Spettrometria di Massa
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• E' la tecnica analitica
che si basa sulla
produzione di ioni da
atomi o molecole
(sorgente) i quali sono
poi separati in accordo
con il loro rapporto
massa/carica (m/z)
(analizzatore) e infine
misurati (rilevatore)
Le fasi
L’esperimento di spettrometria di massa consiste
dunque nella:
ionizzazione di molecole in fase gassosa
separazione dei diversi ioni prodotti
rivelazione degli ioni prodotti
Vantaggi
Questa tecnica consente di misurare le masse molecolari
(sia nominali che esatte) e di ottenere dei profili di
frammentazione che sono specifici per ciascun composto,
di cui costituiscono quindi un’impronta digitale.
Si può così individuare la formula di struttura di
composti sconosciuti, anche avendone a disposizione
piccole quantità.
Lo strumento
L’interpretazione dello spettro di massa consiste nello studio dei
segnali dovuti agli ioni generati nell'esperimento, dai quali si può
ricostruire a ritroso la struttura molecolare originale.
Da notare che il vuoto (che si aggira intorno ai 10-6 – 10-5 torr) è
necessario per impedire una perdita di ionizzazione per urto con i
gas atmosferici.
Introduzione
del
campione
L’introduzione del campione nella camera di ionizzazione può
essere fatta sia allo stato solido, usando una sonda, che allo stato
liquido o gassoso, usando un sistema di valvole che permettono di
accedere alla camera di ionizzazione senza che questa venga a
contatto
con
l’esterno.
La quantità di prodotto necessario per registrare uno spettro è
dell’ordine
dei
microgrammi/nanogrammi.
E' possibile utilizzare l'uscita di un sistema GC o HPLC come ingresso
dello spettrometro di massa. Queste tecniche, note come GC-MS e
HPLC-MS, sono estremamente utili nell'analisi di miscele di prodotti.
Sorgenti di ioni
In base al tipo di sorgente utilizzata la
ionizzazione primaria del campione viene
realizzata in vario modo.
Le tecniche più utilizzate sono:
1) impatto elettronico (E.I.)
2) ionizzazione chimica (C.I.)
3) electrospray (E.S.I.)
Analizzatori
Glossario - spettrometria di massa.
Sorgenti di ioni
CI (Chemical Ionisation) ionizzazione chimica. Ionizzazione dovuta alla reazione con
sostanze gassose.
DI (Desorption Ionisation) Ionizzazione per desorbimento E' un termine generico che
comprende tutte le forme di ionizzazione diretta da un campione solido o liquido (FAB, FI,
Californium Fission Ionisation).
ESI (Electrospray Ionisation) Ionizzazione elettrospray E' la ionizzazione prodotta
spruzzando un campione in soluzione attraverso un capillare tenuto ad alto potenziale.
EI (Ionizzazione elettronica) Ionizzazione prodotta in fase gassosa per interazione con un
fascio di elettroni.
FAB (Fast Atom Bombardment) or LSIMS (Liquid Surface Ionisation MS) Ionizzazione
dovuta all'impatto con un fascio di atomi e/o ioni prodotti da un cannone ionico in una
matrice liquida con trasferimento di energia dalla matrice all'analita.
FD/FI (Field Desorption/Field Ionisation) La formazione di ioni per rimozione di elettroni
in un potente campo elettrico.Spettrometria per mobilità ionica.Ioni a pressione atmosferica
sono fatti derivare in un tubo sotto l'influenza di un potenziale elettrico. Si separano in base
alla loro carica, massa e soprattutto dimensione e forma. Questo dispositivo è spesso
accoppiato con un analizzatore di massa per il rilevamento degli ioni e per la misurazione
del loro rapporto massa su carica.
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)
Ionizzazione ottenuta per effetto dell'irraggiamento con un raggio laser (di solito a
vapori d'azoto) che eccita una matrice contenente piccole quantità di analita.
NICI (Negative Ion Chemical Ionisation)
Ionizzazione chimica a ioni negativiIonizzazione dovuta alla sottrazione di un elettrone nella
fase gassosa.
Soft ionization o Ionizzazione smorzata
Insieme di metodi che portano alla formazione di ioni con bassa energia interna. (CI, FAB,
MALDI,
ESI, ApCI)
TI (Thermal Ionisation) o Ionizzazione
termicaIonizzazione provocata da alte temperature in un campione gassoso per mezzo di
microonde o indotto da plasma.
TSP (Thermospray Ionisation)
Ionizzazione per vaporizzazione ad alte temperatureIonizzazione prodotta per
nebulizzazione di una soluzione del campione attraverso un capillare conduttivo ad alta
temperatura./dd>
Analizzatori
Lineari
Singola focalizzazione (Single focusing) Viene utilizzato solo un campo
magnetico per separare gli ioni in accordo con la loro massa/carica.
Doppia focalizzazione (Double Focussing) Una combinazione di campi
elettostatico (E) e magnetico (B) vengono usati per compensare le variazioni di
energia degli ioni formati nella sorgente e quindi migliorare la risoluzione (qv)
dell'analizzatore.
E La sigla usata per indicare il voltaggio in un analizzatore elettrostatico.
Q L'abbreviazione per un analizzatore a quadrupolo.
q La sigla usata per una camera di collisione a quadrupolo solo Rf.
V Voltaggio di accelerazione (Accelerating Voltage) Il voltaggio applicato
alla sorgente per accelerare
nell'analizzatore gli ioni.
Scansione (Scanning) Strumenti magnetici sono analizzati variando il campo
magnetico
o
il
voltaggio
di
accelerazione.
Scansioni collegate (Linked Scans) Particolari scansioni dove le funzioni di B e
E sono variate
{Quadrupolo Quadrupole(Q)} L'applicazione di una combinazione di un voltaggio
in corrente continua e alternata a 4 barre parallele che creano un filtro attraverso il
quale, con applicazione di un appropriato voltaggio, solo gli ioni di un definito
valore di massa/carica possono essere trasmessi. Se si applica la sola
radiofrequenza
{Rf
tutti
gli
ioni
sono
trasmessi
(q)}.
Tempo di volo {TOF (Time-of-Flight)} Gli ioni formati sono tutti accelerati da un
potenziale pulsato in un tubo tenuto a bassa pressione (regione di deriva) e il loro
tempo di arrivo ad un rilevatore è misurato. Il tempo impiegato è funzione dalla
loro massa/carica.
Tempo di volo riflesso (Reflectron TOF) Gli ioni che passano nel tubo di volo
sono riflessi da uno "specchio" elettrostatico; ciò focalizza gli ioni con differente
energia cinetica ma con identica m/z, portando ad una maggiore risoluzione.
TOF ad estrazione ritardata {DE TOF (Delayed Extraction Time-of-Flight)}
Una tecnica usata in spettrometria di massa nella quale una migliore risoluzione
si ottiene applicando un ritardo controllato fra la formazione degli ioni e la loro
accelerazione.
TLF-TOF (Time Lag Focussing-Time-of-Flight) Sinonimo di TOF ad
estrazione ritardata.
Decomposizione dopo la sorgente (PSD - Post Source Decay) E' il processo
di frammentazione che può avvenire nel TOF.
TOF ortogonale (Orthogonal TOF) In alcuni strumenti più recenti il fascio di
ioni è analizzato in un tubo di volo in direzione ortogonale (ad angolo retto)
rispetto alla loro traiettoria originale.
Esapolo (Hexapole) Un piccolo dispositivo a sei barre usato per focalizzare un
fascio di ioni divergente.
FWHM (Full Width at Half Height)
E' la risoluzione misurata come rapporto tra l'altezza del picco m/z e la sua
larghezza a metà dell'altezza.
Trappola ionica Gli ioni sono spinti in un dispositivo tridimensionale dove sono
accumulati da un campo generato da un quadrupolo. Sono poi espulsi in base alla
m/z per applicazione di un determinato campo elettrico secondario.
ICR (Ion Cyclotron Resonance)(FTICR) Gli ioni sono tenuti in "trappola" da una
combinazione di campi elettrici e magnetici. Gli ioni sono analizzati in situ grazie
agli impulsi elettrici creati dagli ioni circolanti e rilevati da rilevatori a piastre posti
esternamente alla trappola. La m/z viene determinata grazie ad una operazione
matematica ( FT Fourier Transform) che converte le frequenze misurate in m/z.
Diagramma di stabilità di Mathieu Una rappresentazione grafica dei valori dei
voltaggi DC e AC i quali, quando applicati a una trappola ionica, mantengono uno
ione di un dato intervallo di valori m/z in una traiettoria stabile nella trappola.
Risoluzione E' il termine che definisce la prestazione di un analizzatore. Questo
parametro quantifica come i picchi di due ioni di m/z adiacente possono essere
distinti fra loro con definito valore di sovrapposizione. Di solito si ha 10% per uno
strumento ibrido e 50% per i quadrupoli. Per i picchi isolati lo stesso termine può
essere calcolato dall'ampiezza del picco ad una definita altezza (FWHM)
Configurazioni con più di un analizzatore
MS/MS L'uso di due analizzatori per rilevare gli ioni precursori e i loro prodotti
ionici (Tandem Mass Spectrometry).
Decomposizione indotta da una superficie SID (Surface Induced
Decomposition) Frammentazione di uno ione per collisione con una superficie
solida posta tra due analizzatori.
Tandem Mass Spectrometry L'uso di due analizzatori separati da una regione
in cui gli ioni sono indotti a frammentare per trasferimento di energia (spesso per
collisione con altre molecole).
Triplo quadrupolo (QqQ, 'Triple quad') Due analizzatori di massa a quadrupolo
separati da una camera di collisione con quadrupolo a solo Rf.
Qq-TOF Analizzatore a quadrupolo e TOF con una camera di collisione con
quadrupolo a sola Rf.
Rilevatori
Coppa di Faraday Rileva gli ioni per impatto diretto su una coppa metallica.
Elettromoltiplicatore o fotomoltiplicatore Rilevamento degli ioni per
produzione di una corrente elettrica amplificata conseguenza del diretto
impatto dello ione sulla superficie o per la produzione di fotoni da un fosforo
seguito
da
un
tubo
fotomoltiplicativo.
Microchannel Plate Rilevatore moltiplicatore di elettroni con risposta veloce e
area relativamente vasta su cui gli ioni sono rilevati di uso comune negli
analizzatori
TOF.
Data Systems Strumento informatico che processa e registra i segnali
provenienti dal rilevatore e gestisce tutti i processi coinvolti
nelle
operazioni
dello
strumento.
Centroide (Centroid) Il segnale analogico dal rilevatore è trasformato in
digitale. Il centroide è il centro del segnale digitalizzato per uno ione da
questo
è
calcolata
la
m/z
per
lo
spettro.
MCA
(Multi
Channel
Analysis)
Una media generata dal computer di un certo numero di scansioni
dello spettro che si genera da dati continui.
Lo spettro
Unità di massa atomica (u) Il simbolo per la massa di una particella basata
sul 12C = 12u.
Massa su carica (m/z) Il rapporto della massa su carica di uno ione rilevato.
La carica (z) è spesso pari a uno ma può essere multipla specialmente in
ESI-MS.
Spettro di massa Un diagramma della m/z o massa (ascissa) contro
l'intensità spesso normalizzata al 100% in base allo ione più intenso rilevato
(ordinata). Si produce per selezione della trasmissione degli ioni
nell'analizzatore (o rilascio da una trappola) per definiti intervalli di valori m/z
in un dato periodo di tempo.
Picco base Lo ione più intenso rilevato nello spettro.
Spettro continuo
Visione grafica del profilo del segnale rilevato per uno ione.
Corrente totale degli ioni {Total Ion Current (TIC)}
La misura della quantità di tutti gli ioni rilevati.
Ioni isobarici Ioni con identica massa ma con differente composizione atomica.
Ione molecolare Lo ione formato a partire dalla molecola originaria nella
sorgente.
Ione radicale Uno ione contenente un elettrone spaiato.
Ioni prodotto, ioni figli o ioni frammento Tutti termini usati per ioni formati per
frammentazione di uno ione precursore.
Ioni pseudomolecolari Sono ioni formati per ionizzazione delicata, per cui gli ioni
molecolari hanno un protone o altri cationi adesi o, per ioni negativi, hanno perso
un protone.
Isotopi Molti elementi sono composti di una miscela di isotopi che
risultano separati in uno spettrometro di massa. Gli atomi o le molecole
contenenti tali elementi mostreranno un gruppo di ioni che riflettono la
composizione isotopica.
Ioni monoisotopici Sono ioni che contengono solo l'isotopo più abondante
(chiamato anche lo ione principale).
Massa ionica nominale La massa di uno ione contenente l'isotopo più
abbondante, calcolata con il peso atomico nominale.
Massa ionica monoisotopica La massa di uno ione contenente gli isotopi più
abbondanti calcolata con la massa atomica esatta.
Massa media La massa di una particella o molecola di una data formula empirica
calcolata usando il peso atomico per ogni elemento.
Massa Accurata Gli isotopi hanno un'unica massa precisa, una conseguenza di
ciò è che la composizione in elementi di ogni molecola, o suo frammento, può
essere calcolata dalla massa se è determinata con sufficiente accuratezza.
SIR (Selected Ion Recording)
Analisi per definiti analiti, l'analizzatore è impostato per trasmettere solo la m/z
calcolata per certi componenti. SIM (Selected Ion Monitoring) Sinonimo di SIR
MS/MS (Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)
Analisi della relazione fra gli ioni e i loro frammenti usando due o più analizzatori
o una trappola ionica e usando CAD.
Frammentazione Un termine alternativo per decomposizione ionica.
Decomposizione unimolecolare Descrive la frammentazione spontanea di uno ione,
avviene nella sorgente.
Metastable Ion Ione che si decompone in un prodotto carico e in una specie neutra
durante la trasmissione attraverso lo spettrometro.
Decomposizione attivata da collisione (CAD) La frammentazione di uno ione indotta
dalla collisione con un atomo o una molecola neutra.
Camera di collisione Una regione di pressione relativamente elevata contenente un
dispositivo di focalizzazione dove avviene la CAD.
Scansione degli ioni prodotto Scansioni in cui gli ioni prodotto formati per
decomposizione di ioni precursori sono rilevati. CAD o decomposizione unimolecolare
sono coinvolti in questo processo.
Scansione degli ioni precursori Analisi per tutti gli ioni precursori di un definito
prodotto ionico.
Scansione di una perdita neutra costante Analisi di ogni ione che perde una certa
massa (es. 18 per perdita di H2O).
Trasformata di Fourier (FT - Fourier Transform) L'operazione matematica usata per
convertire il segnale rilevato in uno spettrometro di massa IRC in valori di m/z.
Sistemi di introduzione del campione
Le tecniche di ionizzazione disponibili permettono l'interfacciamento allo
spettrometro di massa di numerosi sistemi di introduzione del campione.
I campioni solidi volatili possono essere introdotti nella camera di ionizzazione
per impatto elettronico attraverso una sonda riscaldabile a tenuta di vuoto.
Prodotti non volatili (ad esempio proteine) possono essere sciolti in un solvente
adatto ed analizzati con un sistema di ionizzazione a pressione ambiente, ad
esempio con la tecnica termospray.
Particolarmente interessante e' l'interfacciamento con un sistema cromatografico.
In gas-cromatografia, l'effluente da una colonna capillare puo' essere inviato
direttamente nella camera di ionizzazione per impatto elettronico. L'effluente da
un sistema HPLC puo' essere inviato ad un sistema di ionizzazione chimica a
pressione ambiente, termospray o ion-spray, in funzione delle sostanze da
analizzare.