TEST GENETICI NELLA INVESTIGAZIONE SU
FRODI ALIMENTARI
Enrico Novelli
Dipartimento di Sanità Pubblica, Patologia Comparata e Igiene
Veterinaria, Università degli Studi di Padova
Gli alimenti
ECONOMICA
NUTRIZIONALE
energetica
plastica
regolatrice
EDONISTICA
ORGANOLETTICO
SENSORIALE
RELIGIOSA
FUNZIONALE
NUTRACEUTICA
SICUREZZA
ETICA
Gli alimenti contengono
macrocomponenti
acqua
proteine
grassi
zuccheri
minerali
microcomponenti
vitamine
antiossidanti
enzimi
composti azotati non proteici
gas disciolti
acidi nucleici
La produzione degli alimenti
Macellazione
Mungitura
Pesca
Ovodeposizione
Alveare
Raccolta
trasformazione
Produzioni
primarie
Produzioni
secondarie
Stagionatura
Fermentazione
Caseificazione
Cottura
Sterilizzazione
Congelazione
Essicazione
Acidificazione
Conservazione
Organolettica
Profonda e irreversibile modificazione delle
proprietà chimico-fisiche dei macro e micro
componenti
Acqua
evapora
legata
Proteine
Grassi
Zuccheri
Minerali
denaturazione
lipolisi
caramellizzazione
stato di
proteolisi
ossidazione prodotti di Maillard ossidazione
Acidi nucleici
trasformazioni
frammentazione
tempo
componente
più stabile
L’aspetto economico delle produzioni
alimentari implica
Osservanza della legislazione alimentare
Conoscenze tecniche
Professionalità
Lealtà e trasparenza
Sicurezza alimentare
Sicurezza – Tracciabilità – Etichettatura (Reg. 178/2002)
Etichetta e trasparenza (Dir. 13/2000)
Etichetta e allergeni (Posizione comune 16/2003)
Etichettatura carne bovina (Reg. 1760/2000)
Alcuni frodi alimentari e le rispettive filiere
Carne e prodotti a base di carne
residui di sostanze (additivi tecnologici, farmaci, ormoni) la
cui presenza è conseguente al mancato rispetto dei tempi di
Fra i prodotti a base di carne frequente è
sospensione;
la frode
di falsificazione
consistente
uso fraudolento
di promotori
di crescita;
vendita
di prodotti
generici,
o
aggiunta dinella
sostanze
in grado
di liberare
SO2 (solfiti,
bisolfiti,
di normale alle
qualità,
prodotti
di scopo
alta qualità
o
metabisolfiti,ecc)
carniper
macinate
allo
di prolungarne
addirittura
a denominazione
di imbrunimento;
origine.
la vita conservativa
evitando
la comparsa di
presenza di carni di specie diversa dal dichiarato;
impiego di sostanze leganti o altri additivi non consentiti
(coloranti, antimicrobici);
Latte
tenore in grasso differente al dichiarato;
trattamenti di risanamento non consentiti;
latte ottenuto dalla ricostituzione del latte in polvere;
aggiunta di sostanze a potere battericida;
Formaggi
formaggi ottenuti con latte in polvere ricostituito
(in tutto o in parte);
formaggi pecorini contenenti percentuali più o
meno elevate di latte vaccino;
mozzarelle di bufala contenenti percentuali più o
meno elevate di latte vaccino;
applicazione del marchio di tutela a formaggi
comuni;
Prodotti della pesca
vendita di prodotti non freschi per freschi;
vendita di prodotti non rispondenti alla qualità richiesta
(vendita di un prodotto di basso pregio per uno di alto
pregio, esempio vendere pagro o pagello per dentice,
totano per calamaro, ecc.);
vendita di prodotto decongelato per fresco;
Utilizzo fraudolento di sostanze igroscopiche
Miele
aggiunta di zuccheri;
vendita di un miele di una origine botanica diversa da
quella dichiarata;
vendita di mieli extracomunitari per mieli italiani senza
la relativa dichiarazione in etichetta;
Olio
olio extravergine contenente oli raffinati, sia di oliva
che di semi;
oli con tenori analitici non rispondenti ai requisiti
previsti dai regolamenti comunitari;
Pasta
uso di farine di grano tenero (compromette le qualità
organolettiche della pasta);
impiego di altri cereali meno costosi (e conseguente
decadimento qualitativo);
uso di semole di qualità scadente o avariate;
aggiunta di coloranti o di additivi chimici per imitare le
paste speciali o le paste all'uovo o per mascherare il tipo
di sfarinato usato;
Riso
varietà di pregio minore a quella indicata;
miscela di diverse varietà;
vendita di riso proveniente dall'estero come se fosse
prodotto nazionale;
Nelle produzioni alimentari
si ragiona in termini di
Partita
Trasformazione
Frutta e
verdura
Preparazione
domestica
Latte e carne
Vendita al dettaglio
Magazzino
Prodotti ittici
Distribuzione
Consumo
………..da un punto di vista
strettamente tassonomico
Famiglia
Specie
Razza e Ceppo
Famiglie differenti
Cernia
Tonno
Famiglie differenti
Sogliola (Solea vulgaris)
Passera pianuzza (Platichthys flesus flesus)
Specie differenti
Sogliola (Solea vulgaris)
Foto e testo tratti da: Enciclopedia
illustrata delle SPECIE ITTICHE
MARINE – Paolo Manzoni – I.G.
DeAgostini
Sogliola dal porro (Solea lascaris)
Generi differenti
Orata (Sparus aurata)
Foto e testo tratti da: Enciclopedia
illustrata delle SPECIE ITTICHE
MARINE – Paolo Manzoni – I.G.
DeAgostini
Salpa (Salpa salpa)
Prodotto in filetto
Gli squali
Gli squali
Vertebra asterospondila
Vertebra tettospondila
smeriglio, palombi, pesce volpe, squalo
elefante, verdesca, pesci martello
razze, squadri
Vertebra ciclospondila
spinaroli, gattuccio
Vertebra pseudoasterospondila
torpedini, squalo manzo
I controlli sono difficili…
VENDITA DEL PESCE IN FILETTI, NON INTERO
GRANDI
QUANTITA’
CONTROLLI
DIFFICOLTOSI
SPESSO SURGELATO
GDO
D. M. 14 Gennaio 2005
ALLEGATO
Elenco delle denominazioni in lingua italiana delle specie ittiche di interesse commerciale
Nr.
Ordine
Famiglia
Genere e specie
Denominazione
in lingua italiana
318
Pleuronectiformes
Soleidae
Buglossidium luteum
Sogliola gialla
319
Pleuronectiformes
Soleidae
Dicologlossa cuneata
Sogliola cuneata *
320
Pleuronectiformes
Soleidae
Microchirus ocellatus
Sogliola occhiuta *
321
Pleuronectiformes
Soleidae
Microchirus variegatus
Sogliola fasciata
322
Pleuronectiformes
Soleidae
Pegusa Kleini
Sogliola turca
323
Pleuronectiformes
Soleidae
Pegusa macrophtalma
Pegusa atlantica
324
Pleuronectiformes
Soleidae
Solea lascaris
Sogliola dal porro *
325
Pleuronectiformes
Soleidae
Solea senegalensis
Sogliola atlantica
326
Pleuronectiformes
Soleidae
Solea vulgaris
Sogliola *
327
Pleuronectiformes
Soleidae
Synaptura spp.
Sogliola oceanica
* Già presenti nel D.M. 27 Marzo 2002
Nell’attività di ispezione, vigilanza e controllo degli
alimenti interessano
Specie
Sesso
Età
Origine
Presenza di residui (biologici, chimici, fisici)
Additivi non consentiti
Microrganismi patogeni
Sospetto
Determinare se vi è stata una
sostituzione di specie
Conosco la tassonomia
e dispongo di standard
e sequenze
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Analisi del profilo di
restrizione (RFLP)
Non ho alcuna
informazione
tassonomica
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Sequenziamento
Confronto con sequenze
pubblicate
Sospetto
Determinare se vi è stata una
sostituzione di specie
Conosco la tassonomia
e dispongo di standard
e sequenze
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Analisi del profilo di
restrizione (RFLP)
Non ho alcuna
informazione
tassonomica
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Sequenziamento
Confronto con sequenze
pubblicate
Citocromo b (359 bp)
M M I S G SaA P P
Mustelus mustelus
(M) palombo
Isurus oxyrinchus
(I) smeriglio
Galeorhinus galeus
(G) canesca
Necessità di applicazione
di tecniche più “potenti”
per discriminare soggetti
dello stesso genere
RAPD - AFLP
Polimorfismo batteri del genere Bacillus
tecnica RAPD con primer da 10 bp
Sospetto
Determinare se vi è stata una
sostituzione di specie
Conosco la tassonomia
e dispongo di standard
e sequenze
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Analisi del profilo di
restrizione (RFLP)
Non ho alcuna
informazione
tassonomica
Cyt b mitocondrio
PCR con primer universali
Sequenziamento
Confronto con sequenze
pubblicate
Totale concordanza fra la sequenza campione “PIPPO” e quella
nota “PLUTO”
identificato!
Allergia
Intolleranza
Reazione
immunitaria
Reazione
metabolica
Allergeni alimentari
Responsabili del 9% circa dei casi
di shock anafilattico.
Nei
bambini
gli
allergeni
alimentari sono rappresentati
essenzialmente dalla proteine del
latte, dell’uovo e del pesce,
nonché da alcuni vegetali (ad
esempio dalle arachidi).
Negli adulti sono costituiti
soprattutto da alimenti di origine
vegetale.
FREQUENZA DEGLI ALLERGENI ALIMENTARI
(Popolazione colpita in occidente)
Frequenza
Alimenti
(%)
Pesce
16,3
Uova
14,9
Latte
13,8
Crostacei
13,8
Sedano
6,9
Farina
4,8
Frutta secca
4,7
Mele
4,4
Pesche
4,3
Leguminose
3,8
Patate
2,5
Carne di maiale
1,3
Banane
1,2
Fragole
1,2
Uva
1,1
Yogurt
1,0
Carne di pollo
0,9
Melanzane
0,9
Arance
0,9
Carciofi
0,9
Direttiva Europea 2003/89/CE
Gli ingredienti o le sostanze derivate dai seguenti allergeni
alimentari – cereali contenenti glutine, crostacei, uovo, pesce,
arachide, soia, latte, frutta con guscio, sedano, senape, semi
di sesamo – utilizzati nella produzione alimentare e presenti
nel prodotto finito devono essere obbligatoriamente segnalati
in etichetta indipendentemente dalla quantità.
Proteine del latte Alimenti compositi che ne possono contenere:
prodotti di pasticceria e di gelateria, alcuni
prodotti di salumeria (insaccati: salame,
mortadella, etc.; prosciutto cotto, würstel, alcune
margarine), prodotti di gastronomia (salse,
creme e zuppe vegetali, alimenti preconfezionati
in scatola, etc.)
Proteine dell’uovo oAlimenti
compositi che ne possono contenere:
paste speciali, prodotti dolciari e di gelateria, cibi
impanati e fritti, maionese e salse in genere,
marsala all’uovo, etc.
Mozzarella di
bufala
Formaggio
pecorino
Aggiunta fraudolenta di
latte vaccino
Danno economico (DOP)
Rischio sanitario
Acidificazione
Filatura
Sale
Disidratazione
Tempo
Difficilmente applicabili
tecniche immunoenzimatiche
e elettroforetiche
Insaccati Prodotti in
taglio
Acidificazione
Sale
Disidratazione
tempo
Utilizzo di carne
diversa da quella
dichiarata
Danno economico (DOP)
Rischio sanitario
Aspetti etici e religiosi
Difficilmente applicabili tecniche
immunoenzimatiche e
elettroforetiche
218
141
3 4
5 6 7 8
5 bufalo
6 bufalo
7 bufalo e bovino
8 bufalo e bovino
q: taglia bufalo
nf: taglia bovino
RFLP
Limite di sensibilità 3-10% in
funzione di
temperatura di cottura
concentrazione salina
quantità d’acqua
(presenza di suino)
In alimenti compositi poligrana vi
è la necessità di operare con
oligonucleotidi specifici per la
specie animale d’interesse
Vantaggi
Elevata accuratezza e
sensibilità
Svantaggi
Possibilità di rilevare
tracce di contaminazione
accidentale (difficile
interpretazione)
Analisi dell’amplificato in tempo reale (Real Time) mediante
misura della fluorescenza emessa da un frammento di una sonda
218
141
191
168
1 2 3 4
Sonda integra Sonda idrolizzata
5 6 7 8
L’analisi molecolare “Real Time” ovvia agli
inconvenienti/limiti di quella “End time”
Sensibilità (0,01% vs 0,001%)
Limitato intervallo di linearità (< 2 Log)
Bassa risoluzione
Non automatizzabile
Discriminazione basata sul peso molecolare
Utilizzo di etidio bromuro
Obbligo di analisi post PCR
L’analisi “Real Time” oltre
che qualitativa può essere
quantitativa
Etichettatura degli alimenti
contenenti ingredienti
OGM > 0,9%
(Reg. 1829/2003/CE)
Ricerca di allergeni negli alimenti
ELISA (immunoenzimatico)
“Real Time” PCR
Proteina allergenica
Ingrediente allergenico
Rapido
Facile esecuzione
Strumentazione semplice
Buona sensibilità
Più rapido della “end time”
Conoscenze e abilità tecniche
Strumentazione più complessa
Elevata sensibilità
Falsi negativi
Falsi positivi
Specifico
Applicazioni in campo zootecnico
Emergenza BSE
Relazioni con casi di malattia di
Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) nell’uomo
Bando all’uso di proteine
derivate dai ruminanti
(MBM) per l’alimentazione
degli stessi
MBM (Meat and Bone Meal)
ottenute con drastici trattamenti
termici (130 °C – 2 bar – 20 min)
Impensabile o estremamente
aleatorio l’utilizzo di tecniche
immunoenzimatiche per la
loro identificazione
1 e 3: DNA estratto
da mangime
2: DNA estratto da
farina di carne
1
2
3
Carne in scatola
1: DNA estratto da gelatina
2: DNA estratto da carne
1
2
Amplificato di DNA
della specie bovina
(farina animale)
estratto da mangime
Concentrazione
1
2
3
4
5
187 bp
1: 3%
2: 1%
3: 0,5%
4: 0,125%
5: 0,0625%
Selezione genetica e disciplinari di produzione
La suinicoltura riveste un ruolo di primo piano nel settore
agroalimentare italiano
mangimistica
riproduzione e ingrasso
macellazione
trasformazione
Grande impegno gestionale e economico
per il miglioramento della qualità
genetica quantitativa (QTL)
biotecnologie
nutrizione e allevamento
La suinicoltura italiana presenta delle peculiarità che sono funzione
dei prodotti di salumeria di alto pregio che la caratterizzano
Programma di selezione per l’eliminazione dei riproduttori
potenzialmente PSE (miopatia essudativa)
La PSE ha la stessa base ereditaria dell’ipertermia maligna (MH),
una sindrome che si manifesta in seguito al trattamento anestetico
con alotano (singolo gene recessivo)
Le tecniche biomolecolari hanno permesso di individuare, nei
soggetti portatori di MH, una mutazione nel gene che codifica la
proteina che costituisce i canali che controllano l’eflusso di calcio
durante la contrazione muscolare (Fujii et al., 1991)
Isolati tre genotipi nei confronti della sensibilità
all’alotano Hal 1843™ potenzialmente PSE
DNA
RNAm
CGC
CGC
TGC
UGC
arginina
cisteina
Restrizione dell’amplificato
(74 bp) con Hin PI
74
41
33
Nn NN nn
La mutazione CGC
TGC fa perdere il
sito di restrizione per Hin PI
NN non sensibile dominante
Nn non sensibile
nn sensibile recessivo
Eliminati, nei centri di riproduzione, i soggetti nn e Nn
Considerazioni conclusive
Chi produce e somministra alimenti deve garantire la sicurezza
dei propri alimenti verso il consumatore (istituto
dell’autocontrollo D. Lgs 155/97); il controllo ufficiale svolge
funzione di supervisione, consulenza e verifica (D. Lgs 123/93)
Le tecniche di laboratorio biomolecolari si presentano come
strumenti nuovi e efficaci a supportare l’attività di chi produce gli
alimenti e di chi tutela la salute pubblica
Le potenzialità applicative sono vaste (controllo della specie
animale o vegetale utilizzata fino all’identità dell’individuo)
Ci vuole chiarezza nella definizione degli obiettivi per la scelta
degli strumenti più adatti alle finalità da perseguire (aspetti
economici)