Tecniche Cromatografiche
Strato Sottile
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Ulivi D.
Dipartimento di Scienze Radiologiche
SOD MEDICINA NUCLEARE
Dir. Dr. Giorgio Ascoli
Coord. Dr. Tsrm Davide Ulivi
Circoli Di Lettura 2010
Tecniche Cromatografiche Strato Sottile
Dr.Tsrm Davide Ulivi
Per la determinazione della purezza radiochimica si possono impiegare le seguenti tecniche
cromatografiche:
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su carta
su strato sottile : TLC, ITLC ( radiofarmaci tecneziati, 111In e 90Y-Zevalin
gas cromatografia
HPLC che permette di identificare specie non altrimenti identificabili come anticorpi,
peptidi etc.
Il grande successo del 99mTc nelle indagini scintigrafiche è spiegato dovuto principalmente:
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costi di produzione accettabili ( oggi però assistiamo a un riassetto planetario con
produzione al ribasso del tecnezio da parte centrali nucleari )
emivita o T1/2 di circa 6 ore ( 6,o22 h)
emissione di picco emergetico ottimale a 140 keV
stati ossidativi da -1 a +7 con amplissima possibilità di manipolazione. Poco usato è però il
pertecnetato (Tco4) così come appena "munto" dal generatore di 99Mo.
Il 99mTc, quindi, che si ottiene dal generatore e si trova sotto forma di pertecnetato di sodio ( Tco4
) viene usato per la marcatura di Kits liofili contenenti la molecola da marcare. E' aggiunto
geralmente cloruro di stagno ( SnCl2) come agente riducente che porta il 99mTc dallo stato di
ossidazione +7 a quello richiesto per la marcatura della molecola, per cui ponendo come simboli
rispettivamente R ( riducente ) ed (L) legante osserviamo la seguente reazione :
99mTcO4 +R+ L = 99mTc( L ) n
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E' possibile che dalla reazione a dinamica complessa risultino una sequela di impurezze le quali
concorrono tutte ad ostacolare, quando non ad compromettere in modo più o meno evidente la
qualità dell'indagine scintigrafica. In alcuni casi, rari in verità, può essere possibile assistere alla
impossibilità dell'indagine diagnostica. Le impurezze sono :
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Tc cosiddetto tecnezio libero ( TCo4 ) che si accumula sulle ghiandole salivari, tiroide e
stomaco principalmente.
Tc Ridotto ma non legato, idrolizzato che passa nel sistema reticolo endoteliale e si
evidenza nel fegato, milza etc.
Molecole denaturate marcate con Tc come frammenti, polimeri etc.
La tecnica cromatografica riconosciuta come la maggiormente precisa è l'HPLC che però presenta
tampi lunghi di esecuzione. E' quindi utile avviare controlli di qualità della purezza radiochimica
dei radiofarmaci tecneziati mediante la TLC ( Thin Layer Chromatography) e la ITLC ( Istant thin
Layer Chromatography). La ITLC di discosta dalla TCL soltanto ridotta misura delle lastrine di
carta.
In entrambi i casi è necessario depositare nell' area cosiddetta origine della cartina, fornita in kit
commerciali dedicati e acquistabili presso la Ditta OMNIA di Urbino, un quantitativo minimo di
pochi microlitri della sostanza da analizzare, nel nostro caso il radiofarmaco MDP tecneziato. Dal
lato opposto dell' origine è visibile un'area detta fronte del solvente.
I test richiedono il posizionamento di un'aliquota di ca. 10 microlitri di campione
radiofarmaceutico su di una striscetta radiocromatografica.
su un lato di ogni striscetta del test sono facilmente visibili da due linee nere indelebili, una
inferiore (origine) corrisponde alla zona di deposito dello spot di campione radiofarmaceutico e
l'altra, superiore, (fronte del solvente) il punto terminale del processo. Una sfumatura di colore
evidenzia l'avanzare del fronte del solvente da un polo all'altro della striscetta. Un colore identifica i
differenti impieghi di ogni striscetta.
E' possibile quindi con tale metodo determinare la percentuale di pertecnetato libero, la perdentuale
di radiofarmaco marcato e la percentuale di 99mTc idrolizzato-ridotto.
N.B. la decisione di utilizzare il preparato dopo l'esecuzione del test è di responsabilità del MN
(medico nucleare).
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Kit BIODEX by OMNIA
OM-152-110 :
Nano colloid, Shulfur colloid, MAA DTPA, MDP, HDP, Pyrophosphate, Diphosphonate,
Gucoheptonate kits.
determinazione della percentuale di tecnezio libero:
1. Preparare il flaconcino di sviluppo ( etichetta rossa ) aggiungendo 1 cc di solvente
denominato "Acetone Red".
2. Applicare su di una striscetta cromatografica rossa una goccia di circa 10 microlitri del
campione da testare sotto la linea indelebile nera, posizionatanelal parte inferiore della
striscetta.
3. posizionare immediatamente la striscetta di test nel flaconcino etichettato rosso contentente
acetone precedentemente preparato e lasciare sviluppare l'evento fino a che il fronte del
solvente migri al si sopra della linea nera visibile nelal parte superiore della striscetta.
4. Rimuovere la striscetta dal flaconcino e attendere che si asciughi.
5. Adagiare la striscetta mediante pinzetta fra due fogli di cellophane.
6. Esporre la lastrina flessibile in dotazione con il del Cyclone plus della Ditta Perkin Elmer ,
alla luce di un diafanoscopio per almeno un minuto cosi da eliminare possibili tracce di
precedenti esposizioni ed eventualmente controllare che le effettive calcellazioni siano
avvenute mediante rapida scansione con il Cyclone plus.
7. Appoggiare la parte sensibile della lastrina sul campo preparato per una decina di secondi
ca. così da impressionarla e collocarla con le modalità corrette nel Cyclone per la scanzione.
8. Dopo poco apparirà sul display del Cyclone plus l' immagine radiografica riferita alle
esposizioini da noi prodotte pronte per essere elaborate piazzando ROI che sarannno
elaborate dal programma che esporrà a video e su stampa i risultati ottenuti.
Le specie più frequentemente presenti complessivamente in un radiofarmaco sono tre:
1. 99mTc idrolizzato (I)
2. 99mTc pertecnetato libero (L)
3. 99mTc legato al Radiofarmaco (R)
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I controlli eseguiti sono spesso due per la oggettiva difficoltà nella separazione delle impurezze (I) e
(L) dal radiofarmaco (R). tenuto conto altresì che il Radiofarmaco (R) ha un Rf ( fronte relativo )
diverso a seconda che si utilizzi come fase mobile acetone o soluzione fisiologica.
Fig.1)
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E' possibile in questo modo calcolare la percentuale di (I) 99mTc idrolizzato in quanto con tale
procedura resta fermo al punto di origine ove è stato poco prima posto lo spot di Radiofarmaco
marcato. La formula seguente ci permette di conoscere la percentuale di (I) secondo quanto appena
espresso.
I (%) = (I / (R + I + L )*100)
Fig.2)
In questo secondo caso viene utilizzato l'Acetone che permette di calcorare la percentuale del
cosiddetto 99mTc pertecnetato cioè tecnezio libero (L) unico composto a migrare subiscono invece
uno stop all'origine sia il Radiofarmaco (R) che il tecnezio (I) 99mTc Idrolizzato.
L (%) = (L / (R + I + L )*100)
E' ora possibile calcolare per differenza la percentuale di Radiofarmaco marcato (R) :
R(%) = 100 - I (%) - L (%)
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Kit BIODEX by OMNIA
OM-151-970
MYOVIEW (99mTc Tetrofosmin)
Il Myoview è un radiofarmaco prodotto per la studio della perfusione del miocardio indicato quale
mezzo diagnostico supplementare nella diagnosi e localizzazione della ischemia e / o infarto del
miocardio. Nei pazienti sottoposti a scintigrafia per lo studio della perfusione del miocardio, la
tecnica ECG-gated SPECT può essere utilizzata per valutare la funzione ventricolare sinistra cioè
frazione di eiezione (FE) del ventricolo sinsitro e motilità delle pareti.
La distribuazione iniziale del 99mTc-tetrafosmina è proporzionale al flusso coronarico regionale e
rapidamente eliminato dopo iniezione e.v. Il 66% dell'attività vengono eliminati nelle 48 ore
successive all'iniezione di cui, il 40% ca. elimitata per via urinaria e attraverso le feci per circa il
rimanente 26%. di estrazione è pari a circa il 50-65%. L'imaging scintigrafico è descrittivo del
flusso coronarico cosi come oggettivamente si presenta al tempo della somministrazione , eventuali
variazioni del flusso possono essere evidenziate soltanto dopo nuova reiniezione.
Esecuzione del Controllo di Qualità (Q.C.)
1. versare la miscela 35:65 di acetone dicloro metano nella vaschetta per la cromatografia fino
a raggiungere un'altezza di cm 1 e coprire per permettere al solvente evaporato di
raggiungere un equilibrio.
2. marcare una striscia di carta ITLC/LG con una matita a 3Cm dal fondo, e con penna a
inchiostro indelebile marcare un'altra linea a 15Cm dalla precedente. La linea a matita indica
ove deve essere dopositato il campione e la distanza del colore dalla linea a inchiostro
indicherà la posizione del fronte del solvente al termine dell'operazione al termine
dell'eluizione. Nel nostro caso il kit Biodex fornisce tutto il materiale comprese le striscette
di carta già impresse le aree di riferimento.
3. segnare a matita due punti di riferimento a 3Cm e 12Cm dall'origine, rispettivamente Rf
uguali a 0,2 e 0,8 .
4. Con siringa da 1 ml con ago 22-25 G aplicare un campione di circa 10 -20 microlitri del
preparato iniettabile all' origine della striscetta. Bisogna evitare che la macchia si asciughi.
Porre la striscetta immediatamente nella vaschetta per cromatografia e coprire. Assicurarsi
che la striscetta non aderisca alle pareti della vaschetta. Da notare che un campione di 10-20
microlitri produrrà una macchia di diametro 7-10 mm. Si è notato che campioni
volumetricamente minori danno valori inesatti di purezza radiochimica.
5. Quando il solvente raggiunge la linea di inchiostro ( fronte del solvente ) rimuovere la
striscetta dalla vaschetta e lasciare asciugare.
6. tagliare la striscia in 3 pezzi alle posizioni segnate e misurare l'attività di ognuna usando
apparecchio idoneo al conteggio. Nel nostro caso usiamo Cyclone Plus della Ditta Perkin
Elmer per cui è sufficiente impressionare il supporto flessibile in dotazione con la
radioattività emessa dalla striscetta con modalità che descriveremo in seguito.
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7. Calcolare la purezza radiochimica secondo la seguente formula :
% tetrofosmina(99mTc) = (Attività. pezzo centrale/Attività tot 3 pezzi) *100
Criteri di Correttezza
Il pertecnetato (99mTc) libero (L) migra all'estremità superiore della striscetta.
La tetrofosmina radiofarmaco (R) (99mTc) migra al centro della striscetta.
Il 99mTc ridotto idrolizzato e tutte le impurezze di complessi idrofili rimangono all'inizio nella
parte inferiore della striscia.
materiale da non utilizzare se la purezza radiochimica è inferiore al 90%
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