Scuola Superiore Medico-Tecnica Locarno
Formazione tecnico in analisi biomediche
Lavoro di diploma
Genotipizzazione tramite PCR di
ceppi di Staphylococcus aureus
agenti della mastite bovina
Autore: Patrick Carinci
Laboratorio: Laboratorio di microbiologia applicata, Bellinzona
Responsabili: Demarta Antonella e Caminada Annapaola
2013
2 Sommario
Sommario ............................................................................................................................ 3
Riassunto / Abstract ............................................................................................................. 4
1.
Introduzione .................................................................................................................. 5
1.1
La mastite ...............................................................................................................5
1.2
Il principale agente eziologico ................................................................................. 5
1.3
La mastite da stafilococco nei bovini ...................................................................... 7
1.4
Obiettivo .................................................................................................................8
2. Materiale e metodi .........................................................................................................9
2.1
Ceppi batterici ......................................................................................................... 9
2.2
Scongelamento campioni ....................................................................................... 9
2.3
Estrazione ...............................................................................................................9
2.4
PCR ........................................................................................................................ 9
2.5
Elettroforesi .......................................................................................................... 11
2.6
Analisi dei dati....................................................................................................... 12
3.
Risultati e discussione ................................................................................................. 12
4.
Conclusioni .................................................................................................................. 18
5. Ringraziamenti ............................................................................................................ 18
6. Bibliografia .................................................................................................................. 19
7. Allegati ........................................................................................................................ 20
7.1
Skim Milk .............................................................................................................. 20
7.2
Metodica Instagene .............................................................................................. 21
3 Riassunto / Abstract
La mastite bovina è una patologia infettiva
della mammella che causa seri problemi alla
produzione lattea e, di conseguenza, grosse
perdite economiche per l’allevamento. Il
principale agente eziologico della patologia è
lo S. aureus, un batterio asporigeno a forma di
cocco, Gram-positivo appartenente alla
famiglia delle Staphylococcaceae. Il batterio
produce delle tossine chiamate leucocidine
che distruggono la membrana cellulare e
possono danneggiare i tessuti che producono
il latte portando alla formazione di ascessi e
tessuto cicatriziale nella mammella,
occludendo i dotti lattiferi. Vi sono diversi
sotto-tipi di S. aureus, ognuno caratterizzato
da un proprio genotipo. Uno studio ha
dimostrato che esiste un’associazione tra il
genotipo e la virulenza e la contagiosità del
ceppo; ogni infezione richiederebbe quindi
delle misure di intervento specifiche in
relazione al sotto-tipo dell’agente infettivo. Lo
scopo del lavoro è stato di mettere a punto la
metodologia di genotipizzazione, basata
sull’amplificazione tramite PCR delle
sequenze intergeniche localizzate tra i geni
16S e 23S dell’rDNA, e di tipizzare dei ceppi
di S. aureus, frutto di prelievi svolti tra il 2011
e il 2012 in Canton Ticino. Il confronto con
stipiti di riferimento il cui genotipo era
conosciuto, ha permesso di caratterizzare i
ceppi di origine ticinese e di allestire una
“ceppoteca” comprendente 31 ceppi di
riferimento per 31 genotipi diversi. L’analisi
della distribuzione dei genotipi ha evidenziato
che gli S.aureus del genotipo B, considerato il
più patogeno ed il più contagioso, erano
presenti in 7 Aziende agricole ticinesi. Altri
genotipi particolarmente frequenti sono stati i
genotipi A, P e R. Questo lavoro ha permesso
di allestire la genotipizzazione di S. aureus,
agente della mastite nei bovini, nel
Laboratorio di Microbiologia Applicata che
potrà essere utilizzata per indirizzare
eventuali interventi preventivi e terapeutici in
modo mirato.
Bovine mastitis is an infectious disease of the
breast that causes serious problems for milk
production and, consequently, large economic
losses to livestock holders. The main
causative agent of the disease is S. aureus, a
Gram-positive, asporogenic coccal bacterium
belonging to the family of Staphylococcaceae.
The bacterium produces toxins called
leukocidin that destroy the cell membrane and
can damage the tissues that produce milk,
leading to the formation of abscesses and
scar tissue in the breast, occluding the milk
ducts. There are different sub-types of S.
aureus, each with its own genotype. One
study showed the association between
genotype and virulence and contagiousness;
each infection would therefore require specific
intervention measures adapted to the
infectious agent sub-type. The purpose of this
study was to develop the methodology for
genotyping, based on the amplification of
intergenic sequences located between the
16S and 23S rDNA genes, and to type S.
aureus strains isolated between 2011 and
2012 in Canton Ticino. The comparison with
the reference strains whose genotype was
known, allowed to characterize the strains of
Ticino origin. Moreover, thanks to this work we
now have a database of 31 reference strains
for 31 different genotypes. Analysis of the
distribution of genotypes showed that S.
aureus genotype B, considered the most
pathogenic and most contagious, were
present in 7 Farms in Ticino. Other particularly
frequent genotypes were genotypes A, P and
R. This work has allowed us to set up the
genotyping of S. aureus, agent of mastitis in
cattle, in the Laboratory of Applied
Microbiology, which can be used to guide any
preventive and therapeutic interventions in a
targeted manner.
4 1. Introduzione
1.1 Lamastite
La mastite è una patologia infettiva della mammella, condizionata da due fattori importanti:
1. l’animale stesso , quindi la razza, l’ordine di parto, lo stadio di lattazione, il livello
produttivo e le caratteristiche morfologiche.
2. le condizioni di allevamento che comprendono l’igiene dell’allevamento, la presenza
o meno delle lettiere, condizioni e manutenzione della mungitrice e il corretto
svolgimento della procedura di mungitura.
Questa malattia è causata da diversi tipi di microrganismi per la maggior parte batteri, ma
è possibile anche avere mastiti causate da micoplasmi, lieviti, alghe e virus [1]. Questi
microrganismi vivono sull’animale stesso e infettano la mammella penetrando nel dotto del
capezzolo causando un infiammazione.
Vi sono due tipi di mastiti, quelle cliniche e quelle subcliniche; le prime sono riconoscibili
macroscopicamente in quanto causano anomalie alla mammella e/o al latte, mentre le
seconde non possono essere diagnosticate senza la ricerca in laboratorio dei
microrganismi patogeni [1].
La mastite nei bovini è un problema diffuso a livello mondiale ed è responsabile della
maggior parte delle perdite economiche negli allevamenti [2].
1.2 Ilprincipaleagenteeziologico
Lo Staphylococcus aureus è un batterio asporigeno a forma di cocco, Gram-positivo
appartenente alla famiglia delle Staphylococcaceae. È un anaerobo facoltativo e
generalmente è β-emolitico.
È riconosciuto come il principale agente eziologico della mastite dei bovini [2] ed è uno dei
più comuni batteri che causano infezioni opportunistiche. La patogenicità di questi batteri è
dovuta a diversi fattori quali:
1. Proteine di superficie che favoriscono la colonizzazione dei tessuti dell’ospite
2. Proteine che favoriscono la diffusione dei germi nei tessuti dell’ospite (leucocidina,
chinasi, ialuronidasi)
3. Fattori di superficie che inibiscono la fagocitosi (capsula, proteina A) o che
aumentano la loro sopravvivenza nei fagociti (catalasi, carotenoidi)
4. Produzione di enzimi che interferiscono con la risposta immunitaria dell’ospite
(coagulasi, proteina A)
5. Produzione di tossine che danneggiano le membrane delle cellule eucariotiche
(emolisine, leucotossine, leucocidine, ….)
5 Fig. 1: I fattori di virulenza di Staphylococcus aureus (da:
http://textbookofbacteriology.net/staph_2.html)
Questo batterio è anche conosciuto per essere una delle maggiori cause delle infezioni
nosocomiali, ovvero le infezioni che vengono acquisite all’interno di una struttura
ospedaliera.
Gli S. aureus possono essere tipizzati tramite diversi metodi. I metodi fenotipici di
tipizzazione sono via via stati rimpiazzati da metodi genotipici basati sul DNA quali il
PFGE, il MLST, o sull’amplificazione del DNA come l’amplificazione di DNA polimorfico [4].
Tra questi ultimi, l’amplificazione tramite PCR delle sequenze intergeniche 16S-23S del
rDNA ha dimostrato di possedere un ottimo potere discriminante, confrontabile al PFGE
che è considerato uno dei metodi “gold standard” di tipizzazione degli S. aureus. Il
principio del metodo si basa sul fatto che i geni per gli RNA ribosomali nei procarioti sono
presenti in regioni che contengono nell’ordine il 16S rRNA, il 23S e il 5S con degli spazi tra
i vari geni [6]. Queste regioni sono ripetute più volte sul cromosoma batterico; i geni 16S,
23S e 5S sono relativamente uguali in ogni regione ripetuta mentre gli spazi tra i vari geni
non essendo codificanti possono variare di lunghezza .
Amplificando dalla fine del 16S all’inizio del 23S si ottiene un certo numero di amplificati,
corrispondente al numero di regioni complete (operoni) ripetute sul cromosoma, di
lunghezza variabile e caratteristici di ogni genotipo.
Fig. 2: Raffigurazione dell’operone rDNA. Le frecce indicano la posizione dei primers
utilizzati per l’amplificazione tramite PCR della regione intergenica 16S-23S
6 1.3 Lamastitedastafilococconeibovini
Gli S. aureus producono diverse tossine tra cui quelle chiamate leucocidine che
distruggono le membrane cellulari e possono danneggiare direttamente i tessuti che
producono il latte. I leucociti si dirigono verso l’area dove è in corso l’infiammazione per
tentare di combattere l’infezione. Inizialmente il batterio danneggia i tessuti che rivestono il
capezzolo e il dotto lattifero portando alla formazione di tessuto cicatriziale. In seguito i
batteri si spostano verso l’altro attraverso i dotti fino ad arrivare alle ghiandole mammarie
creando degli ascessi all’interno di esse. Questo permette di evitare che l’infezione
continui a propagarsi ma allo stesso tempo permette al batterio di non essere rilevato dal
sistema immunitario. Gli ascessi inoltre impediscono all’antibiotico di raggiungere il
batterio e questo è il motivo per cui la risposta primaria al trattamento è debole [3].
Durante l’infezione la distruzione delle ghiandole mammarie e delle cellule duttali causa
una diminuzione della produzione di latte. Queste cellule danneggiate possono combinarsi
con leucociti e ostruire i condotti di latte, causando la formazione di ulteriore tessuto
cicatriziale e occlusione dei dotti diminuendo ancora maggiormente la produzione di latte. I
dotti si possono riaprire in un secondo momento, ma questo causa il rilascio del batterio
verso altre zone della ghiandola mammaria, causando la formazione di ulteriori ascessi
che possono assumere dimensioni notevoli ed essere rilevabili come grumi all’interno della
mammella [3].
Le conseguenze di una mastite sono diversificate da caso a caso; sicuramente vi è
innanzitutto una diminuzione della produzione lattea nonché un decadimento della qualità
del prodotto, questo causa importanti perdite economiche all’allevamento [2].
Le mastiti infettive possono essere causate da sottotipi di S. aureus (genotipi) che
differiscono in relazione al loro potere patogeno ed alla loro contagiosità. I risultati della
ricerca svolta da Fournier e collaboratori [4] hanno evidenziato una notevole associazione
sia tra i genotipi e i geni di virulenza che tra le proprietà epidemiologiche e patogene dello
stafilococco aureo. Così nei bovini il genotipo B è correlato ad un alta contagiosità e
patogenicità; solitamente quando è presente si diffonde facilmente all’intero allevamento,
mentre gli altri genotipi restano più frequentemente limitati a singoli bovini [4][5]. Di
conseguenza, sarebbe auspicabile intervenire negli allevamenti in cui si verificano casi di
mastite in modo differenziato sia per quanto riguarda la prevenzione che il trattamento [4].
7 1.4 Obiettivo
Il problema della mastite bovina negli ultimi anni è diventato sempre più rilevante anche
nel nostro Cantone e ci è sembrato importante il poter disporre di un metodo di
tipizzazione che permettesse di indirizzare gli interventi preventivi e terapeutici.
Lo scopo di questo lavoro è stato la genotipizzazione di ceppi di S. aureus tramite
amplificazione delle sequenze localizzate tra i geni 16S e 23S dell’rDNA , adattando alle
metodiche in uso nel Laboratorio di Microbiologia Applicata il procedimento descritto da
Fournier et al. [4].
Sulla base di stipiti di S. aureus il cui genotipo era conosciuto e gentilmente messi a
disposizione dal Dr. Graber (Università di Berna), si è voluto analizzare i ceppi isolati in
Ticino tra il 2011 ed il 2012 per valutare la diffusione dei diversi genotipi sul nostro
territorio e per allestire una “ceppoteca” a cui fare riferimento nelle eventuali richieste di
tipizzazioni future.
8 2. Materiale e metodi
2.1 Ceppibatterici
Sono stati analizzati 104 ceppi di S. aureus prelevati tra il 2011 e il 2012 in Ticino e 31
ceppi utilizzati come riferimento per i genotipi gentilmente messi a disposizione dal Dr.
Graber (Università di Berna, Svizzera). I ceppi sono stati conservati in Skim Milk a -80°C.
(Skim Milk: allegato 1)
2.2 Scongelamentocampioni
I campioni sono stati scongelati sul terreno Agar Sangue e in seguito incubati 24 ore a
37°C.
2.3 Estrazione
Il DNA è stato estratto dai ceppi utilizzando la metodica InstaGene™ della ditta Bio Rad,
leggermente modificata (sono stati eliminati i primi due passaggi che consistevano nella
centrifugazione di una colonia batterica risospesa in acqua sterile). Questa metodica si
basa sull’utilizzo di una matrice che lega i prodotti della lisi cellulare che interferiscono con
la PCR, dopo aver semplicemente riscaldato a 95°C i ceppi per permetterne la lisi.
Metodica InstaGene™ modificata:
‐
Mettere 200 µl di InstaGene™ Matrix in una provetta Eppendorf “Safe-Lock”
‐
Con un ansa sterile prelevare una piccola quantità batterica dalla piastra Agar
Sangue e aggiungere alla matrice.
‐
Incubare 10 minuti a 95°C
‐
Centrifugare 10 minuti a 10'000 rpm
‐
Conservare il campione in congelatore fino allo svolgimento della PCR
(Metodica originale InstaGene: Allegato 2)
2.4 PCR
Questo lavoro utilizza l’amplificazione tramite PCR delle sequenze intergeniche (intergenic
space) localizzate tra i geni del 16S e quelli del 23S rDNA.
Si utilizzano dei primers localizzati sulla parte terminale del 16S (il forward) e sulla parte
iniziale del 23S (il reverse) (vedi Fig. 2)
9 La PCR è stata eseguita secondo la metodica messa a punto da Jensen et al. [6] ed
applicata da Fournier et al. [4] senza modifiche.
Tabella 1: Primers utilizzati (sintetizzati dalla ditta Microsynth AG, 9436 Balgach,
Svizzera)
Primers
Sequenza
G1 STAU
5’-GAA GTC GTA A AGG-3’
L1 STAU
5’-CAA GGC ATC CAC CGT-3’
Tabella 2: Mix per la reazione d’amplificazione
Componente
Quantità
Concentrazione finale
Buffer 10X
2.5 µl
1X
dNTP (10 mM)
0.5 µl
200 µM
0.75 µl
0.3 µM
0.75 µl
0.3 µM
HotStarTaq
0.125 µl
2.5 U/reazione
DNA
2.5 µl
≤1 µg/reazione
H2O
17.875 µl
Volume totale
25 µl
Primer G1 STAU
(10 µM)
Primer L1 STAU
(10 µM)
Indagini preliminari non riportate nel presente lavoro, avevano mostrato che
concentrazioni troppo elevate di DNA compromettevano la reazione PCR. Ogni campione
di DNA è quindi stato diluito 1/10 prima di venir aggiunto al mix di reazione di
amplificazione.
10 La reazione di amplificazione è stata svolta utilizzando il cycler AB Applied Biosystems
Veriti 60 seguendo il ciclo seguente:
Tabella 3: Schema della reazione PCR
Fase
Temperatura
Tempo
Attivazione
polimerasi
95°C
15 minuti
Denaturazione
94°C
1 minuto
-
-
55°C
7 minuti
-
-
Estensione
72°C
2 minuti
Estensione finale
72°C
10 minuti
Raffreddamento
4°C
Ramp
Annealing
Ramp
27 cicli
2.5 Elettroforesi
Gli amplificati sono stati fatti migrare in gel di agarosio all’ 1.5% aggiungendo come
colorante il GelRed della ditta Biotium (10 µl in 100 ml). Gli amplificati (8 µl di amplificato e
3 µl di Loading buffer) vengono fatti migrare per circa 45 minuti a 100V. Ogni gel è
caricato contemporaneamente con 8 campioni e due marcatori di taglia posizionati alle
due estremità.
Tabella 4: Schema di preparazione del gel
Materiale
Quantità
Agarosio in polvere
0.6 g
Tampone TBE 1X
40 ml
GelRed
4 µl
11 2.6 Analisideidati
Una volta effettuata l’elettroforesi viene effettuata una foto del gel agli UV.
Fig. 3: Risultato di una delle elettroforesi (2 marker e 8 campioni)
Le immagini delle corse elettroforetiche sono importate nel programma BioNumerics
versione 7.0 (Applied Maths, Belgio) che permette la normalizzazione dei profili, la loro
digitalizzazione ed il loro confronto.
Per la normalizzazione, il profilo delle bande dei marcatori di peso molecolare viene
utilizzato come profilo di riferimento in modo da uniformizzare tutti i profili dei ceppi anche
se fatti migrare in gel differenti.
Dopo la normalizzazione, ogni ceppo viene associato al proprio profilo, confrontato con
tutti gli altri e raggruppato con profili simili.
3. Risultati e discussione
L’amplificazione delle sequenze localizzate tra i geni 16S e 23S dell’rDNA è stata
effettuata su 135 ceppi di S. aureus, di cui 31 già genotipizzati dal Dr. Graber e pertanto
utilizzati come riferimento per il genotipo, e 104 isolati in Ticino tra il 2011 ed il 2012 in 25
Aziende agricole.
In Figura 4 sono riportati i profili dei ceppi analizzati già raggruppati in profili simili; ogni
gruppo, per quanto possibile, comprende un ceppo di riferimento tipizzato da Dr. Graber.
12 Fig. 4: Profili elettroforetici dei ceppi analizzati e confronto con i ceppi di riferimento.
13 14 ND: Non determinato
15 Tabella 5: Suddivisione dei genotipi per Azienda agricola
Azienda Agricola
Numero ceppi analizzati
Genotipi riscontrati (N° ceppi per
genotipo)
A.Z.
1
K (1)
A.G.
9
A (1), B1 (4), B3 (1), C (1), L1 (2)
A.B.
3
B (2), T (1)
B.R.
1
O (1)
B.G.
1
B1 (1)
C.P.
1
K1 (1)
D.G.
19
A (16), A1 (1), E (1), ND (1)
F.F.
1
O (1)
G.A.
3
A (3)
G.L.
2
A (1), B (1)
G.M.
1
Y (1)
G.E.
2
A (1), B (1)
G.U.
2
A (1), E (1)
L.C.
5
B (3), C (1), P (1)
L.A.
1
R (1)
M.P.
1
Y (1)
M.D.
4
B (1), R (1), ND (2)
P.M.
1
B (1)
P.D.
32
B (22), P (9), T (1)
P.G.
1
ND (1)
R.R.
6
R (5), S (1)
R.O.
2
I1 (2)
S.M.
1
A (1)
S.B.
1
1 (O)
V.T.
3
T (2), Y (1)
ND: Non Determinato
16 I 104 ceppi di S. aureus sono stati isolati in 25 Aziende agricole ticinesi. Non ci è purtroppo
dato di sapere se si tratta di campionamenti singoli (1 per capo di bestiame) o ripetuti nel
tempo sullo stesso animale. Non disponiamo neppure delle informazioni sullo stato di
salute o sulla diagnosi delle bestie campionate.
La nostra tipizzazione ha permesso di mettere in evidenza 15 genotipi diversi e di
determinare la loro distribuzione nelle varie aziende. Per 4 dei 104 ceppi analizzati non è
stato possibile determinare il genotipo in quanto il profilo ottenuto non correlava con
nessun profilo di riferimento, e sono stati denominati con ND.
Il 36.5% dei ceppi apparteneva al genotipo B, che viene considerato il più patogeno e più
epidemico. Questo genotipo è stato riscontrato in 7 aziende. In particolare, nell’azienda
P.D. sono stati isolati 32 ceppi in totale, di cui 22 appartenevano a questo genotipo.
Il genotipo A è riscontrato nel 24% dei ceppi e risulta anch’esso particolarmente diffuso
essendo stato isolato in 7 aziende. Nell’azienda D.G. i ceppi del genotipo A
rappresentavano quasi la totalità dei ceppi analizzati.
In ordine d’importanza seguono i genotipi P (9.6% dei genotipi) e R (6.7%). Quest’ultimo è
stato riscontrato in 3 aziende, mentre il genotipo P è stato reperito unicamente
nell’azienda P.D.
17 4. Conclusioni
Questo lavoro ha permesso di genotipizzare 104 stipiti di S. aureus, agente della mastite
nei bovini e isolati in Canton Ticino, tramite la messa a punto nel Laboratorio di
Microbiologia Applicata dell’amplificazione per PCR delle sequenze intergeniche
localizzate tra i geni 16S e 23S dell’rDNA.
Applicando questo metodo ai ceppi ticinesi si è potuto constatare che il genotipo B,
considerato il più patogeno e contagioso, era molto diffuso anche in Ticino.
Inoltre grazie a questo lavoro ora disponiamo di una banca dati contenente 31 ceppi di
riferimento per 31 genotipi diversi.
Con questo lavoro è stato approntato un metodo di tipizzazione di ceppi di S. aureus
agenti di mastite nei bovini che permetterà di indirizzare gli interventi preventivi e
terapeutici in maniera mirata.
5. Ringraziamenti
Ringrazio la Dr.ssa Antonella Demarta e Annapaola Caminada per avermi seguito durante
il mio lavoro, aiutandomi e consigliandomi sul come procedere.
Ringrazio tutto il team del LMA ed il responsabile Dr. M. Tonolla che hanno animato le mie
giornate in laboratorio e che sono sempre stati disponibili ad aiutarmi nel lavoro.
Ringrazio la mia famiglia che mi ha supportato durante tutto il percorso di formazione.
18 6. Bibliografia
[1] [Online]. Available: http://www.agricolaregina.it/servizi/documenti/mastite.pdf. [Consultato il giorno 11 Gennaio 2013]. [2] [Online]. Available: http://www.vetinweb.it/cm_siv/sites/default/files/RUMINANTI%20‐
%2013%20MASTITE_(S._aureus).pdf. [Consultato il giorno 11 Gennaio 2013]. [3] [Online]. Available: http://pubs.ext.vt.edu/404/404‐229/404‐229.html. [Consultato il giorno 25 Gennaio 2013]. [4] Fournier C., Kuhnert P., Frey J., Miseret R., Kirchhofer M., Kaufmann T., Steiner A., Graber H.U.(2008) «Bovine Staphylococcus aureus: Association of virulence genes,genotypes and clinical outcome» Research in in Veterinary Science, 85: 439‐448. [5] [Online]. Available: http://www.izsler.it/izs_home_page/pubblicazioni/00000806_A1/09___ LO_STAFILOCOCCO_AUREO_NEL_BOVINO.html. [6] Jensen M.A., Webster J. A., Straus N. (1993) „Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction‐amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms” Applied and environmental microbiology, 59 (4): 945‐952. 19 7. Allegati
7.1 SkimMilk
Skim Milk • Skim Milk Medium
Formula
Difco™ Skim Milk
Approximate Formula* Per Liter
Skim Milk Powder.................................................... 100.0 g
*Adjusted and/or supplemented as required to meet performance criteria.
Directions for Preparation from
Dehydrated Product
1. Dissolve 100 g of the powder in 1 L of purified water.
2. Warm, if necessary, to completely dissolve the powder.
3. Autoclave at 121°C for 15 minutes.
4. Test samples of the finished product for performance using
stable, typical control cultures.
Procedure
Heat the medium in a boiling water bath for 2-5 minutes
with caps loosened and cool to room temperature with caps
tightened.
Inoculate tubes using a calibrated loop or sterile disposable pipet.
For the study of anaerobic organisms, sterile mineral oil can be
layered over the medium following inoculation.
Incubate tubes, with tightened caps for clostridia and loosened
caps for other organisms, at 35 ± 2°C and read at intervals for
7 days for growth and reactions.
Expected Results
Consult an appropriate reference for the expected reactions for
specific microbial species.4,5
Limitation of the Procedure
Skim Milk Medium supports growth of many microorganisms.
Perform microscopic examination and other biochemical tests
to identify isolates to the genus and species level, if necessary.
20 7.2 MetodicaInstagene
1
Pick an isolated bacterial colony and resuspend it in 1 ml of
autoclaved water in a microfuge tube.
2
Centrifuge for 1 minute at 10,000–12,000 rpm. Remove the
supernatant.
3
Add 200 µl of InstaGene matrix to the pellet and incubate at 56 °C
for 15–30 minutes.
NOTE: InstaGene matrix should be mixed at moderate speed on a
magnetic stirrer to maintain the matrix in suspension. The pipet tip
used should have a large bore, such as a 1,000 µl pipet tip
(Bio-Rad’s catalog # 223-9378).
4
Vortex at high speed for 10 seconds. Place the tube in a 100 °C heat
block or boiling waterbath for 8 minutes.
5
Vortex at high speed for 10 seconds. Spin at 10,000–12,000 rpm for
2–3 minutes.
6
Use 20 µl of the resulting supernatant per 50 µl PCR reaction. Store
the remainder of the supernatant at -20 °C. Repeat step 5 when
reusing the InstaGene DNA preparation.
NOTE: It is important to store the prepared sample at -20 °C.
* The polymerase chain reaction (PCR) process is covered by U.S. patent numbers
4,683,195, 4,683,202, and 4,899,818 which are owned by Hoffman-La Roche, Inc. and
F. Hoffman- La Roche, Ltd. The purchase of this product does not convey a license to
use the process covered by these patents. The user of this product to perform PCR
must obtain a license from Hoffman-La Roche, Inc
21