Relazione della Dott.ssa Cinzia Mazzei relativa all’attività scientifica svolta presso l’Institute of Ophthalmology dell’UCL, London (UK) “Coinvolgimento del Poro di Transizione Mitocondriale (PTP) nei meccanismi di neuroprotezione del coenzima Q10 in un modello cronico di glaucoma”
Introduzione
Il glaucoma è una neuropatia del nervo ottico, generalmente associata ad un incremento della pressione intraoculare (IOP) che determina morte delle cellule ganglionari retiniche (RGC), con conseguente progressivo deterioramento del campo visivo che può portare alla cecità (Sommer A., 1989). Sebbene non siano ancora stati chiariti i meccanismi esatti che correlano l’incremento della pressione intraoculare con la perdita delle RGC, è ormai noto che la morte delle RGC in diversi modelli sperimentali di glaucoma avviene per apoptosi (Quigley et al., 1995; Garcia­
Valenzuela et al., 1995). Sono state identificate diverse vie di trasduzione del segnale che sono in grado di mediare la sopravvivenza e la plasticità neuronale; tra queste una delle più rilevanti è la via che coinvolge la fosfatidilinositolo­3kinasi (PI3K) (Brunet et al., 2001; Datta et al., 1997). Infatti, in seguito al legame di fattori di crescita, quali il fattore neurotrofico di derivazione cerebrale (BDNF) o il fattore di crescita simil­insulina (IGF) al proprio recettore di membrana, l’attivazione della cascata della PI3K porta alla fosforilazione e conseguente attivazione della serin­treonin kinasi Akt. Akt, quando fosforilata, è a sua volta in grado di inibire, attraverso fosforilazione, alcuni target con azioni proapoptotiche, come Bad (Datta et al., 1999) e la caspasi 9 (Cardone et al., 1998). Pertanto, l’Akt fosforilata potrebbe rappresentare un’importante via di sopravvivenza per le RGC nelle diverse condizioni patologiche in cui si osserva la presenza di fenomeni apoptotici. L’apoptosi è la forma di morte cellulare programmata meglio caratterizzata. Le cellule dei mammiferi possiedono due principali vie apoptotiche che sono conosciute come via intrinseca e via estrinseca (Green & Evan, 2002). I mitocondri giocano un ruolo cruciale nella via apoptotica intrinseca poiché l’aumento di permeabilità della membrana mitocondriale esterna induce il rilascio, dallo spazio intermembrana al citosol, di diverse proteine che comprendono molecole proapoptotiche come il citocromo c, Smac/Diablo, HtrA2 (Omi) e AIF (Green & Evan 2002; Wang X. 2001). In presenza di ATP, il citocromo c si lega ad Apaf­1 attivando la sua oligomerizzazione in seguito alla quale la caspasi 9 è reclutata e va incontro ad autoattivazione. Pertanto, l’aumentata permeabilità della membrana mitocondriale esterna rappresenta un evento cruciale nel processo apoptotico (Desagher & Martinou, 2000). E’ stato osservato che in varie condizioni, quali la presenza di Ca2+ insieme al fosfato inorganico, mitocondri isolati vanno incontro a transizione della permeabilità mitocondriale (MPT) (Kroemer et al., 1995). Tale processo è caratterizzato da un incremento, calcio dipendente, nella permeabilità della membrana mitocondriale interna che provoca perdita del potenziale di membrana (Δψ), rigonfiamento mitocondriale e rottura della membrana mitocondriale esterna (Zoratti & Szabo, 1995; Halestrap et al., 2002). E’ stato ipotizzato che la MPT possa avvenire in seguito all’apertura di un complesso canale chiamato permeability transition pore (PTP) che è costituito da 3 componenti principali: 1.
il canale anionico voltaggio­dipendente (VDAC), localizzato sulla membrana mitocondriale esterna, che è considerato, generalmente, il canale primario attraverso cui i metaboliti diffondono nei mitocondri;
2.
il traslocatore di adenin­nucleotide (ANT), localizzato sulla membrana mitocondriale interna, che opera come porta d’ingresso del poro. Quando occupato da substrati trasportabili, esso si alterna tra 2 conformazioni in cui il sito di legame ADP/ATP può trovarsi o sul lato della matrice mitocondriale (m­state) oppure sul lato citoplasmatico (c­state). In particolare, i ligandi di ANT che si legano durante l’m­state inibiscono la transizione di permeabilità del poro, mentre quelli che si legano allo stato c la attivano. Questo suggerisce che per l’attivazione del PTP è necessaria la conformazione c­state del canale;
3.
la ciclofillina D (Cyp D), una proteina solubile della matrice mitocondriale che agisce come regolatore positivo nell’apertura del MPTP. Infatti, ogni volta che c’è un incremento di calcio essa interagisce con ANT inducendo il cambiamento conformazionale di ANT stesso che porta ad apertura del PTP con conseguente incremento di permeabilità della membrana mitocondriale interna.
Lo stimolo principale per l’apertura del canale è, quindi, l’incremento della concentrazione di calcio nella matrice, anche se la concentrazione richiesta è altamente dipendente dalle altre condizioni all’interno della cellula (Bernardi, 1999). Sono stati identificati, infatti, diversi fattori in grado di aumentare la sensibilità del poro al calcio ma, tra questi, i più potenti e rilevanti sono sicuramente: lo stress ossidativo, la deplezione di ATP, l’incremento di concentrazione del fosfato inorganico e la depolarizzazione mitocondriale (vd Tsujimoto et al., 2006).
La principale conseguenza dell’apertura del poro di transizione è il disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa che impedisce ai mitocondri di produrre ATP e nello stesso tempo stimola attivamente l’idrolisi dell’ATP prodotto mediante glicolisi portando, inevitabilmente, la cellula a morte.
Il ruolo centrale svolto dall’attivazione del poro di transizione nella morte apoptotica, suggerisce un potenziale effetto neuroprotettivo per sostanze in grado di contrastare l’apertura del poro.
L’ubiquinone o coenzima Q10 (CoQ10) è sia un ben noto trasportatore di elettroni nei complessi I, II e III della catena respiratoria mitocondriale, sia uno scavenger ubiquitario di radicali liberi. L’effetto antiapoptotico del CoQ10 dovuto alla sua azione antiossidante è stato ampiamente documentato (Tomasetti et al., 2001; Navas et al., 2002) ma, proprio recentemente, è emerso che esso potrebbe essere in grado di prevenire l’apoptosi anche mediante inibizione del poro di transizione mitocondriale (Papucci et al., 2003).
Pertanto, lo scopo del mio lavoro è stato quello di studiare i meccanismi molecolari attraverso cui il CoQ10 esplica la sua azione neuroprotettiva in un modello cronico di glaucoma nel ratto; in particolare, la mia attenzione si è rivolta allo studio degli effetti su Akt ed ANT, due proteine la cui modulazione potrebbe rendere conto dell’effetto neuroprotettivo del CoQ10 nel modello in esame.
Materiali e Metodi
L’azione neuroprotettiva del CoQ10 è stata analizzata in un modello di ipertensione oculare cronica (OHT) indotta in ratti maschi adulti Dark Agouti (DA) del peso di 200­300g mediante la somministrazione di una soluzione salina (1.80 M) in 2 vene episclerali. I ratti sono stati monitorati dopo 3 settimane dall’innalzamento della IOP (pressione intraoculare) tramite una tecnica non invasiva di imaging utilizzando un microscopio confocale a scansione laser che consente di visualizzare singole cellule apoptotiche, in vivo (Cordeiro et al., 2004). I trattamenti con il veicolo (n=10) e con il CoQ10 0.1% (Visufarma) (n=10) sono stati effettuati, per via topica, 30 minuti prima ed 1 ora e 1 settimana dopo l’innalzamento della IOP. L’analisi istologica è stata eseguita tramite saggi di immunoistochimica su sezioni sequenziali, incluse in paraffina, dello spessore di 5 µm ottenute dagli occhi enucleati e fissati in paraformaldeide (PFA al 4%), utilizzando i seguenti anticorpi: pAkt (1:100 in PBS), e ANT (1:1000 in PBS). L’intensità dello staining è stata valutata tramite un sistema ben noto di “grading” (da ­4 a +4), in cui gli occhi controllo sono stati posti pari a 0 (Shah et al., 1994).
Risultati
I dati ottenuti hanno confermato che il CoQ10, somministrato per via topica, è in grado di ridurre significativamente la morte delle RGC dopo 3 settimane dall’innalzamento della IOP in tale modello cronico di glaucoma indotto tramite OHT (riduzione dell’apoptosi delle RGC del 95.6% rispetto al controllo, p<0.05). Dall’analisi istologica è emerso che ANT e pAkt sono espresse entrambe nello strato delle RGC sia degli occhi controllo che di quelli trattati con il CoQ10; inoltre, il trattamento con il CoQ10 è associato ad una significativa riduzione (p<0.05) dell’espressione di ANT (2.50 ± 0.22 del controllo vs 1.83 ± 0.21 del CoQ10). Al contrario, l’espressione di pAkt risulta più elevata negli occhi trattati con il CoQ10 (1.56 ± 0.50 del controllo vs 1.31 ± 0.31 del CoQ10) anche se tale incremento non è statisticamente significativo.
Sia pAkt che ANT sono due proteine coinvolte nella morte apoptotica: pAkt fosforila Bad, interferendo così con il rilascio di citocromo c dai mitocondri e con la successiva attivazione della cascata caspasica, mentre ANT regola l’apertura del poro di transizione mitocondriale e conseguentemente il rilascio di fattori apoptotici. Quindi, la significativa riduzione dell’espressione di ANT suggerisce che un possibile meccanismo alla base dell’azione neuroprotettiva del coenzima Q10 nel glaucoma cronico potrebbe essere mediato dall’inibizione dell’apertura del poro di transizione mitocondriale con conseguente blocco del processo apoptotico. Pertanto, ritengo di particolare interesse chiarire, con indagini future, il coinvolgimento di ANT e delle altre proteine che costituiscono il canale mitocondriale, VDAC e Ciclofillina D, nei meccanismi protettivi del CoQ10. Bibliografia
1. Green D.R., Evan G.I. (2002) A matter of life and death, Cancer Cell (1) 19–30.
2. Wang X. (2001) The expanding role of mitochondria in apoptosis, Genes Dev. (15) 2922–
2933.
3. Desagher S., Martinou J.C. (2000) Mitochondria as the central control point of apoptosis, Trends Cell Biol. (10) 369–377.
4. Zoratti M., Szabo I. (1995) The mitochondrial permeability transition, Biochim. Biophys. Acta (1241): 139–176.
5. Halestrap A.P., McStay G.P., Clarke S.J. (2002) The permeability transition pore complex: another view, Biochimie (84): 153–166.
6. Crompton M. (2003) On the involvement of mitochondrial intermembrane junctional complexes in apoptosis, Curr.Med. Chem. (10): 1473–1484.
7. Navas P., Fernandez­Ayala D.M., Martin S.F., Lopez­Lluch G., De Caboa R., Rodriguez­
Aguilera J.C., Villalba J.M. (2002) Ceramide­dependent caspase 3 activation is prevented by coenzyme Q from plasma membrane in serum­deprived cells. Free Radic Res. (4):369­74.
8. Tomasetti M., Alleva R., Borghi B., Collins A.R. (2001) In vivo supplementation with coenzyme Q10 enhances the recovery of human lymphocytes from oxidative DNA damage. FASEB J.; (8):1425­7. 9. Papucci L., Schiavone N., Witort E., Donnini M., Lapucci A., Tempestini A., Formigli L., Zecchi­Orlandini S., Orlandini G., Carella G., Brancato R., Capaccioli S. (2003) Coenzyme q10 prevents apoptosis by inhibiting mitochondrial depolarization independently of its free radical scavenging property. J Biol Chem.; 278(30):28220­8.
10. Cordeiro M.F., Guo L., Luong V., Harding G., Wang W., Jones H.E., Moss S.E., Sillito A.M., Fitzke F.W. (2004) Real­time imaging of single nerve cell apoptosis in retinal neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(36):13352­6. 11. Shah M., Foreman D., Ferguson M. (1994) Neutralising antibody to TGFbeta 1,2 reduces cutaneous scarring in adult rodents. J Cell Sci.; (107):1137–1157.
12. Bernardi P. (1999) Mitochondrial transport of cations: channels, exchangers, and permeability transition, Physiol. Rev.; (79): 1127–1155.
13. Sommer A. (1989) Intraocular pressure and glaucoma. Am J Ophthalmol.; (107):186–188.
14. Quigley H.A., Nickells R.W., Kerrigan L.A., Pease M.E., Thibault D.J, Zack D.J. (1995) Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci.; (36):774–786.
15. Garcia­Valenzuela E., Shareef S., Walsh J., Sharma S.C. (1995) Programmed cell death of retinal ganglion cells during experimental glaucoma. Exp Eye Res.; (61):33–44.
16. Brunet A., Datta S.R., Greenber M.E. (2001). Transcription­dependent and ­independent control of neuronal survival by the PI3K­Akt signaling pathway. Curr. Opin. Neurobiol. (11): 297–305.
17. Datta S.R., Brunet A., Greenberg M.E. (1999) Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev. (13): 2905– 2927.
18. Datta S.R., Dudek H., Tao X., Masters S., Fu H., Gotoh Y., Greenberg M.E. (1997) Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell­intrinsic death machinery. Cell (91): 231– 241.
19. Cardone M.H., Roy N., Stennicke H.R., Salvesen G.S., Franke T.F., Stanbridge E., Frisch S., Reed J.C. (1998) Regulation of cell death protease caspase­9 by phosphorylation, Science (282):1318– 1321.
20. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B. (1995) The biochemistry of programmed cell death, FASEB J. (9): 1277–1287.
21. Tsujimoto Y., Nakagawa T. and Shimizu S. (2006) Mitochondrial membrane permeability transition and cell death. Biochim Biophys Acta.; 1757(9­10):1297­300.