Obiettivi:
La maggioranza degli agenti terapeutici attualmente in commercio deriva direttamente oppure
indirettamente da molecole provenienti da organismi naturali. I metaboliti secondari sono composti
caratteristici di specifici organismi animali o vegetali e, al contrario dei metaboliti primari, comuni
a tutti gli organismi viventi, sono espressione dell'individualità della specie; inoltre essi non sono
necessariamente prodotti in tutte le condizioni. Per quanto riguarda l’ambiente marino, negli
invertebrati, animali pluricellulari molto primitivi con un basso livello di organizzazione e capacità
di movimento, i metaboliti secondari svolgono funzioni vitali come protezione contro la predazione
o funzioni di mediatori chimici per la relazione con l’ambiente esterno. Lo studio chimico di
organismi marini attraverso la determinazione stereostrutturale di nuovi metaboliti in combinazione
con la valutazione della loro attività biologica costituisce una delle principali tematiche di ricerca
del gruppo presso il quale ho svolto la mia attività di ricerca. L’interesse di tale ricerca è collegato
alla grande opportunità di scoprire molecole da usare come lead compounds per lo sviluppo di
nuove classi di farmaci. In questo ambito, era già stato avviato uno studio sul metabolismo
secondario della spugna Plakortis simplex e, in particolare, dei metaboliti ad attività antimalarica.
La spugna Plakortis simplex (Demospongiae, ordine Homosclerophorida, famiglia Plakinidae), è
una specie piuttosto comune delle barriere coralline dei Caraibi e dell’Oceano Indo-Pacifico. Nel
1978 Faulkner isolò dall’estratto etanolico di Plakortis halichondrioides, la plakortina (1), un
polichetide endoperossidico. Per tale composto fu riportata un’attività antibiotica contro la crescita
di Escherichia coli e di Staphilococcus aureus.1
O
O
COOCH3
1
A distanza di anni, Fattorusso et al. hanno riportato l’isolamento della plakortina in grosse quantità
da Plakortis simplex2 ed hanno individuato per questa molecola una buona attività antimalarica in
vitro (<1 μM) soprattutto sui ceppi clorochino-resistenti.3
La plakortina, grazie alla sua buona attività antimalarica e ad una struttura molecolare più semplice
dell’artemisinina, è stata ritenuta un buon punto di partenza per la progettazione razionale di nuovi
farmaci. Allo scopo di ottenere informazioni circa le relazioni struttura-attività della plakortina sono
state seguite più strategie, tra le quali l’isolamento di metaboliti analoghi da spugne del genere
Plakortis, la determinazione della loro struttura e l'analisi delle relazioni tra variazione della
struttura chimica ed attività antimalarica. L’analisi chimica di diverse spugne del genere Plakortis,
di diversa origine, ha consentito di ricavare ulteriori informazioni sulle relazioni struttura-attività.
Dall’analisi dell’esemplare caraibico, oltre alla plakortina erano stati isolati anche altri polichetidi
endoperossidici che differivano tra loro per la dimensione dell’anello, a cinque o a sei termini, per
la lunghezza, la funzionalizzazione della catena carboniosa e per la configurazione dei centri
asimmetrici.2 Sulla base di questi primi risultati, attraverso un approccio multidisciplinare, che ha
compreso calcoli computazionali (meccanica/dinamica molecolare e calcoli ab initio) coadiuvati e
supportati da esperimenti di laboratorio, si era giunti alla formulazione di un meccanismo d’azione
dei derivati 1,2-diossanici.4 Secondo il meccanismo proposto, la funzione endoperossidica
interagisce con il Fe(II) (come gruppo eme) con conseguente formazione di un radicale all’ossigeno
e successivo spostamento radicalico intramolecolare “through-space” 1,4 o 1,5 sulla catena laterale
di sinistra. Questo porta alla formazione di radicali al carbonio sulla catena laterale che dovrebbero
1
Higgs, M. D.; Faulkner, D. J. Journal of Organic Chemistry 1978, 43, 3454–7.
Cafieri, F.; Fattorusso, E.; Taglialatela-Scafati, O.; Ianaro, A. Tetrahedron 1999, 55, 7045−7056.
3
Fattorusso, E.; Parapini, S.; Campagnuolo, C.; Basilico, N.; Taglialatela-Scafati, O.; Taramelli, D. J. Antimicrob.
Chemother. 2002, 50, 883−888.
4
Taglialatela-Scafati, O.; Fattorusso, E.; Romano, A.; Scala, F.; Barone, V.; Cimino, P.; Stendardo, E.; Catalanotti, B.;
Persico, M.; Fattorusso, C. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 846−856.
2
essere le specie tossiche responsabili dell’attività antimalarica attraverso reazioni intermolecolari
con uno o più target presenti all’interno del plasmodio.
Questi studi hanno consentito di identificare i requisiti farmacoforici essenziali per l’attività
antimalarica, quali il ruolo cruciale della funzione endoperossidica nell’interazione con l’eme;
l’importanza di una catena laterale alchilica per la formazione del C-radicale; il requisito
conformazionale dell’intera molecola, affinché si abbia la giusta orientazione alla funzione
endoperossidica rispetto ai partner intramolecolari per lo shift radicalico.
In tale ambito si inserisce l’attività di ricerca da me svolta negli ultimi due anni, che ha avuto come
obiettivo quello di continuare la selezione nelle risorse naturali per cercare nuovi composti
antiprotozoari.
Attività svolte:
Una parte di questa ricerca è stata condotta presso lo Shanghai Institute of Materia Medica, nei
laboratori del prof. Y.W. Guo, grazie ai finanziamenti del progetto europeo FP7-PEOPLE-2009IRSES. Questo studio ha previsto l'analisi chimica di un campione di Plakortis sp. (ordine
Homosclerophorida, famiglia Plakinidae), raccolto lungo le coste di Yongxing Island e nel Mar
Cinese Meridionale. La spugna essiccata e polverizzata è stata estratta con MeOH, e l'estratto
grezzo è stato concentrato a pressione ridotta a 45 °C. Il residuo è stato poi estratto successivamente
con n-esano, CH2Cl2, AcOEt, e n-BuOH. Parte degli estratti in diclorometano sono stati sottoposti a
cromatografia su colonna di gel di silice (230-400 mesh) eluendo con un gradiente di solvente a
polarità crescente da n-esano a metanolo. Le frazioni ottenute sono state ulteriormente frazionate
mediante HPLC e RP-HPLC fornendo composti puri. La caratterizzazione stereostrutturale dei
metaboliti isolati è stata effettuata attraverso un'ampia analisi spettroscopica basata principalmente
su spettrometria di massa e soprattutto Risonanza Magnetica Nucleare (NMR). Gli esperimenti ESIMS a bassa ed alta risoluzione sono stati eseguiti su uno spettrometro di massa LTQ OrbitrapXL
(Thermo Scientific). Gli spettri CD sono stati registrati su uno strumento Jasco J-710. Gli spettri 1H
(700 e 500 MHz) e 13C (125 MHz) NMR sono stati misurati su spettrometri Varian INOVA. Le
correlazioni 1H-1H sono state determinate attraverso l’esperimento COSY 2D NMR, mentre quelle
1
H-1H attraverso lo spazio state evidenziate utilizzando un esperimento ROESY con un mixing time
di 500 ms. Le connessioni 1H-13C attraverso un legame sono state determinate dall'esperimento
HSQC, quelle attraverso due o tre legami con esperimenti HMBC, ottimizzati per 2,3J di 8 Hz.
Utilizzando lo stesso approccio analitico è stato analizzato un esemplare di Plakortis cfr lita de
Laubenfels raccolto lungo le coste dell'isola Bunaken nel Parco Marino di Bunaken di Manado
(North Sulawesi, Indonesia).
Risultati conseguiti:
L’analisi chimica dell’esemplare cinese di Plakortis sp. (order Homosclerophorida, family
Plakinidae) ha condotto all’isolamento di cinque nuovi endoperossidi polichetidici (3, 5-8), insieme
a due analoghi noti (2 and 4), ampliando la libreria di composti antimalarici a nucleo
endoperossidico.5
Gli endoperossidi isolati sono stati testati per la loro attività antimalarica in vitro contro i ceppi di
Plasmodium falciparum, mostrando un range di valori di IC50 nell’ordine micromolare.
Le relazioni struttura-attività sono state analizzate attraverso un’attenta analisi computazionale e
razionalizzate alla luce del meccanismo di azione proposto per questa classe di composti. Questi
studi hanno ulteriormente confermato l’importanza della configurazione relativa dei centri coinvolti
nella formazione della specie radicalica, consentendo di costruire un modello farmacoforico 3D
“lead” per la possibile sintesi di antimalarici a nucleo diossanico. Attualmente, l’analisi chimica di
questo esemplare di Plakortis è ancora in corso, ed in particolare sono oggetto di studio altri
derivati polichetidici (furano esteri e γ-lattoni). E' attualmente oggetto di analisi la loro
caratterizzazione stereostrutturale e la loro origine biogenetica.
Questa variabilità strutturale è di considerevole interesse in quanto, in molti casi, è strettamente
correlata ad un’ampia variabilità nella loro attività biologica. Un esempio significativo è dato dal
confronto tra la plakortina ed i manadoperoxide (manadoperoxide B, 9), derivati preossichetalici
isolati da un esemplare indonesiano di Plakortis.
In questi composti, è stato dimostrato che la differente configurazione relativa e la presenza di un
sostituente metossilico in posizione 6 impedisce alla funzione endoperossidica di interagire con il
ferro dell’eme, comportando una forte diminuzione dell’attività antimalarica (IC50 > 5-10 µM).6 Al
contrario, i manadoperoxide hanno mostrato una potente attività contro un altro protozoo, il
Trypanosoma brucei rhodesiense (0.003 μM).7 Le tripanosomiasi africane (dette anche malattie del
sonno) sono patologie umane causate dagli organismi unicellulari protozoari Trypanosoma brucei
gambiense (nell'Africa centrale e settentrionale) e Trypanosoma brucei rhodesiense (nell'Africa
orientale e meridionale), trasmesse all'uomo dai morsi delle mosche tse-tse (Glossina genus), che
sono state infettate da altri uomini o animali che ospitano il parassita patogeno per l'uomo. 8 Recenti
studi hanno stimato che la malattia del sonno colpisce 60 milioni di persone in 36 paesi con un
range di infezioni tra 50.000 e 70.000 per anno, classificandola come la terza malattia tropicale più
5
Chianese, G.; Persico, M.; Yang, F. Lin, H.W.; Guo, Y.W.; Basilico, N.; P.; Taramelli, D.; Taglialatela-Scafati, O.;
Fattorusso, C. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2014, 22, 4572-4580.
6
Fattorusso, C.; Persico, M.; Calcinai, B.; Cerrano, C.; Parapini, S.; Taramelli, D.; Novellino, E.; Romano, A.; Scala,
F.; Fattorusso, E.; Taglialatela-Scafati, O.; J. Nat. Prod. 2010, 73, 1138–1145.
7
Chianese, G.; Fattorusso, E.; Scala, F.; Teta, R.; Calcinai, B.; Bavestrello, G.; Dien, H. A.; Kaiser, M.; Tasdemir, D.;
Taglialatela-Scafati, O. Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 7197.
8
C. Burri, S. Nkunku, A. Merolle, T. Smith, J. Blum, R. Brun Lancet 2000, 355, 1419–1425.
devastante al mondo.9 Il trattamento delle tripanosomiasi africane è ancora oggi basato su poche
molecole, per lo più introdotte un centinaio di anni fa. Pertanto, in questo scenario l’individuazione
del manadoperoxide B come un potente agente tripanocida apre la strada verso la ricerca di nuovi
derivati endoperossichetali attivi contro il Tripanosoma. In tale ambito si inserisce il secondo
progetto da me condotto che mi ha vista impegnata nell’analisi di un esemplare di Plakortis cfr lita
de Laubenfels, una specie ampiamente distribuita nell’Oceano Indo-pacifico occidentale, raccolta
lungo le coste del Bunaken Marine Park di Manado (North Sulawesi, Indonesia). L’analisi chimica
di questo organismo ha fornito, oltre al potente agente tripanocida manadoperoxide B (9) due nuovi
analoghi: il suo precursore acido (10) ed il suo isomero geometrico 12-isomanadoperoxide B (11).
La disponibilità di consistenti quantità di prodotto naturale mi ha consentito di preparare degli
analoghi semisintetici del manadoperoxide B (12-14) al fine di valutarne il diverso comportamento
tripanocida e la citotossicità.10
Questi studi hanno rivelato importanti relazioni struttura-attività da considerare nella progettazione
di agenti tripanocidi semplificati a nucleo endoperossichetalico. In particolare, i nostri dati
convalidano l’individuazione dell’anello 1,2-diossanico come porzione farmacoforica chiave, ma
indicano come altro punto importante per l’attività il sistema dienico in catena laterale.
Infine, durante la purificazione cromatografica dell’estratto organico di Plakortis cfr. lita ho isolato
tre derivati steroidei: il noto incisterolo A2 (15) e i nuovi incisteroli A5 (16) e A6 (17). L’incisterolo
A5 presenta in catena laterale un sistema 17S-etil-15E,18-diene, trovato per la prima volta in un
organismo marino. I nuovi incisteroli A5 e A6 hanno mostrato essere dei potenti agonisti del
recettore PXR (pregnane X receptor), mentre l’analogo A2 ha mostrato solo una scarsa attività
agonista del recettore PXR. Pregnane X Receptor (PXR) sono recettori metabolici nucleari e
vengono attivati dagli acidi biliari nei tessuti enteroepatici. Gli incisteroli, possono essere visti
quindi, come un nuovo chemotipo di agonisti PXR, con potenziali applicazioni in malattie umane
associate ad una disregolazione del sistema immunitario.
MeO
MeO
O
O
H
15
O
9
MeO
O
H
16
O
H
17
O
Chianese, G.; Scala, F.; Calcinai, B.; Cerrano, C.; Dien, H. A.; Kaiser, M.; Tasdemir, D.; Taglialatela-Scafati, O. Mar.
Drugs 2013, 11, 3297-3308.
10
Chianese, G.; Sepe, V.; Limongelli, V.; Renga, B.; D'Amore, C.; Zampella, A.; Taglialatela Scafati, O.; Fiorucci, S.
Steroids, 2014, 83, 80-85
Strutture ospitanti:
1. Dipartimento di Farmacia Università degli Studi di Napoli Federico II
Via Montesano 49, I- 80131, Napoli
Tutor: Prof. Orazio Taglialatela Scafati, PhD
Professore di Chimica Organica (CHIM/06)
Dipartimento di Farmacia
Università di Napoli Federico II
Via D. Montesano 49, I-80131, Napoli (Italy)
Tel: 0039-081-67850
Fax: 0039-081-678552
Mail: [email protected]
Website: <https://www.docenti.unina.it/orazio.taglialatela%20scafati>
2. Shanghai Institute of Materia Medica - Medica Chinese Academy of Sciences .
555 Zuchongzhi Road, Zhang Jiang Hi-Tech Park, Pudong, Shanghai, P.R.China. 201203
Tutor: Prof. Yue-Wei Guo, PhD
Professor/Ph.D candidate supervisor, Principal Investigator
Shanghai Institute of Materia - Medica Medica Chinese Academy of Sciences .
555 Zuchongzhi Road, Zhang Jiang Hi-Tech Park, Pudong, Shanghai, P.R.China. 201203
Tel: +86-21-50805813
Mail: [email protected]