Tecniche ottiche innovative:
applicazioni in medicina
• Microscopia ottica di (auto)fluorescenza
• Microscopia confocale
• Optical tweezers (pinzette ottiche)
campione


I A  I 0  T f  TS   RS  RSp   I 0
Microscopia di (auto)fluorescenza
•
•
•
•
•
•
•
•
cos’è l’autofluorescenza
microscopia ad autofluorescenza
sorgente di eccitazione
il campione
ottiche di raccolta
immagini in autofluorescenza
spettro di autofluorescenza
vantaggi e svantaggi della tecnica
cos’è l’autofluorescenza
• Le cellule ed i tessuti biologici contengono
molecole che, se eccitate con radiazione di
opportuna lunghezza d’onda, sono
fluorogeniche
• L’autofluorescenza è l’emissione di
fluorescenza spontanea, dovuta a fluorofori
endogeni in cellule e tessuti.
• L’ autofluorescenza è così denominata per
essere distinta dalla fluorescenza ottenibile
con marcatori fluorescenti esogeni
(fluorescenza indotta o secondaria).
La tecnica
• sorgente per
l’eccitazione
• ottiche di focalizzazione
• cella con il campione
• ottiche di raccolta
• rivelatore
• analisi dei dati
(Nikon Italia)
Schema di principio
rivelatore
Filtro di raccolta: seleziona la
banda di emissione e blocca
la luce di eccitazione non
assorbita dal campione
II filtro
campione
Filtro di eccitazione: seleziona
la banda di eccitazione
I filtro
sorgente
(misura in trasmissione)
Problemi della tecnica in trasmissione:
- assorbimento della luce di eccitazione da parte del campione
- assorbimento dell’emissione da parte del campione
- diffusione della luce di eccitazione e di emissione da parte del campione
- non si ottimizza la raccolta dell’emissione, a meno di non avere un
condensatore di qualità pari all’obiettivo
- scarsa praticità (non adatta a microscopi invertiti)
rivelatore
tecnica in riflessione
filtro per l’emissione
specchio dicroico
sorgente
filtro per l’eccitazione
obiettivo
campione
- l’emissione non attraversa il campione
- l’obiettivo agisce sia da ottica di focalizzazione che di raccolta
- maggior praticità (microscopi invertiti)
al rivelatore
dalla sorgente
per l’eccitaz.
FLUOR
exc
sorgente per l’eccitazione
• deve avere una buona emissione nella zona
UV-blu dello spettro (300400nm)
• deve avere un’alta brillanza, costante nel
tempo
• in genere si utilizza una lampada ad arco
corto a vapori di mercurio
• in alternativa: lampada a vapori di Xenon; XeHg; luce laser*
il campione
• cellule in condizioni vitali
• fettine sottili di tessuto
• (cellule fissate)
ATTENZIONE A:
 presenza di sostanze fluorescenti nel terreno di coltura
=> lavare le cellule !
 cellule morte: rilasciano fluorofori (endogeni) nel mezzo
=> aumenta il fondo !
 usare vetrini (ed ottiche) non fluorescenti
porta oggetti
c1
c2
copri oggetti
c1,c2: cellule adese sul fondo
ob.
• spessore della cella di misura: paragonabile alle dimensioni di una cellula
• segnale: può provenire in parte dal tampone
emissione
di autofluorescenza
spettro della luce emessa
INFO:
metaboliche
funzionali
immagine della luce emessa
INFO:
strutturali
morfologiche
acquisizione sia dello spettro che
dell’immagine di autofluorescenza
MIAM
(Multispectral Intensity Autofluorescence
Microscopy)
avrò bisogno di:
CCD per imaging di
autofluorescenza
spettrometro
un possibile setup sperimentale
SPECTRUM
ANALYSER
COOLED
CCD
CAMERA
immagini
•
•
•
•
come si acquisiscono
cenni ai sensori CCD
come accoppiare obiettivo e telecamera
risoluzione spaziale
Charge Coupled Device (CCD)
• CCD: array di elementi fotosensibili , lineari o bidimensionali (es.:
512x512; 1024x1024, dimensione elemento tipica 10 m x 10 m)
• I fotoni incidenti sulle zone sensibili generano elettroni
(fotoelettroni) che vengono accumulati in regioni dette pixel
• I fotoelettroni vengono intrappolati nei pixels da un campo elettrico
locale
• La presenza di elettrodi permette di spostare i fotoelettroni sul CCD
• l’intensità del pixel è proporzionale al numero di fotoelettroni
prodotti, ovvero all’energia rilasciata dalla luce incidente
Immagine in bianco e nero.
Il livello di grigio di ogni punto
è proporzionale all’intensità
luminosa che arriva.
CCD
B/N
emissione di
autofluorescenza
in alternativa:
CCD
colori
immagine a colori
Soluzione meno adatta.
Spesso non ha la sensibilità e risoluzione spaziale di una CCD B/N.
emissione di
autofluorescenza
F1
CCD
Immagine B/N.
Intensità dei punti
proporzionale all’intensità
di luce ROSSA incidente
+
F2
CCD
Immagine B/N.
Intensità dei punti
proporzionale all’intensità
di luce VERDE incidente
+
F3
filtro i 3 filtri
revolver con
passa
banda
CCD
Immagine B/N.
Intensità dei punti
proporzionale all’intensità
di luce BLU incidente
=
immagine RGB finale
(ad ogni immagine sostituisco i livelli di grigio
con livelli di Rosso, Verde, Blu rispett.)
BLU
VERDE
ROSSO
3 acquisizioni distinte, in successione temporale
• ricombinazione di immagine
(es.: 3 layer con Photoshop® )
• problemi derivanti dal
movimento del campione e dal
bleaching
immagine finale
come accoppiare la CCD
all’obiettivo
Il flusso di eccitazione focalizzato sul campione
è proporzionale a (NAobj)2
EPI-FLUORESCENZA
(epi- : “raccolgo dalla stessa parte da cui eccito”)
L’intensità di fluorescenza
emessa è proporzionale al
flusso di eccitazione
(se questo non è così elevato
da produrre quenching)
La frazione di autofluorescenza emessa
che viene recuperata dall’obiettivo è
proporzionale a (NAobj)2
Se l’ingrandimento totale sul rivelatore
(fotocamera) è M, verrà proiettata un’immagine di
una superficie M2 volte più grande,
Ovvero
L’intensità che arriva su ogni pixel (I)
è proporzionale a 1/ M2
RIASSUMENDO
I  (NAobj)4 / M2
RISOLUZIONE SPAZIALE
Criterio di Raileigh
E’ la minima
interdistanza r tra 2
punti sorgente visti
come distinti:
r(m) = 0.61  / NAobj
r “piccolo” => grande risoluzione
La risoluzione cresce
proporzionalmente a NA
= 550nm, NA =1.4
r = 0.24 m
Per ottimizzare la risoluzione del sistema microscopio-CCD
La larghezza W del pixel deve essere tale che
W  (rM)/2 = 0.61  M / 2NAobj
Ovvero
M  2W/r
=
rM
W
2 W NAobj / (0.61)
ESEMPIO
Pixel 9x9 m ; = 550nm; NA =1.4
M  2W/r
=
2 W NAobj / (0.61)
M  18/r = 18/0.24 = 75 x
Volendo incrementare la risoluzione dobbiamo far sì che la
distanza tra 2 punti sia almeno di 3 pixel e quindi aumentare M
M  3W/r =27/0.24 =113x
(Tra 75x e 113x la risoluzione non cambia….)
M non dipende solo dall’obiettivo. Per es. nei microscopi Nikon
c’è un’ulteriore ingrandimento 2x o 1.5x sulla porta della
fotocamera
Ricordando che
I  (NAobj)4 / M2
è necessario un compromesso tra intensità del
segnale e risoluzione (ingrandimento)
 Fissata NAobj, I alta => M “basso” => fissata la dimensione dei pixel,
con M basso posso non arrivare a sfruttare la risoluzione dell’obiettivo
 M “alto” => I bassa: fissata NAobj, con M alto posso avere un’intensità
troppo bassa => basso rapporto segnale-rumore
risoluzione spaziale del sistema CCD - obiettivo
• Ci si dovrebbe sempre riferire alla risoluzione spaziale
dell’intero sistema CCD - obiettivo
• Viene a volte definita per la sola CCD, come numero di
pixel totali o come dimensioni dell’elemento sensibile:
non e’ una vera risoluzione!
• dipende
dalla risoluzione spaziale dell’obiettivo e dalle
caratteristiche della camera
• la camera deve essere commisurata all’obiettivo in uso:
e’ inutile usare una camera da 5Mpixel con un obiettivo a
bassa apertura numerica (es.: N.A.=0.4). Otterro’ la
stessa risoluzione spaziale complessiva usando per es.
una camera da 2Mpixel!
Risposta spettrale
• Indica la sensibilita’ alla luce di una data . Il
dato viene presentato come efficienza quantica
(Quantum Efficiency) o come risposta
(Responsivity o Sensitivity) in funzione di .
• Serve a scegliere la camera capace di
rispondere alla banda spettrale della radiazione
considerata.
• Tutti i CCD al silicio hanno una risposta
soddisfacente nel visibile e fino a 1000nm circa.
Esempio
• sensore 512x512 pixel o superiore con pochi difetti
costruttivi
• dimensione del pixel: 5-10 m
• raffreddata (fino a -30 oC)
• tempo di integrazione di immagine:
da 1ms a >30s; tempi tipici: 1-4s
• tempo di svuotamento del sensore (lettura immagine):
2-4s
In pratica: se non si vogliono vedere fenomeni veloci (t<<1s) è
indicata una CCD più sensibile ma più lenta.
Gli elementi ottici del microscopio
(flitri dicroici, lenti, filtri
interferenziali etc. ) riducono la luce
Efficienza di raccolta max 10%
Efficienza media delle camere
CCD
(front illuminated ) circa 40%
nel blu circa 20 %
(back illuminated) circa 70%
nel blu circa 40 %
EFFICIENZA TOTALE 4%
Rumore nelle CCD
Rumore: lo scarto quadratico medio della variazione del segnale catturato da un pixel
• Rumore quantistico: Photon noise (shot noise). Dovuto alla
variazione statistica del numero di fotoni incidenti e portatori di
carica prodotti (N). SNR = N/√N = √N migliora al crescere di N.
Es.: 0.1105 fotoni/(spixel)
• Rumore termico: dark noise (dark current). Dovuto alla
generazione di portatori di carica termici. Cresce con la
temperatura T. Es.: 0.01 50 elettroni/(spixel)
• Rumore elettronico: read noise. E’ relativo ai processi di
conversione della carica prodotta in segnale digitale. Non
dipende dal tempo di esposizione. Dipende poco da T; piu’
importante a bassi livelli di segnale. Es.: 0.1  20 elettroni
rms/pixel
Rumore totale sul segnale:
Dinamica =
Rtot  Rr2  R2s  R2d
Segnale massimo (saturazione)
Rumore
Dinamica usualmente espressa in bit di
risoluzione: es. dinamica di 16 bit
Saturazion e
 216  65.536 livelli
Rumore
binning
• E’ l’accorpamento di piu’ pixel in un unico pixel risultante.
Es.: 600x1000 pixels =>200x125 pixels con binning 3x8
 accresce il rapporto S/N, la sensibilita’, la velocita’ di
acquisizione
 diminuisce la risoluzione spaziale; accresce la corrente
di buio
Usato spesso in modalita’ di preview, o per avere
immagini sufficientemente intense con alto frame rate
(« il segnale che perdo andando veloce, lo recupero con il
binning, perdendo pero’ in risoluzione spaziale »)
per diminuire il rumore
• Rumore quantistico: si accresce il numerodi
fotoelettroni prodotti (se si puo’…)
 (i) eccitazione piu’ intensa (ii) tempi di
integrazione maggiori (iii) binning (iv) CCD con
efficienza quantica piu’ alta
• Dark noise: si raffredda il sensore CCD
(tipicamente T=-5-20 oC, fino a T di N2 liquido)
• Read noise: filtri elettronici. Sensore con
elettronica migliore.
rapporto segnale-rumore: ~ 2
segnale: media dei valori dei pixel della cellula
rumore: media dei valori dei pixel del fondo
1. Aumentare il tempo di integrazione. Aumentare l’intensità di eccitazione.
(pero’: rischio di bleaching e danno cellulare !)
2. Raffreddare maggiormente la CCD
3. Verificare la corretta centratura dell’illuminazione UV
4. Lavare ulteriormente le cellule (con tampone non fluorescente)
spettro di autofluorescenza
• cos’è
• come si acquisisce
• un esempio
 l’emissione di autofluorescenza raccolta dall’obiettivo viene inviata ad uno
spettrometro (es. attraverso una fibra ottica)
 lo spettrometro la separa nei vari colori; il fascio così suddiviso incide su
una telecamera CCD, di larghezza pari alle dimensioni trasversali del fascio.
 l’intensità luminosa, per ogni lunghezza d’onda, viene così trasformata in
segnale (livello di grigio del pixel corrispondente)
immagine di un fascio con spettro fatto di righe
(illuminazione “al neon” del laboratorio)
raccordo fibra-microscopio
CCD per
l’acquisizione
dello spettro
alloggiamento per la fibra ottica
mazzo di fibre
(bandolo)
policromatore
(spettrometro)
arrivo della fibra e
fenditura di ingresso al policromatore
dimensione
trasversale
del fascio
sulla CCD
(=dimensione
maggiore della
fenditura)
dimensione maggiore della CCD: asse della lunghezza d’onda
numero di conteggi
240
220
200
180
160
140
120
100
80
350
400
spettro = istogramma
dei conteggi della CCD
450 500
550
600
650 700
750
N.conteggi()  intensità luminosa ()
spettro corretto
spettro “grezzo”
200
300
intensità (u.a.)
150
100
50
200
150
100
50
0
350
400
450 500
550
600
0
350
650 700 750
400
lunghezza d'onda (nm)
450
500
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
350
550
600
650
lunghezza d'onda (nm)
F correzione per le ottiche
unità arbitrarie
intensità (u.a.)
250
400
450
500
550
600
650
lunghezza d'onda (nm)
700
750
700
750
vantaggi su altre tecniche
• non richiede particolare preparazione del
campione
• scarsamente invasiva (assenza di
fluorofori esogeni)
• campioni in condizioni vitali
• intensità di eccitazione contenuta
• MIAM: info sia morfologiche che funzionali
svantaggi
• il segnale è basso => CCD sensibili, a basso
rumore
• uso di ottiche con bassissima emissione di
fluorescenza
• non tutti i compartimenti cellulari sono
autofluorescenti (es. nucleo)
• minor selettività rispetto alla fluorescenza per lo
studio di specifiche strutture cellulari
• la massima utilità e’ su campioni vivi (ex-vivo)
conclusioni
• emissione di autofluorescenza
• misura del segnale di autofluorescenza:
- sorgente di eccitazione
- campione ed emissione
- raccolta di luce
• analisi dell’emissione:
- immagini
- spettro
MICROSCOPIA CONFOCALE
…cominciamo con un confronto:
1) microscopia ottica convenzionale
non solo il piano di fuoco dell'obbiettivo, ma anche gran parte dello spessore dell'oggetto
biologico sono uniformemente e simultaneamente illuminati
=> le aree sopra e sotto il piano focale di interesse rendono meno distinguibili le
strutture cellulari.
campione


I A  I 0  T f  TS   RS  RSp   I 0
2) microscopia confocale
- la luce emessa da regioni fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo viene eliminata
- l'illuminazione non e' simultanea, ma sequenziale, concentrata come un punto su un singolo
elemento del volume del campione alla volta
- per formare l'immagine, il raggio luminoso di illuminazione esplora il campione secondo uno
schema raster
-sorgente laser: monocromatica, molto sottile e poco penetrante
la luce riflessa o la fluorescenza emessa vengono rilevate da un tubo fotomoltiplicatore e
convertite in segnale digitale (=> monitor)
- principio di Minsky: i sistemi di illuminazione e di rivelazione sono focalizzati sul medesimo
elemento del volume dell'oggetto biologico, ovvero sono confocali
- un filtro spaziale (pinhole), messo davanti al rivelatore, elimina la luce emessa dalle regioni
fuori del piano di fuoco dell'obbiettivo => immagine piu’ dettagliata, perche' vengono eliminate
le informazioni fuori fuoco.
Credit:
Luca Verderame (liceo ISSEL, Finale Ligure)
Giacomo Carrabino (liceo A. Pacinotti, La Spezia)
Gabriele Marino (liceo Grassi, Savona)
vantaggi
• Maggiore risoluzione spaziale
• Maggior contrasto
• miglior sezionamento ottico =>
migliore qualità ricostruzioni 3D
• campioni “sezionabili” in vari
piani spaziali, non solo x-y
• disponibilità di ottime soluzioni
commerciali ma anche “fai da te”
svantaggi
• peggiore risoluzione temporale*
• maggiore invasività (in alcuni casi)
• maggior costo
* vedi pero’ sistemi a molti punti
pinzette ottiche (optical tweezers)
“Tecnica che utilizza luce fortemente focalizzata per
esercitare forze di intrappolamento stabile su oggetti
microscopici, in genere presenti all’interno di una
soluzione acquosa”
“in sostanza, l’oggetto è intrappolato perché si crea, in 3D, una buca di
potenziale stabile, le cui caratteristiche dipendono dalla sorgente, dalla
focalizzazione, dalle caratteristiche fisiche del mezzo e dell’oggetto”
• luce laser ( t.c. bassissimo assorbimento da parte del mezzo e dell’oggetto)
• obiettivi ad alta apertura numerica
• campione tale che nmezzo<noggetto intrappolato
• “oggetto”: 10nm-10µm (es.: batterio, cellula eucariota, sferetta di lattice)
“perché funziona”
Schema di principio
regime di ottica
geometrica
regime di
ottica fisica
Intrappolamento di una sfera dielettrica: regime
di ottica geometrica. Cessione di momento
dall’onda all’oggetto.


dq
Fs  
dt
regime di ottica fisica
si distinguono 2 tipi di forze:
Fg=forza di gradiente
Fs=forza di scattering



Fg    E 2

Intrappolamento verticale
Intrappolamento: piano orizzontale.
W0: semi-larghezza del fascio laser
1. La forza del tweezer aumenta proporzionalmente alla potenza del fascio
laser
2. per ottenere trappole forti è necessario usare fasci con grandi angoli di
convergenza  (fino a 70gradi), altrimenti assialmente la forza di scattering
domina su quella di gradiente
3. per ottenere grandi angoli di convergenza è necessario usare un
obbiettivo ad alta apertura numerica (fino a 1.4) e presentare in ingresso a
questo un fascio di dimensioni maggiori o uguali al suo diaframma di
ingresso
4. il tweezer è più forte radialmente che assialmente
5. la stabilità del tweezer può essere quantificata dal rapporto tra la
profondità U della buca e kBT. Si può definire stabile una trappola in cui è
maggiore di un valore di soglia (per es. 50 o 100) oltre il quale gli effetti di
moto termico possono essere considerati trascurabili e la particella pensata
come “ferma”
6. se l’indice di rifrazione della particella è inferiore a quello del mezzo in cui è
immersa (es. una bolla d’aria in acqua), il tweezer non è stabile poiché la
forza di gradiente cambia verso. L’effetto è repulsivo.
Esempio di setup per una pinzetta ottica accoppiata ad un microscopio
pinzette multiple
• è possibile commutare la posizione di
focalizzazione del laser fra 2 o piu’ punti del
campione
• dovro’ usare per es. un Modulatore AcustoOttico
• frequenza di commutazione: es: 1KHz (mi devo
confrontare con il moto diffusivo dell’oggetto)
• ultima frontiera: pinzette multiple (N>1000)
sfruttando effetti diffrattivi di speciali “chip”
applicazioni
•
•
•
•
•
•
•
•
“chromosome surgery” / genetica
studi su mitosi e motilità cellulare
studi sulla membrana cellulare / fusione cellulare
fertilizzazione in vitro
“scalpello laser”
principi del funzionamento muscolare
protein folding
biofisica di singola molecola / cellulare
CONTRO
PRO
•
•
•
•
•
•
•
applicabile ex vivo, in vitro
permette di manipolare la
singola cellula / batterio /
molecola
utilizzabile insieme a numerose
altre tecniche di microscopia
campione immerso in un mezzo
liquido (es.: soluzione tampone)
scarsa preparazione del
campione
possibilità di misure di forza /
lunghezza (=> parametri
elastici) di tipo “puntuale”
bassi costi (se “basta che
funzioni”)
•
•
•
•
•
•
•
non applicabile in vivo
non applicabile “a secco”
difficilmente applicabile ad un
sistema con N »1 elementi (pur se
microscopico)
difficilmente applicabile ad oggetti
di dimensioni » 10-50 µm
alti costi (se si vogliono grandi
forze, basso rumore, alta
risoluzione spazio-temporale)
ancora non (sufficientemente)
disponibile come “kit all included”
in commercio
non facilmente trasportabile da un
luogo all’altro