2% 5,0 1,0% 13 2% 5,0 0% 14 4% 5,0 0,5% 15 0% 5,0 0,5% 16 2% 5,0 0,5% 17 2% 5,0 0,5% CONTROLLO 0% 6,0 0% Risultati ottenuti C@)'Y' 5 2 3 7 ATCC 7644 B-KK"'Z' Run max A R2 Controllo 5,04 0,065 0,996 0,948 3 0,216 0,004 0,575 0,953 4 11,35 0,011 0,608 0,976 13 4,32 0,021 0,851 0,970 RUN SALE pH ESTRATTO 1 3% 5,5 0,75% 2 1% 5,5 0,75% 3 3% 5,5 0,25% 4 1% 5,5 0,25% 5 3% 4,5 0,75% 6 1% 4,5 0,75% 7 3% 4,5 0,25% 8 1% 4,5 0,25% 9 2% 5,0 0,5% 10 2% 6,0 0,5% 11 2% 4,0 0,5% 12 2% 5,0 1% 13 2% 5,0 0% 14 4% 5,0 0,5% 15 0% 5,0 0,5% 16 2% 5,0 0,5% 17 2% 5,0 0,5% CONTROLLO 0% 6,0 0% Quindi? Dal punto di vista microbiologico risultati positivi: l’estratto di mirto combinato con sale e pH ha una forte azione inibente nei confronti dei ceppi di L. monocytogenes valutati! MA: Regressione non realizzabile. Modelli che descrivano il comportamento dei ceppi non ottenibili. Disegno sperimentale fallito! Valutazioni preliminari: Sviluppo dei sei ceppi di L. monocytogenes in presenza di concentrazioni sub-letali di estratto di mirto (37°C, 24 h) ! Nuova impostazione: CCD 2 RUN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Controllo SALE 1,5% 0,5% 1,5% 0,5% 1,5% 0,5% 1,5% 0,5% 1% 1% 1% 1% 1% 2% 0% 1% 1% 0% pH 6,5 6,5 6,5 6,5 5,5 5,5 5,5 5,5 6,0 7,0 5,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 7,0 ESTRATTO 0,156% 0,156% 0,078% 0,078% 0,156% 0,156% 0,078% 0,078% 0,117% 0,117% 0,117% 0,195% 0,039% 0,117% 0,117% 0,117% 0,117% 0% Estratto di mirto: 0,039-0,195% Sale: 0-2% pH: 5,0-7,0 CCD 1: Estratto di mirto: 0-1,0% Sale: 0-4% pH: 4,0-6,0 Valutazioni preliminari Sviluppo dei sei ceppi in condizioni di controllo (estratto di mirto 0%, sale 0% pH 7,0 6.-'3+J-.%+'K."[*+'3+' %J+*@KK"I' ('M(100'\]YY^'W^'_N' 4'M(100'`a``Y^'\N' B'MZN' Confermati i 6 ceppi selezionati C A B ! Risultati I tre diversi gruppi osservati in base al profilo di sviluppo in condizioni di controllo non trovano conferma nel comportamento osservato nei diversi run! STRAIN EQUATION R F SE p ATCC19114 84.13 -1744.30 [ME] + 9047.22 [ME]2 0.827 15.16 16.18 <0.0003 ATCC 7644 no significant correlation 2 79.85-22.548 [pH] + 1.735 [pH]2 0.797 12.25 0.0036 <0.0001 3 no significant correlation 5 84.09 - 1782.60 [ME] + 9212.59 [ME]2 0.820 14.383 16.80 < 0.0004 7 65.844 - 18.125 [pH] + 1.408 [pH]2 0.733 8.159 0.746 <0.0044 ATCC19114 - 0.70 -9.255 [ME]2 + 0.015 [pH]2 0.904 31.56 0.064 <0.0000 ATCC 7644 - 0.137 + 0.0147 [pH]2 0.830 33.41 0.061 <0.0004 2 - 0.023 - 0.833 [ME] + 0.014 [pH]2 0.937 50.48 0.003 <0.0000 3 -0.027 - 8.663 [ME]2 + 0.0170 [pH]2 – 0.0149 [ME] [NaCl] 0.884 15.48 0.776 <0.0001 5 - 0.023 -8.074 [ME]2 + 0.0179 [pH]2 0.661 11.68 0.126 < 0.0038 7 3.0967 – 1.069 [pH] + 0.1068 [pH]2 – 0.222 [pH] [ME] 0.933 29.10 0.048 <0.0000 ! ! A ! ! ! Estratto di mirto e pH fattori più significativi. Differenze tra i ceppi nella risposta alla combinazione dei parametri ATCC 19114 Effetto additivo estratto di mirto e pH 3 7 Effetto interattivo tra estratto e pH Conclusioni `! >b0&0+&'3-**c-%1.&#"'3+'8+.1"'&'9&%%+%%+8-'0")0-)1.&5+")+'M%@9d *-1&*+N')-*'0")1."**"'3+'!"#$%&%'()%*+&+,"# ' 'F"%%+9+*-'+8K+-7"'-&#,-).#3+'0")0-)1.&5+")+'3+'-%1.&#"'%+8+*+'&' 'O@-**-'J&*@1&1-'-&#/-)0%' # 'F"1-)5+&*-'+8K+-7"'3+'0")0-)1.&5+")+'3+'-%1.&#"'8+)+8-^'1&*+' '3&')")'&*1-.&.-'*c&%K-#"'%-)%".+&*-'3-*'K."3"#"$' ' ' W' '!+e-.-)1-'.+%K"%1&'3-+'0-KK+'%&77+&L'-')-0-%%+12'3+'J&*@1&.-'K+f''' 0-KK+^'&)0g-'&@1"01")+^'&'%-0")3&'3-+'%+%1-8+'&*+8-)1&.+$' ' (%K-#"' h")3&8-)1&*-^' 3&1&' *&' 3+J-.%+12' 3-+' 0-KK+' -' *-''''' '3+J-.%-'.+%K"%1-'[%+"*"7+0g-' Conclusioni BB!'J&*+3"'%1.@8-)1"'K-.'3-[)+.-'*-'8+7*+".+'0"89+)&5+")+'3+' K&.&8-1.+'K-.'K"1-)5+&.-'*c-e-#"'+)+9-)1-'+)'%+%1-8+'0"8K*-%%+$' ' ' ' ' ' ' (KK*+0&)3"'+*'3+%-7)"'%K-.+8-)1&*-^'@)&'+)3&7+)-'8+0."9+"*"7+0&'g&' *-'K"1-)5+&*+12'K-.'K".1&.-'@)'7.&)3-'J&*".-'&77+@)1"')-**"'%J+*@KK"' 3+'K."3"i'