INDICE
1- INTRODUZIONE
1.1- Il glutammato nel sistema nervoso centrale……………..….….4
1.2- I trasportatori del glutammato……………………………..….…..5
1.3- Metabolismo del glutammato……………………………………..
1.4- Trasporto del glutammato nel mitocondrio e produzione di
ATP………………………….……………………………………………....10
1.5- Neuroprotezione da modulatori del
metabolismo mitocondriale……………………………..……………..11
1.7- Il calcio e la sintesi di ATP nei mitocondri..……………….…..12
1.8- I mitocondri:
Struttura submicroscopica e funzioni……………………….…..….13
Il mitocondrio nell’omeostasi del Ca2+ intracellulare………….....14
1.9- Lo scambiatore Na+/Ca2+:
Funzione e struttura……………………………………………..……..17
Varianti di splicing……………………………………………….…......18
Localizzazione dello scambiatore Na+/Ca2+……………………….20
Direzionalità di NCX……………………………………………..……..21
Inibitori dello scambiatore Na+/Ca2+………………………………...22
1.8- NCXmito:
Efflusso di calcio sodio-dipendente dal mitocondrio
nel sistema nervoso…………………….……………………..……...23
Identificazione e proprietà biofisiche……………………………….23
I mitocondri scambiano ioni Ca2+ con ioni Na+……………………25
1
La stechiometria di NCXmito…………………………………….……..26
Forward/reverse mode di NCXmito…………………………….……..26
Modulazione ionica dell’ attività di NCXmito………………………..28
Espressione mitocondriale delle isoforme di NCXplm:NCX1, NCX2
e NCX3……………………………………………………………....…..29
Inibitori dell’ attività di NCXmito…………………………………..…..33
Ruolo di NCXmito nella fisiologia del sistema nervoso……..…...35
2- SCOPO DELLA TESI………….…………….37
3- RISULTATI
3.1- Il glutammato stimola la sintesi di ATP in mitocondri
corticali ed ippocampali…………………………………………….……39
3.2- Coinvolgimento di EAAT nella sintesi di ATP stimolata da
Glutammato..…………………………..………………………….……......42
3.3- EAAC1 sostiene l’ ingresso di glutammato nel mitocondrio..45
3.4- Il glutammato induce una depolarizzazione della
membrana mitocondriale………………………………………......…...47
3.5- Ruolo svolto dal calcio e dal sodio nella sintesi di ATP
stimolata da glutammato:coinvolgimento di NCX………….......…47
3.6- Interazione strutturale tra NCX1 e EAAC1….………….………53
3.7- NCX1 modula la sintesi di ATP indotta da glutammato…..…53
2
4- MATERIALI E METODI
4.1- Isolamento della membrana plasmatica e dei mitocondri
da tessuto di ratto e da colture cellulari………….………....…..56
4.2- WESTERN BLOTTING e immunoprecipitazione…………...57
4.3- Immunoistochimica su mitocondri isolati da tessuto
cerebrale……………………………………………………….….…..58
4.4- Microscopia pre-embedding immunoelettronica di
EAAC1………………………………………………………….….…..58
4.5- Microscopia confocale in tempo reale…………...………..59
4.6- Analisi della produzione di ATP……………………….……61
4.7- Esperimenti con ODNs………………………………….……62
4.8- Analisi di PCR………………………………………….………62
4.9- Analisi statistica……………………………………………….62
5- DISCUSSIONE…………………………......63
6- BIBLIOGRAFIA………………………..……68
3
INTRODUZIONE
1.1 Il glutammato nel Sistema Nervoso Centrale
L'acido L-glutammico (Glu) è il più importante amminoacido eccitatorio del sistema
nervoso centrale (SNC) dei mammiferi ed è coinvolto nelle più importanti funzioni cerebrali
come la conoscenza, la memoria e l'apprendimento (Headley PM & Grillner S, 1990;
Danbolt NC, 2001). Il processo della trasmissione neurale eccitatoria ha inizio con il
rilascio pre-sinaptico di Glu nello spazio sinaptico, dove il Glu attiva una varietà di
proteine, incluso: recettori (ionotropici iGluRs e metabotropici mGluRs); sistemi di
trasporto elettrogeno, come gli Excitatory Amino-Acid Transporters (EAAT), ed enzimi
(Michaelis EK, 1998). Il processo di uptake del Glu è elettrogenico e prevede il cotrasporto
di tre ioni sodio, di un protone e di una molecola di Glu. La riassunzione della
configurazione attiva e' invece mediata dal trasporto inverso di uno ione potassio. Al
funzionamento del trasportatore è poi accoppiato un flusso di ioni cloruro, che è attivato da
due delle molecole trasportate, il sodio ed il Glu (Danbolt NC, 2001). La ricaptazione del
Glu dallo spazio intersinaptico influenza la concentrazione di Glu nello spazio
intersinaptico, modulando la risposta postsinaptica. Tale processo influenza la risposta
eccitatoria, non solo attraverso il mantenimento della concentrazione di Glu al di sotto di
valori eccitotossici, ma anche determinando l' interruzione del segnale attraverso la
rimozione e il riciclaggio del neurotrasmettitore all' interno del pool metabolico (Takahashi
M 1997). Un' alterazione della trasmissione glutammatergica è stata correlata a varie
condizioni fisiopatologiche del sistema nervoso centrale. Glu è una neurotossina e
concentrazioni
cerebrali
elevate
sono
coinvolte
in
patologie
neurodegenerative
progressive come il morbo di Alzheimer (Zoia C et al., 2004) e la ALS (amylotrophic lateral
sclerosis) (Heath PR, 2002). Basse e persistenti concentrazioni di Glu sono invece
implicate nella schizofrenia (Butini S et al., 2003). In particolari situazioni patologiche un
4
flusso inverso di Glu attraverso i sistemi di uptake è determinante nell' aumentare la
concentrazione di Glu a livelli eccitotossici stimolando processi neurodegenerativi
cerebrali. Questo meccanismo è stato proposto durante gli attacchi ischemici ed epilettici (
Koch HP et al., 1999; Rossi DJ et al., 2000; Choi DW et al., 1990). Di conseguenza,
farmaci che interagiscono con i sistemi di trasporto (EAATs) attivandoli o inibendoli
possono costituire efficaci strategie terapeutiche per le patologie sopra menzionate.
1.2 Trasportatori del glutammato
Fino ad oggi sono stati identificati cDNA umani che codificano per cinque diversi sottotipi
di trasportatore ( Pines G, 1992; Kanai Y & Hediger WA , 1992; Fairman WA et al.,
1995; Arriza JL et al., 1997; Rossi DJ et al., 2000), denominati EAAT1-5. Il recente
clonaggio e l'espressione di EAAT ricombinanti in sistemi di espressione eterologa hanno
permesso l'investigazione di diversi quesiti concernenti le basi molecolari della funzione
del trasportatore. In particolare, un aspetto importante di questi studi è rappresentato
dall'identificazione dei domini coinvolti nel riconoscimento e trasporto del substrato.
Questi carriers sfruttano il gradiente pressorio del Na+ e del K+, co-trasportando Na+
assieme al Glutammato e contro-trasportando ioni K+ e uno ione ossidrile. Studi sulla
mobilità elettroforetica hanno evidenziato che i trasportatori del Glu sono in grado di
formare omooligomeri a livello della membrana plasmatica (Haugeta et al., 1996). La
struttura molecolare di tali trasportatori è stata oggetto di lunghi dibattiti, dai quali è emerso
che i domini transmembranali (TM) sono 8: i primi 6 domini sono costituiti da α-eliche di
natura idrofilica, tra TM3 e TM4 è presente una grande ansa extracellulare ed inoltre le
estremità N- e C-terminali sono entrambi intracellulari. Nel pannello 1 vengono presentati i
2 modelli fino ad ora presi come riferimento , il modello A elaborato sul corrispondente
5
EAAT2 di ratto da Grunewald e Kanner ( 2000) e il modello B elaborato sul corrispondente
EAAT1 di ratto da Seal et al. (2000) (Pannello 1).
Pannello 1. Modello topologico dei trasportatori del glutammato (Review Danbolt NC
(2001) Glutamate uptake. Prog Neurobiol 65: 1-105).
6
Nel ratto questi carriers hanno nomi differenti (Pannello 2). Quindi all’EAAT 1 corrisponde
il glutamate-aspartate transporter ,GLAST (del ratto), che è il trasportatore con la
diffusione più ampia a livello dell’astroglia che circonda le sinapsi delle cellule del Purkinje;
la sua attività è legata a concentrazioni molto elevate di Glutammato e Na+, come in
condizioni
di
rilascio
massivo
del
neurotrasmettitore.
Invece
nelle
sinapsi
glutammatergiche tra i collaterali del Shaffer e le cellule piramidali, GLAST ha
un’espressione più bassa e prevale il trasportatore EAAT di tipo 2, chiamato Glutammate
Transporter 1 (GLT-1) nel ratto, che è localizzato sempre a livello astrocitario e risulta
molto importante nel reuptake del Glutammato. Inoltre, attraverso GLT1, il glutammato
captato dal fluido extracellulare può essere convertito, all’interno degli astrociti
glutammina, la quale, a sua volta,
in
può essere ricaptata dai neuroni e convertita
nuovamente in glutammato. Il trasportatore di tipo 3, corrispondente
al trasportatore
EAAC-1 (excitatory amino acid carrier) di ratto, è invece fondamentale sui neuroni a livello
post-sinaptico sia nelle cellule del Purkinje sia a livello delle cellule piramidali dell’
ippocampo, e ha un’affinità media per il glutammato. E’ stato anche dimostrato che
EAAC1 non è espresso solo a livello della membrana ma anche a livello citoplasmatico
(Conti et al., 1998), sebbene la sua distribuzione subcellulare rimanga ancora sconosciuta.
Inoltre è stato identificato il trasportatore di tipo 4 che è presente quasi esclusivamente a
livello del cervelletto e delle cellule del Purkinje, ed ha una posizione post-sinaptica (non
direttamente nell’ invaginazione sinaptica ma nelle strette vicinanze), importante quando il
Glutammato è in eccesso e fuoriesce dallo spazio inter-sinaptico.
Infine, EAAT5 è il trasportatore del glutammato che è stato
identificato a livello dei
neuroni della retina.
7
Pannello 2.Distribuzione dei trasportatori del glutammato a livello delle sinapsi
(Review Danbolt NC (2001) Glutamate uptake. Prog Neurobiol 65: 1-105)
8
Sono stati effettuati quindi numerosi studi per sintetizzare composti inibenti EAATs: il
primo inibitore non trasportabile che si è scoperto essere in grado di competere con l’
uptake di Glu è stato il kainato (Johnston et al., 1979) assieme ai suoi derivati, ma
essendo un agonista dei recettori glutammatergici AMPA/KAINATO il suo utilizzo è stato
molto limitato; in seguito sono stati sintetizzati inibitori competitivi non trasportabili come il
DL-threo-β-benzyloxyaspartate (dl-TBOA)(Shimamoto et al., 1998) che però inibisce
indistintamente sia l’attività di GLT1, GLAST e EAAC1 e che presenta una potenza molto
bassa (range micromolare). Recentemente è stato sintetizzato un nuovo analogo
competitivo
non
trasportabile,
il
(2S,
3S)-3-[3-
[4(trifluoromethyl)benzoylamino]benzyloxy]aspartate (TFB-TBOA) che è caratterizzato da
un’elevata affinità per EAATs (nell’ordine delle nanomoli) e da una migliore selettività
(Shimamoto et al., 2004) (Pannello 3)
Pannello 3. Struttura chimica degli inibitori di EAATs.(Review Beart & O’ Shea .
Nature 2007 150:5-17)
9
1.3 Metabolismo del glutammato
Il glutammato dopo essere captato dagli astrociti/neuroni, attraverso EAATs, può seguire 2
differenti vie metaboliche:
a) Può essere trasformato in glutammina mediante una reazione di amidazione da
parte dell’enzima glia-specifico glutammina-sintetasi (Martinez-Hernandez et
al.,1977); la glutammina viene poi ricaptata dai terminali neuronali, dove viene
riconvertita in glutammato (ciclo glutammato-glutammina).
b) Può essere convertito in α-cheto-glutarato attraverso una reazione di deaminazione
eseguita dall’ enzima glutammato deidrogenasi. L’α-cheto-glutarato viene poi
metabolizzato attraverso il ciclo di Krebs a malato, che a sua volta potrà essere
degradato nel ciclo di Krebs o decarbossilato a piruvato e successivamente ridotto
a lattato (McKenna et al., 1996). L’ingresso del glutammato all’ interno del
mitocondrio secondo la teoria classica prevede la mediazione dello shuttle
malato/aspartato (vedi paragrafo successivo), ma alcuni studi condotti da Ralphe
JC et al. (2004, 2005) mostrano un coinvolgimento di EAATs nel metabolismo
mitocondriale del glutammato; infatti esperimenti di immunofluorescenza e di
Western Blotting (quest’ultimi eseguiti su mitocondri isolati dal cuore di ratto)
mostrano un’evidente espressione di EAAT a livello della matrice mitocondriale.
1.4 Trasporto di glutammato nel mitocondrio e produzione di ATP
Si ritiene che il sistema deputato al trasporto del glutammato all’interno del mitocondrio sia
lo shuttle malato-aspartato, fondamentale per la produzione di ATP. Il sistema shuttle del
malato-aspartato (o sistema navetta del malato-aspartato) è un sistema biologico che ha il
fine di trasferire gli elettroni prodotti durante la glicolisi nel citosol alla matrice
mitocondriale attraverso la membrana interna. Questi elettroni, trasportati come ione idruro
10
dal NADH, verranno poi sfruttati nella fosforilazione ossidativa negli eucarioti per generare
ATP. Questo sistema shuttle è indispensabile alla cellula in quanto la membrana interna, a
differenza di quella esterna, è impermeabile al NADH e alla sua forma ossidata NAD+.
Il sistema comprende quattro proteine:
•
La malato deidrogenasi nella matrice mitocondriale e nello spazio intermembrana.
•
L'aspartato
aminotrasferasi
nella
matrice
mitocondriale
e
nello
spazio
intermembrana.
•
Il trasportatore del malato-chetoglutarato nella membrana interna.
•
Il trasportatore del glutammato-aspartato nella membrana interna.
L'enzima più importante nel sistema shuttle del malato/aspartato è la malato deidrogenasi.
La malato deidrogenasi è presente in due forme nel sistema: la malato deidrogenasi
mitocondriale e la malato deidrogenasi citosolica. Entrambi gli enzimi hanno la stessa
funzione, si differenziano solo per la loro localizzazione. Il primo passaggio avviene nel
citosol: la malato deidrogenasi reagisce con l'ossalacetato e con il NADH producendo
malato e NAD+. In questa reazione l'ossalacetato lega un protone e lo ione idruro liberato
dal NADH riducendosi a malato. Una volta formatasi la molecola di malato, il trasportatore
del malato-chetoglutarato la importa nel mitocondrio dal citosol e contemporaneamente
esporta una molecola di chetoglutarato dal mitocondrio al citosol. Una volta nella matrice
mitocondriale il malato viene convertito dalla malato deidrogenasi mitocondriale ad
ossalacetato, nel processo viene rilasciato un H+ e il NAD+ viene ridotto a NADH.
L'ossalacetato viene quindi trasformato in aspartato dall'aspartato aminotrasferasi per
essere trasportato nel citosol. Il gruppo amminico viene fornito dal glutammato che diventa
alfa-chetoglutarato.
L'enzima
necessario
alla
reazione
è
sempre
l'aspartato
aminotrasferasi mitocondriale. In seguito il trasportatore del glutammato-aspartato importa
11
una molecola di glutammato dal citosol alla matrice ed esporta l'aspartato dalla matrice al
citosol. Infine nel citosol l'aspartato viene convertito in ossalacetato dall'aspartato
aminotrasferasi citosolica. Complessivamente il sistema shuttle ha un effetto puramente
ossidoriduttivo: il NADH nel citosol viene ossidato a NAD+, e il NAD+ nella matrice viene
ridotto a NADH. Il NAD+ nel citosol sarà quindi disponibile per essere ridotto in un nuovo
ciclo della glicolisi, mentre il NADH nella matrice potrà cedere i suoi elettroni al complesso
I nel primo passaggio della fosforilazione ossidativa. Dato che rigenera NADH nella
matrice mitocondriale, il sistema shuttle del malato/aspartato massimizza il numero di
molecole di ATP per numero di molecole di NADH prodotte nella glicolisi , risultando in un
guadagno netto di 32 molecole di ATP per molecola di glucosio metabolizzata. Questa
cifra è particolarmente significativa se confrontata con quella del sistema shuttle del
glicerolo fosfato, che invece dona gli elettroni al complesso II (come fa il FADH2). Infatti il
sistema shuttle del glicerolo 3 fosfato è in grado di generare solo 1,5 ATP per NADH
generato nella glicolisi, risultando in un guadagno netto di 30 molecole di ATP per
molecola di glucosio metabolizzata.
1.5 Neuroprotezione da modulatori del metabolismo mitocondriale
Diverse condizioni fisiologiche e patologiche possono alterare la velocità basale di
formazione di anione superossido all’interno dei mitocondri. Una di queste è l’accumulo di
Ca2+ che determina il disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa con conseguente
produzione mitocondriale di radicali liberi. Nelle fasi precoci dell’ipossia–ischemia il
normale uptake del Ca2+ nella membrana interna del mitocondrio, necessaria peraltro per
la regolazione degli enzimi piruvato deidrogenasi e ossiglutarato deidrogenasi, aumenta,
favorendo alterazioni della struttura e del potenziale di membrana, inibizione della sintesi
di ATP, disorganizzazione della catena respiratoria e generazione di radicali liberi. I
12
mitocondri sono particolarmente sensibili al danno ipossico e svolgono un ruolo centrale
nei processi di apoptosi e necrosi. Una loro disfunzione porta al rilascio intracellulare di
notevoli quantità di Ca2+ e di specie reattive dell’ossigeno, responsabili a loro volta di un
ulteriore danno cellulare. Con tali presupposti la ricerca di base, oggi, si propone di
individuare composti in grado di interferire con il metabolismo mitocondriale, alterato in
condizioni patologiche, per poi introdurli nella pratica clinica. Tra questi, grande interesse
sta suscitando nei ricercatori l’impiego della Acetil-L-Carnitina (ALC). Quest’ultima
rappresenta l’estere di carnitina più abbondante nel sistema nervoso (Shug et al., 1982)
ed il trattamento con questa molecola su modelli animali ha evidenziato una sua azione
neuroprotettiva e nuromodulatrice. ALC, infatti, riduce lo stress ossidativo e l’azione dei
radicali liberi e si è dimostrata inoltre in grado di ridurre la perossidazione lipidica
preservando così la cellula dai danni determinati da disfunzioni mitocondriali.
1.6 Il calcio e la sintesi di ATP nei mitocondri
La maggior parte dell’ ATP intracellulare deriva dalla glicolisi citosolica e dalla
fosforilazione ossidativa mitocondriale. Quest’ultima utilizza la catena respiratoria e
produce ATP attraverso l’ATP sintetasi mitocondriale. La presenza dei cofattori ridotti
(NADH, FADH2) è assicurata dall’ossidazione mitocondriale di substrati che derivano da
glucosio, acidi grassi, aminoacidi. Tuttavia il processo di fosforilazione ossidativa è
regolato anche dall’interazione tra il metabolismo mitocondriale e quello citosolico. In
questo senso, l’omeostasi del calcio mitocondriale ricopre un ruolo importante come
dimostra il fatto che tre deidrogenasi del ciclo di Krebs (piruvato deidrogenasi, isocitrato
deidrogenasi, α-chetoglutarato deidrogenasi) sono modulate dalla concentrazione di
calcio.
13
Studi su cellule HeLa e colture primarie di miotubi scheletrici hanno analizzato gli effetti del
segnale costituito dal calcio mitocondriale e citosolico sulla concentrazione di ATP
cellulare. I risultati dimostrano che una variazione della concentrazione di calcio
mitocondriale agonista-dipendente attiva il metabolismo mitocondriale con conseguente
aumento della concentrazione di ATP nei mitocondri e quindi nel citoplasma. Tale evento
dipende dalla consistenza dell’aumento di calcio e dalla disponibilità di substrati
mitocondriali (Jouaville et al.,1999).
Allo stesso modo una diminuzione nell’accumulo di calcio all’interno dei mitocondri
determina un calo della concentrazione di ATP mitocondriale. Dal medesimo studio è
emerso che i transienti di calcio inducono un aumento della concentrazione di ATP
cellulare anche a lungo termine.
1.7 Il mitocondrio
I mitocondri sono organelli intracellulari presenti nelle cellule animali e vegetali, che
svolgono la funzione di produrre l’energia necessaria per la vita della cellula in quanto
rappresentano la sede della respirazione cellulare. Sono organuli generalmente a
bastoncello, ma possono avere anche forma granulare o filamentosa (Pannello 4). I
mitocondri sono numerosi all’interno di una cellula ma la loro quantità può variare a
seconda dei tessuti.
Sono particolarmente numerosi in cellule caratterizzate da un cospicuo e continuo
consumo di energia come ad esempio le cellule renali, muscolari e nervose.
14
Pannello 4. Foto al microscopio elettronico di un mitocondrio
I mitocondri sono soggetti a modificazioni di forma e di volume in rapporto a variazioni
osmotiche e chimiche e a movimenti di spostamento nel citoplasma cellulare. Questi
movimenti sono per lo più passivi, causati da correnti citoplasmatiche, ma i mitocondri
sono capaci anche di movimenti attivi dovuti forse, alla presenza di proteine contrattili
acto-miosino simili.
Struttura submicroscopica e funzioni
I mitocondri sono delimitati da due membrane a doppio strato lipidico selettivamente
permeabili che li separano dall’ambiente citoplasmatico circostante. La membrana esterna
è liscia, mentre quella interna forma numerose invaginazioni, dette creste mitocondriali,
perpendicolari alla parete e più o meno lunghe presenti in numero variabile a seconda del
tipo cellulare e delle condizioni fisiologiche in cui si trova la cellula. Le due membrane
racchiudono e definiscono due spazi: quello intermembrana, che si trova tra le due
15
membrane caratterizzato dalla stessa composizione del citoplasma, e lo spazio
intercrestale o matrice, dove sono presenti enzimi, coenzimi, acqua, fosfati ed altre
molecole.
La membrana esterna è coinvolta nei processi di permeabilità che consentono il passaggio
a sostanze di peso molecolare inferiore ai 10.000 Da (come per esempio gli ioni).
La membrana interna, viceversa, è meno permeabile agli ioni ed è la sede di processi di
fosforilazione ossidativa. Su di essa si trovano, infatti, gli enzimi che costituiscono la
catena di trasporto degli elettroni.
Il mitocondrio nell’omeostasi del Ca2+ intracellulare
Il mitocondrio è caratterizzato da un potenziale di membrana di circa 180 mV, negativo
all’interno, che rappresenta un elevatissimo gradiente elettrochimico per l’accumulo di
Ca2+. Questo potenziale porterebbe la [Ca2+], all’equilibrio, ad un valore di circa 0.1 M.
Tale concentrazione, incompatibile con la vita di questo organello, è prevenuta dall’azione
coordinata di sistemi separati di ingresso e di efflusso di Ca2+, a livello della membrana
mitocondriale interna.
Un sistema di uniporto relativamente aspecifico rappresenta la via di influsso del Ca2+.
Tale sistema, che può trasportare anche altri ioni bivalenti, come Sr2+ e Mn2+, induce un
rapido ingresso di Ca2+ a livello del mitocondrio solo a concentrazioni citoplasmatiche di
quest’ultimo dell’ordine delle micromoli. Queste [Ca2+] sono raggiunte a livello dei siti di
contatto tra mitocondri e reticolo endoplasmatico in seguito alla formazione di microdomini
ad alta [Ca2+] a livello dei recettori di InsP3 (Rizzuto et al., 1993).
Le vie di efflusso del Ca2+ sono invece rappresentate da: antiporto H+/Ca2+ e antiporto
Na+/Ca2+. Tramite il primo sistema, stimolato da valori elevati del potenziale di membrana,
vengono trasportati 2 ioni H+ contro uno ione Ca2+ (Bernardi & Azzone, 1983). Il secondo è
uno scambiatore Na+/Ca2+, in grado di estrudere Ca2+ scambiandolo con Na+ secondo un
16
rapporto stechiometrico 3 Na+ : 2 Ca2+. Il Na+ che si accumula all’interno della matrice
viene espulso nuovamente dall’antiporto H+/Na+ (che scambia 1 Na+ per 1 H+). Questi due
sistemi (H+/Ca2+ e Na+/Ca2+) complessivamente portano all’estrusione di Ca2+ e la loro
combinazione costituisce la via di efflusso del Ca2+ più importante a livello dei tessuti
eccitabili. E’ noto inoltre che l’espulsione del Ca2+ può essere modulata dal potenziale di
membrana con un meccanismo per ora sconosciuto.
1.8 Lo scambiatore Na+/Ca2 +
Funzione e struttura
In seguito alla purificazione della proteina dello scambiatore cardiaco, avvenuta nel 1988
(Philipson et al., 1988), nel 1990, per la prima volta, fu clonato il gene dello scambiatore
Na+/Ca2+ (NCX1) dal muscolo cardiaco di cane (Nicoll et al., 1990). Questo lavoro ha
costituito il punto di partenza per tutti gli studi successivi di biologia molecolare riguardanti
tale sistema di trasporto e ha permesso di chiarire e, soprattutto, di rispondere a numerosi
quesiti circa le relazioni esistenti tra la struttura e la funzione dello scambiatore Na+/Ca2+.
Inizialmente la struttura fu stabilita in base ad un modello che prevedeva 12 segmenti
transmembranari. Successivamente, si evidenziò che il segmento idrofobico iniziale,
costituito da una sequenza di 32 aminoacidi, era solo un peptide segnale che veniva
staccato dal resto della proteina nelle fasi iniziali della maturazione nel reticolo
endoplasmatico (Durkin et al., 1991;Hryshko et al., 1993). La lunghezza totale della
proteina matura dello scambiatore è stabilita essere di 938 aminoacidi. In seguito è stato
proposto un nuovo modello topologico secondo il quale i segmenti transmembranari
sarebbero 9 (Pannello 5) (Nicoll et al., 1999). L’estremità ammino-terminale della proteina
matura, è glicosilata nella posizione 9 (Hryshko et al., 1993) ed è quindi situata nel
versante extracellulare, mentre l’estremità carbossi-terminale è intracellulare. Lo
17
scambiatore consiste di due domini idrofobici, costituiti ciascuno da vari segmenti che
attraversano la membrana plasmatica, separati da un largo loop intracellulare di circa 550
aminoacidi.
Pannello 5. Struttura NCX. Shigekawa M et al. Circ Res. 2001 11;88(9):864-76.
18
Varianti di splicing
Il metabolismo del Ca2+ presenta delle grandi differenze nei vari tipi di tessuti.
Nei tessuti eccitabili, quali ad esempio il muscolo cardiaco, durante le fasi di contrazionerilassamento (Santana et al., 1996) ed il tessuto nervoso, durante il potenziale d’azione, la
[Ca2+]i va incontro a notevoli e transitori aumenti per poi tornare ai valori basali in tempi
brevissimi, mentre nel tessuto renale tutto questo non avviene e la [Ca2+]i risulta essere
costante nel tempo. Nonostante questa differenza nella regolazione del Ca2+, i tre tessuti
risultano tuttavia simili poiché esprimono in grande misura la proteina dello scambiatore
Na+/Ca2+ (Frank et al., 1992; Juhaszova et al., 1996; Kieval et al., 1992; Lytton et al.,
1996) e l’RNA del gene codificante per NCX1 (Kofuji et al., 1992; Kofuji et al., 1993). Dal
momento che lo scambiatore Na+/Ca2+ è così bene espresso in questi tessuti e poiché il
metabolismo del Ca2+ è molto diverso, è facile supporre che lo stesso scambiatore
presenti delle variazioni nella sequenza primaria del cDNA tali da riflettere le differenze
funzionali e tali da giustificare l’esistenza di varie isoforme tessuto–specifiche. Per quanto
riguarda l’isoforma dello scambiatore NCX1, si conoscono almeno 32 ulteriori differenti
isoforme (Schulze et al., 1996); esse sono state ritrovate in diversi tessuti (He et al., 1998;
Reilly and Lattanzi, 1996), ma resta ancora poco chiaro il significato fisiologico e
funzionale di tali varianti di splicing. Negli ultimi anni sono stati identificati altri quattro geni
codificanti la proteina dello scambiatore Na+/Ca2+ , identificati come NCX2 (Li et al., 1994;
Linck et al.,1998; Quednau et al., 1997) ed NCX3 (Linck et al., 1998; Nicoll et al., 1996) . I
prodotti del gene per NCX1 sono ampiamente diffusi nelle cellule del tessuto muscolare
cardiaco, scheletrico e della muscolatura liscia, nelle cellule neuronali e astrocitarie, nel
rene, nel polmone e nella milza (Quednau et al.,1997). I prodotti genici NCX3 ed NCX2,
invece, fino ad ora sono stati rinvenuti solo nel tessuto cerebrale e nella muscolatura
scheletrica (Yu and Colvin, 1997).
19
Localizzazione dello scambiatore Na+/Ca2+
Una delle caratteristiche peculiari dello scambiatore Na+/Ca2+
è la sua specifica
localizzazione nei vari tipi cellulari. Nelle cellule della muscolatura liscia e nelle colture
cellulari neuronali ed astrocitarie, lo scambiatore appare sempre confinato in quelle regioni
della membrana plasmatica che sono in stretta vicinanza a determinate strutture
intracellulari, quali il reticolo sarcoplasmatico (SR), endoplasmatico (ER) e il mitocondrio
(Blaustein et al., 1992; Juhaszova et al., 1996). Questa distribuzione focalizzata della
proteina dello scambiatore, contrasta con la distribuzione uniforme sulla membrana
plasmatica della pompa del Ca2+-ATPasi riscontrata in vari tipi di cellule (Juhaszova et
al.,1996). Tale distribuzione differenziale dei due sistemi di trasporto nell’ambito della
stessa membrana plasmatica, suggerisce che la localizzazione è basata su considerazioni
di tipo funzionale. La pompa del Ca2+-ATPasi, per esempio, potrebbe avere come compito
fondamentale quello di controllare che i livelli di Ca2+ intracellulari restino sempre bassi,
mentre lo scambiatore potrebbe svolgere un ruolo indiretto nel modulare le riserve di Ca2+
all’interno degli organelli citoplasmatici (SR, ER e mitocondrio).
Nelle cellule neuronali lo scambiatore Na+/Ca2+ è espresso in alte concentrazioni
soprattutto a livello delle terminazioni presinaptiche. Ciò fa supporre che potrebbe giocare
un ruolo fondamentale, oltre che nella regolazione dell’omeostasi del Ca2+, anche nella
modulazione dei rilascio Ca2+-dipendente dei neurotrasmettitori (Juhaszova et al., 1996;
Reuter and Porzig,1995). Lo scambiatore è presente inoltre nei processi neuronali (spine)
e nei coni di crescita (Luther et al., 1992), quindi in quelle zone dove transitano e debbano
essere trasportati grandi quantitativi di Ca2+. A livello delle terminazioni nervose, lo
scambiatore e la pompa del Ca2+-ATPasi sono distribuiti in maniera differente a
dimostrazione del fatto che svolgono ruoli diversi (Juhaszova et al., 1996): rispetto allo
scambiatore Na+/Ca2+, la pompa del Ca2+ risulta localizzata più vicina ai siti di rilascio delle
vescicole sinaptiche.
20
Direzionalità di NCX
Studi preliminari effettuati su numerose preparazioni istologiche, indicano che lo
scambiatore Na+/Ca2+ può trasportare il Ca2+ sia all’esterno che all’interno delle cellule e
che tale modo di operare dipende dalla forza elettrochimica trainante, ossia dal gradiente
di concentrazione del Na+ e del Ca2+ e dal potenziale di membrana, ma in maniera
prevalente da particolari condizioni fisiologiche legate ad alcune patologie.
Un fattore cruciale nel determinare la direzione del flusso di calcio, sia in termini di influsso
che di efflusso, è rappresentato dalla stessa concentrazione di calcio intracellulare [Ca2+]i
(Hilgemann, 1990). La [Ca2+]i richiesta per l’attivazione al 50% dello scambio ionico nel
senso di un influsso di calcio, misurata nell’assone gigante di calamaro e nel muscolo
cardiaco (Hilgemann et al., 1992), è dell’ordine di 1 µM in condizioni fisiologiche. Di
conseguenza, solo una piccola frazione degli scambiatori è attiva nelle condizioni della
cellula a riposo in cui la [Ca2+]i è circa 100 nM, mentre è pienamente attivata quando la
concentrazione di calcio intracellulare è nel range micromolare, ossia durante la fase
massimale di attivazione delle cellule eccitabili e secretorie.
L’influsso di Ca2+ è dipendente anche da basse concentrazioni extracellulari di ioni
metallici alcalini incluso il Na+ (Fontana et al., 1995), mentre alte concentrazioni di
quest’ultimo inibiscono l’influsso di Ca2+.
L’attivazione dello scambiatore operante nel reverse mode, è indotta anche da elevate
concentrazioni di [Na+]i, che si raggiungono nel caso di un'inibizione della pompa Na+/K+ATPasi, mediata ad esempio dalla ouabaina (Repke et al., 1984; Taglialatela et al., 1990),
cui consegue una riduzione del gradiente elettrochimico del Na+ attraverso la membrana
plasmatica (Baker and Manil, 1968). In questo caso si verifica un influsso netto di Ca2+
mediato dallo scambiatore.
L’efflusso di Ca2+ è attivato da basse concentrazioni di ioni metallici alcalini presenti a
livello extracellulare ed è inibito da alte concentrazioni di sodio intracellulare (Blaustein,
21
1977). Anche l’efflusso di Ca2+, così come l’influsso, sembra essere attivato dal calcio
intracellulare non trasportato e non necessita della presenza del Ca2+ a livello
extracellulare (Blaustein, 1977). Da quest’ultima osservazione funzionale si evince che lo
scambiatore è una struttura asimmetrica.
L’idrolisi dell’ATP non è richiesta per promuovere l’estrusione del Ca2+ mediata dallo
scambiatore, come dimostrano numerosi studi effettuati su cellule depletate dall’ATP
(DiPolo and Beauge, 1987). Tuttavia, l’ATP citosolico sostanzialmente è capace di alterare
la cinetica dello scambiatore presumibilmente mediante una fosforilazione dei siti attivi
presenti sulla molecola dell’antiporter (DiPolo, 1974; DiPolo, 1976 ) Questa è un’ulteriore
dimostrazione che la struttura dello scambiatore Na+/Ca2+ sia asimmetrica. Tale
asimmetria apparentemente rende lo scambiatore incapace di svolgere la sua funzione in
maniera ottimale poiché mostra delle differenze sia nell’affinità per lo ione Ca2+ su
entrambi i lati della membrana, che nella modulazione della cinetica del trasporto da parte
di vari ligandi.
Inoltre in un recente lavoro di Kim B e Matsuoka si è stato dimostrato che lo scambiatore
sodio-calcio localizzato a livello mitocondriale è influenzato dalla concentrazione di sodio
citoplasmatico che è in grado di modulare i livelli di calcio intramitocondriale in quanto il
suo meccanismo è voltaggio dipendente ed elettrogenico (Kim e Matsuoka, 2008).
Inibitori dello scambiatore Na+/Ca2+
Un importante metodo per analizzare il ruolo fisiologico di un sistema di trasporto, quale
può essere un canale, una pompa o uno scambiatore ionico, è senz’altro rappresentato
dal blocco del sistema mediante l’utilizzo di un inibitore altamente selettivo. Tuttavia,
frequente è anche l’utilizzo di inibitori poco selettivi per identificare e caratterizzare
qualche sistema di trasporto quando il tipo di cellule in questione possiede, in maniera
esclusiva, anche solo una delle proteine implicate nell’attività di trasporto che viene
22
riconosciuta dall’inibitore. E’ il caso dell’amiloride che è stata utilizzata per identificare e
caratterizzare i canali del Na+ presenti nell’epitelio dei tubuli collettori renali di mammifero
(Benos et al., 1992).
Nel caso dello scambiatore Na+/Ca2+, la situazione è alquanto complicata, in quanto non
esistono inibitori con un grado di selettività tale da poter essere utilizzati periodicamente
per caratterizzare lo scambiatore nelle cellule e nei tessuti intatti, a meno che la struttura
non sia più o meno isolata dagli altri sistemi di trasporto del Na+ e del Ca2+. Da circa un
decennio gli inibitori per lo scambiatore Na+/Ca2+ (Kaczorowski et al., 1989) sono oggetto
di studio e notevoli passi in avanti sono stati fatti allo scopo di delineare inibitori ottimali
di tale attività di trasporto. Lo XIP è stato introdotto nel 1991 (Li et al., 1991), mentre più
recentemente è stato descritto un nuovo inibitore non peptidico, un derivato dell’ isotiourea
(Iwamoto et al., 1996; Watano et al., 1996).
Conseguentemente al clonaggio della proteina dello scambiatore (Nicoll et al., 1990),
numerosi laboratori hanno sviluppato degli oligodeossinucleotidi antisenso (AS-ODN) che
esplicano la loro azione inibitoria altamente selettiva mediante l’inibizione dell’espressione
della proteina dello scambiatore (Bland et al., 1996; Lipp et al., 1995).
1.9 NCXmito
Efflusso di calcio sodio-dipendente dal mitocondrio nel sistema nervoso
Il mitocondrio oltre a fornire energia alla cellula è coinvolto anche nei meccanismi di
proliferazione cellulare, eccitabilità cellulare, neuropatie quali atrofie e malattia di
Parkinson (Zeviani & Di Donato, 2004; Finsterer, 2004)
A livello fisiologico il mitocondrio interagisce con altri organelli e compartimenti cellulari
attraverso secondi messaggeri e cascate trasduzionali. Gli ioni calcio sono i fattori meglio
caratterizzati in grado di ricoprire questo ruolo, infatti i mitocondri rilevano i cambiamenti
dei livelli di calcio citosolico e li traducono in un cambiamento dell’attività respiratoria;
23
inoltre i mitocondri modulano le concentrazioni di calcio citosolico sequestrando o
rilasciando il calcio e quindi influenzano i pathway calcio-sensibili (Carafoli et al., 2003).
Di conseguenza il sistema molecolare deputato al controllo dell’influsso/efflusso di calcio
nel/dal mitocondrio può essere considerato un importante sito di regolazione
dell’omeostasi di calcio intracellulare e dell’attività mitocondriale.
Per questo lo
scambiatore mitocondriale sodio-calcio (NCXmito) assume un ruolo fondamentale; NCXmito
esclude ioni calcio dalla matrice mitocondriale in cambio di ioni sodio citosolici, i quali in
definitiva vengono riespulsi nel citosol attraverso lo scambiatore Na+/H+ in cambio di uno
ione H+. Mentre in cellule non eccitabili l’efflusso di Ca2+ è mediato dallo scambiatore
H+/Ca2+, NCXmito è il principale sistema che esclude ioni Ca2+ dalla matrice mitocondriale di
neuroni e altre cellule eccitabili. In condizioni di riposo le concentrazioni di calcio
intramitocondriali sono significativamente più basse di quanto atteso, infatti c’è una forza
trainante, derivante dall’ elevato gradiente elettrico negativo (circa -180 mV) che sostiene
l’ingresso di calcio all’interno del mitocondrio attraverso il canale ionico chiamato Ca2+
uniporter. Considerato il notevole gradiente negativo, le concentrazioni di calcio
intramitocondriali sono state stimate attorno ad un valore di 100 µM, un livello molto più
elevato rispetto a quello osservato sperimentalmente (David et al., 2003; Miyata et al.,
1991; Sheu & Sharma, 1999). Questa discrepanza tra concentrazione attesa e misurata
implica che gli ioni Ca2+ intramitocondriali vengano continuamente rimossi da tale
compartimento, innescando quindi un ciclo futile di influsso/efflusso di calcio. Questo
apparente inutile riciclo può essere un fenomeno fisiologico rilevante che può essere
attivato o represso in differenti subdomini cellulari in accordo con variazioni locali di [Na+] e
[Ca2+] citosolici. Questo riciclo consente ai mitocondri di modulare finemente e
continuamente la propria attività in base alle variazioni di concentrazioni di sodio e calcio
così da modulare le concentrazioni di Ca2+ citosoliche in regioni delimitate. Inoltre l’energia
dissipata per il riciclo del Ca2+ attraverso la matrice mitocondriale, che fisiologicamente
24
risulta irrilevante, diventa sostanziale in condizioni di sovraccarico massivo di Ca2+, come
durante eventi ischemici, per la sopravvivenza cellulare.
Proprietà biofisiche di NCXmito
Uno dei maggiori problemi che limita il nostro studio sul ruolo di NCXmito nel sistema
fisiologico cellulare è la mancanza di informazioni sulla sua struttura molecolare. Poiché
non è stato ritrovato nessun gene codificante per NCXmito nel genoma mitocondriale
(Anderson et al., 1981) si suppone che NCXmito sia codificato da un gene nucleare,
tradotto nel citoplasma e trasferito nel mitocondrio. E’ ancora aperta la questione sul fatto
che il gene codificante per NCXplm ( scambiatore Na+/Ca2+ espresso a livello della
membrana plasmatica) sia lo stesso di quello codificante per NCXmito.
Carafoli et al., (1974) hanno mostrato evidenze che suggeriscono che il mitocondrio
esclude il Ca2+ in cambio di Na+ e che questo effetto è molto specifico perché non si
osserva utilizzando invece ioni K+, Rb+, Cs+ o Mg2+. Ulteriori studi hanno svelato che lo
svuotamento totale di calcio dal mitocondrio si ottiene solo ad elevate concentrazioni di
Na+ in presenza di Rutenio, un bloccante del Ca2+ uniporter (il principale meccanismo di
influsso di calcio mitocondriale). E’ stato anche dimostrato che il Li+ può sostituire il Na+
nel promuovere l’efflusso di Ca2+ (Crompton et al., 1976); questo rappresenta un’
importante differenza da NCXplm, la cui attività di influsso di Ca2+ è stimolata dal Li+
(Annunziato et al., 2004). Studi effettuati su mitocondri isolati da cuore di ratto hanno
dimostrato che questo meccanismo trasporta circa 40 nmoli di Ca2+ per mg di proteine
mitocondriali con una Na+-dipendenza ad andamento sigmoidale (EC50=8 mM) (Crompton
et al., 1976). Esperimenti condotti su mitocondri isolati da vari tessuti hanno dimostrato
che l’efflusso di Ca2+ Na+-dipendente è un fenomeno molto diffuso ed è stato osservato
nel cervello, nel muscolo scheletrico ,nelle ghiandole parotidee (Crompton et al., 1976).
Studi più recenti non hanno confermato la presenza di tale meccanismo in altri tessuti e
25
organi quali fegato, reni e tessuto muscolare liscio, dove l’efflusso di Ca2+ ha luogo
attraverso un meccanismo Na+-indipendente prevalentemente attraverso uno scambio
Ca2+/H+ (Fiskum & Lehninger, 1979; Puskin et al., 1976).
La stechiometria di NCXmito
La stechiometria di NCXmito è da tempo oggetto di dibattito ma a tal proposito la teoria più
condivisa è quella che prevede lo scambio di uno ione Ca2+ con 3 ioni Na+ , allo stesso
modo di NCXplm; inoltre gli ultimi lavori riportano evidenze che il trasporto è asimmetrico:
1) misurando le variazioni di [Ca2+]m e della differenza di potenziale mitocondriale (∆Ψ), in
condizioni in cui viene bloccata la catena respiratoria, Kim & Matsuoka (2008) hanno
dimostrato che il trasporto è elettrogenico;
2) mitocondri in cui è attiva la respirazione cellulare sono in grado di mantenere il
gradiente di Ca2+ anche in condizioni incompatibili con un trasporto di tipo elettroneutro,
come attraverso la dissipazione di ∆pH con nigericina (Jung et al., 1995; Brand et al.,
1985);
3) l’influsso di Ca2+ mitocondriale, in condizioni in cui è inattiva la respirazione cellulare, è
aumentato quando la ∆Ψ è abolita; ciò dimostra che tale processo non è elettroneutro ma
genera corrente opposta al potenziale negativo intramitocondriale.
Forward/reverse mode di NCXmito
Come avviene anche in NCXplm, NCX mito ha diverse modi di operare oltre all’ efflusso di
Ca2+ Na+-dipendente.
Innanzitutto NCX
mito
è in grado di revertire il suo modo di operare (Pannello 6)
consentendo un influsso di calcio all’interno della matrice mitocondriale. Kim e Matsuoka
(2008) hanno dimostrato che la differenza del potenziale di membrana mitocondriale è un
fattore cruciale per stabilire la direzione dello scambio Na+/Ca2+. A conferma di tale ipotesi,
26
gli autori hanno misurato le variazioni della concentrazione di Ca2+ mitocondriale ([Ca2+]m)
che avvengono in cardiomiociti, isolati da ratti adulti, permeabilizzati con saponina in
seguito all’aumento delle concentrazioni citoplasmatiche di Na+ ([Na+]c) e di Ca2+ ([Ca2+]c)
incrementati attraverso la soluzione extracellulare. Questo approccio ha consentito di
osservare un aumento delle [Ca2+]m a seguito dell’aggiunta di [Ca2+]c e, al contrario, una
riduzione progressiva delle [Ca2+]m in funzione dell’aumento di [Na+]c; questo risultato
rappresenta l’effetto dell’attivazione Na+-dipendente di NCXmito, che operando nella
modalità forward, provoca un efflusso di Ca2+ dalla matrice mitocondriale. Diversamente,
se gli esperimenti vengono condotti su cardiomiociti trattati con FCCP e oligomicina, così
da depolarizzare la ∆Ψ, l’aumento di [Na+]c provoca un aumento significativo di [Ca2+]m;
questo risultato rappresenta la conseguenza dell’ attivazione di NCX
mito
nella modalità
reverse in grado di mediare l’influsso di Ca2+ mitocondriale in maniera Na+-dipendente.
Tale ipotesi è supportata anche dal fatto che l’ aumento di [Ca2+]m è bloccato dal CGP37157, un inibitore selettivo di NCXmito. Inoltre ogni aumento massivo di Na+ nel
citoplasma è in grado di provocare parallelamente un aumento di Na+ nel mitocondrio a
causa dell’ alterazione dell’ efflusso di Na+ attraverso il trasportatore Na+/H+, provocata dal
blocco della catena respiratoria, e dall’ aumento dell’ influsso di Na+ attraverso PTP,canali
del Na+ mitocondriali e trasportatotori degli acidi monocarbossilici. La capacità di NCXmito
di revertire il suo modo di operare potrebbe avere un ruolo rilevante nei processi di morte
post-ischemica dove la mancanza di ossigeno blocca la catena respiratoria e si riproduce
una situazione simile a quella verificatasi negli esperimenti di Kim e Matsuoka (2008)
27
Pannello 6. Forward (A)/ Reverse (B) mode di NCXmito
Modulazione ionica dell’attività di NCXmito
Studi di biofisica condotti su mitocondri isolati hanno dimostrato che l’ attività di NCXmito è
modulata da ioni monovalenti, bivalenti e trivalenti.
Ioni K+ interferiscono con l’attività di NCXmito promuovendo lo scambio Na+/Ca2+ e
Ca2+/Ca2+ (Crompton et al 1980; Hayat & Crompton, 1982). Questo effetto è dovuto alla
capacità di K+ di aumentare l’affinità per il Ca2+ nella modalità di trasporto Ca2+/Ca2+ e per
il Na+ nella modalità di trasporto Na+/Ca2+; in mitocondri isolati da cuore di ratto è stato
osservato che il K+ riduce di 9 volte la Km per Sr2+ (utilizzato come surrogato del Ca2+) e di
3 volte la Km per il Na+ (Hayat & Crompton, 1982).
Lo ione H+ localizzato a livello della matrice mitocondriale influenza significativamente l’
attività di NCXmito. Baysal et al. (1991), utilizzando la nigericina per equilibrare il pH intra
ed extra-mitocondriale, hanno scoperto che la massima attività di NCXmito viene espletata
ad un pH di 7.5-7.6, che è molto più acido del pH alcalino misurato nei mitocondri di cellule
28
viventi in condizioni di riposo. L’attività di NCXmito diminuisce notevolmente con
l’acidificazione della matrice inferiore a 7.4 e una riduzione dell’attività si osserva anche a
pH più alcalini. La sensibilità di NCXmito al pH rappresenta probabilmente un ulteriore
meccanismo di regolazione fine dell’omeostasi del Ca2+ mitocondriale in funzione dello
stato metabolico cellulare. Hayat & Crompton (1982), effettuando esperimenti su
mitocondri isolati, hanno ottenuto risultati che suggeriscono il ruolo fondamentale del Ca2+
extramitocondriale nella regolazione dell’ attività di NCXmito, un fenomeno rilevante nell’
omeostasi di [Ca2+]m in risposta a variazioni di [Ca2+]m. In particolare, hanno osservato che
concentrazioni micromolari di Ca2+ extramitocondriale inibiscono il rilascio di Ca2+ indotto
dal Na+. La modulazione del Ca2+ sull’ attività di NCXmito non dipende da un’ azione di
massa né da dal gradiente di Ca2+ di per sé, ma implica la presenza di specifici siti di
regolazione presenti nel versante intramitocondriale dello scambiatore. Altri cationi
divalenti come il Ni2+ (Ligeti et al., 1987), il Ba2+ (Lukàcs & Fonyò, 1986), e Mg2+ (Hayat &
Crompton, 1982) inibiscono NCXmito, presumibilmente agendo a livello del sito regolatorio
del Ca2+.
Inoltre La3+ è un potente bloccante dello scambiatore (Crompton et al., 1977), peculiarità
distintiva rispetto a NCXplm.
Espressione mitocondriale delle isoforme di NCXplm:NCX1, NCX2 e NCX3
Il nostro gruppo ha pubblicato recentemente risultati che dimostrano la capacità di NCXplm
di contribuire, almeno in parte, all’ attività di NCXmito. Attraverso esperimenti di
immunoistochimica e di microscopia elettronica, utilizzando anticorpi isoforma-specifici
abbiamo esplorato la distribuzione subcellulare delle varie isoforme nel sistema nervoso
centrale (Pannello 7 e 7bis). Abbiamo osservato una marcata espressione delle 3 isoforme
sia a livello neuronale che gliale di tutte le aree cerebrali ma in particolare nella corteccia e
nell’ ippocampo. La marcatura non era confinata solo a livello della membrana plasmatica
29
ma un segnale molto evidente si trovava anche a livello della membrana interna
mitocondriale (Minelli et al., 2007). L’isoforma di NCXplm con la più elevata espressione a
livello mitocondriale è NCX2, che viene espresso ugualmente nei neuroni e negli astrociti;
NCX3 è espresso preferenzialmente nei neuroni mentre NCX1 ha una localizzazione
mitocondriale principalmente nell’ ippocampo e non nella neocorteccia, dove è espresso
sia nei neuroni che nella glia. Studi di microscopia elettronica della localizzazione
subcellulare dei mitocondri NCX-positivi hanno evidenziato che negli astrociti i mitocondri
NCX-positivi sono espressi principalmente nei tubuli prossimali mentre nei neuroni sono
localizzati nei dendriti ed, invece,
nel soma neuronale sono presenti in entrambe le
popolazioni cellulari. Inoltre i mitocondri NCX-positivi sono spesso localizzati in prossimità
di specializzazioni post-sinaptiche suggerendo, quindi, un loro coinvolgimento nella
regolazione dell’ingresso di Ca2+ in seguito dell’ attivazione dei recettori post-sinaptici. I
mitocondri localizzati in differenti compartimenti neuronali esprimono diverse isoforme di
NCX: nei dendriti distali il 50% dei mitocondri esprime NCX1, mentre l’immunoreattività per
NCX1 non è stata osservata a livello dei dendriti prossimali e del soma; al contrario
mitocondri NCX2 e NCX3-positivi sono distribuiti in modo omogeneo in tutti i
compartimenti neuronali. Esperimenti di Western Blotting eseguiti su preparati
mitocondriali di differenti aree cerebrali hanno confermato l’ espressione di NCXplm a livello
mitocondriale (Gobbi et al., 2007). Un’interpretazione di questo dato è che l’attività di
NCXmito è dovuta, almeno in parte, alla localizzazione mitocondriale di NCX; l’ipotesi che
una forma non identificata dello scambiatore mitocondriale crossreagisca con i 3 anticorpi
isoforma-specifici non sembra plausibile. Ulteriori studi condotti silenziando selettivamente
le varie isoforme di NCXplm potrebbero chiarire il contributo di tale scambiatore nel
trasporto mitocondriale Na+/Ca2+. Rimangono ancora questioni irrisolte:
1) Come avviene il trasporto delle isoforme di NCX alla membrana mitocondriale
interna. Tali proteine sono codificate da geni nucleari e probabilmente necessitano
30
di proteine e sistemi specializzati in grado di interagire con una sequenza target
dello scambiatore e di trasportarlo nel mitocondrio (Neupert & Herrmann, 2007);
2) Rimane altresì da chiarire l’ eterogeneità della 3 isoforme, in particolare in base alla
loro specifica funzione e regolazione. Assumendo che NCXplm contribuisce
sostanzialmente allo scambio Na+/Ca2+ nel mitocondrio, l’ esistenza di tre differenti
isoforme suggerisce che può esistere una micro-eterogeneità fra i differenti
mitocondri basata sull’espressione specifica delle 3 isoforme di NCX. Questa
sembra una possibilità molto interessante, considerando numerose evidenze che
sottolineano l’ eterogeneità dei mitocondri, un loro comportamento plastico, in grado
di adattare le loro funzioni e la loro morfologia in base alle differenti condizioni
funzionali (Colllins et al.,2002; Yi et al., 2004; Brough et al., 2005).
Se viene confermata l’ipotesi della localizzazione mitocondriale di NCXplm si aprirà la
strada ad una serie di studi volti all’ individuazione dei sistemi di regolazione (es. chinasi e
messaggeri) di NCX mito (Annunziato et al., 2004)
31
Pannello 7. Distribuzione di NCXs in mitocondri di astrociti.(A) Espressione di NCX3
in astrociti neocorticali.(B) Espressione di NCX2 in cellule gliali di ippocampo. (C)
Mitocondri NCX3 positivi a livello della struttura sinaptica di cellule gliali.
(D)Espressione di NCX1 in mitocondri di astrociti nella neocorteccia. (Gobbi P et al.
(2007). Mitochondrial localization of Na+/Ca2+ exchangers NCX1-3 in neurons and
astrocytes of adult rat brain in situ. Pharmacol Res 56: 556-565).
32
Pannello 7bis. Distribuzione di NCXs in mitocondri di neuroni di ippocampo e
corteccia.(A e D) Espressione di NCX1 in mitocondri a livello dei dendriti distali dello
strato radiatum.(B e E) Espressione di NCX2 in mitocondri localizzati nei dendriti di
ippocampo e corteccia. (C) Mitocondri NCX3 positivi a livello dei dendriti in corteccia.
(F)Mitocondri NCX2-positivi nei terminali massonici della CA1.(G e H) Mitocondri NCX2
e NCX3 positivi localizzati nel corpo cellulare. (Gobbi P et al. (2007). Mitochondrial
localization of Na+/Ca2+ exchangers NCX1-3 in neurons and astrocytes of adult rat brain in
situ. Pharmacol Res 56: 556-565).
33
Inibitori dell’ attività di NCXmito
Lo studio del ruolo fisiologico di NCXmito richiede l’utilizzo di cellule intatte viventi poiché
esperimenti condotti su mitocondri isolati richiedono l’utilizzo di condizioni sperimentali che
non consentono di estrapolare informazioni sulla reale fisiologia della cellula.
La mancanza di informazioni sulla struttura molecolare di NCXmito preclude l’utilizzo di
strumenti di biologia molecolare come topi knock-out, nucleotidi anti-senso o siRNA e
prevede un approccio di tipo farmacologico. I primi composti che si sono dimostrati in
grado di bloccare l’ attività di NCXmito sono stati i bloccanti del canale del Ca2+; in
particolare Vàghy et al., (1982) hanno evidenziato che in mitocondri isolati il rilascio di
Ca2+
indotto dal Na+ viene inibito da diltiazem, prenylamine, feniledine, nifedipine e
verapamil con rispettivamente un IC50 di 7, 12, 13, 66 e 150 µM. E’ interessante il fatto
che diltiazem ha mostrato un’enantioselettività, infatti solo la forma D-cis era in grado di
bloccare l’attività di NCXmito. Però questi composti esercitavano un’ elevata attività
inibitoria sui canali del Ca2+ di tipo L che impediva il loro utilizzo su cellule intatte. Matlib e
collaboratori successivamente hanno dimostrato che alcune benzodiazepine bloccano l’
efflusso di Ca2+ indotto dal Na+ nei mitocondri. Il più potente di questa famiglia è il
clonazepam (IC50= 7 µM). Questo inibitore non risulta avere effetti sui canali del Ca2+ ma l’
interferenza esercitata dall’ attivazione dei recettori GABAergici sulla plasmamembrana e
la presenza di specifici recettori GABAergici a livello della membrana mitocondriale
esterna (O’Rourke, 2007) mettono in discussione il suo effetto su NCXmito .
Successivamente Chiesi et al., (1988) hanno identificato un composto molto più selettivo
per NCXmito , il 7-cloro-3,5-diidro-5-fenil-1H-4,1-benzotiazepina-2-on (CGP-37157). Questo
composto è stato sviluppato mediante un disegno razionale, attraverso uno screening
degli analoghi di diltiazem e clonazepam (Pannello 8) per identificare la struttura
fondamentale responsabile dell’ inibizione dell’ attività di NCXmito. Cox et al. (1993) hanno
mostrato, mediante l’ utilizzo di sonde fluorescenti e tecniche di elettrofisiologia, che nei
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cardiomiociti isolati da ratto CGP-37157 (Pannello 8) inibisce l’ efflusso di Ca2+ indotto dal
Na+ con una IC50 di 0.36 µM senza interferire con le correnti di Ca2+ attraverso i canali di
tipo L; inoltre fino a concentrazioni di 10 µM non è stato osservato nessun effetto su
NCXplm e sulla pompa Na+/K+ ATPasi (Cox et al., 1993).
Pannello 8. Struttura chimica degli inibitori di NCXmito
Ruolo di NCXmito nella fisiologia del sistema nervoso
Essendo responsabile dell’efflusso di Ca2+ dalla matrice mitocondriale, NCXmito interferisce
sia con l’omeostasi del [Ca2+]c che del [Ca2+]m e, di conseguenza, influenza i processi
Ca2+-dipendenti nel citosol e nel mitocondrio. Le conoscenze sul ruolo svolto da NCXmito
sono limitate, ma in alcuni lavori si è visto che esso è coinvolto nel controllo:
1) della durata e nell’ entità della risposta di [Ca2+]c evocata dal rilascio di
neurotrasmettitori e potenziali d’azione (Brinley et al., 1978; Rizzuto & Pozzan,
2006; Montero et al., 2000; Frieel & Tsien, 1994)
2) del rilascio di neurotrasmettitori (Raiteri et al., 2002, 2007)
35
3) della plasticità sinaptica (Tang & Zucker, 1997; Garcia-Chacòn et al., 2006; Lee et
al., 2007;Yang et al., 2007)
4) del metabolismo bioenergetico (Denton et al., 1978; Duchen et al., 1990; Cox &
Matlib, 1993; Carafoli et al., 2003)
5) di NO mitocondriale e radicali liberi (Tatoyan & Giulivi, 1998; Marks et al., 2005)
36
SCOPO DELLA TESI
A livello neuronale l’aumento del metabolismo energetico legato ad una stimolazione
sensoriale dipende dal rilascio di glutammato (Sibson NR et al., 1998) ma rimane ancora
da chiarire il meccanismo attraverso il quale il glutammato esplica la sua azione. Secondo
una interpretazione il metabolismo neuronale è sostenuto dal lattato generato dagli
astrociti circostanti a seguito dell’esposizione del glutammato (shuttle del lattato neuroniastrociti). Questa teoria è stata messa in discussione ed è stata formulata un’ipotesi
alternativa secondo la quale è lo stesso glutammato che attiva il metabolismo energetico
neuronale (Panov A et al., 2009).
Prendendo questa ultima ipotesi come riferimento
abbiamo studiato il meccanismo attraverso il quale il glutammato è in grado di stimolare la
produzione di ATP. Innanzitutto, considerato che i mitocondri neuronali e gliali possono
utilizzare il glutammato come substrato alternativo per la respirazione cellulare (dopo una
reazione di transamminazione a α-cheto glutarato), abbaiamo analizzato la modalità di
ingresso del glutammato all’interno del mitocondrio . Infatti è noto che il glutammato entra
nella matrice mitocondriale principalmente attraverso i trasportatori aspartato/malato
(AGCs), una componente dello shuttle malato/aspartato (MAS), ma, recentemente, è stato
proposto che nel tessuto cardiaco il glutammato può entrare nel mitocondrio attraverso
EAATs
(Ralphe JC et al., 2004, 2005). Partendo da questa evidenza sperimentale
abbiamo verificato l’ espressione mitocondriale di EAATs a livello del tessuto corticale e
ippocampale mediante esperimenti di Western Blotting e di microscopia elettronica.
Successivamente
abbiamo
eseguiti
esperimenti
di
videoimaging
meccanismo attraverso il quale il gradiente di Na+, necessario per
per
chiarire
il
il trasporto del
glutammato attraverso la membrana, viene mantenuto.
Nel nostro laboratorio, in precedenza, è già stata descritta l’espressione mitocondriale
dello scambiatore sodio calcio (NCX) ed è stata evidenziata la capacità di trasportare Na +
37
scambiandolo con il Ca2+ secondo il gradiente elettrochimico. La presenza di EAATs e
NCX all’interno del mitocondrio ci ha suggerito quindi un’ipotesi alternativa del
meccanismo attraverso il quale il glutammato entra a livello della matrice mitocondriale. A
sostegno di tale idea abbiamo eseguito esperimenti di coimmunoprecipitazione per
verificare la presenza di un’interazione fisica tra EAAT e NCX in mitocondri isolati da
ippocampo e corteccia.
Infine abbiamo studiato le proprietà farmacologiche e l’interazione funzionale tra EAAT e
NCX al fine di evidenziare l’effetto della loro interazione e quindi la capacità di modulare
la produzione mitocondriale di ATP stimolata da glutammato.
38
RISULTATI
3.1 Il glutammato stimola la sintesi di ATP in mitocondri corticali ed ippocampali
Per stabilire se il glutammato era in grado di aumentare il metabolismo ossidativo
attraverso un’azione diretta a livello mitocondriale abbiamo isolato i mitocondri (fig. 1A)
dalla corteccia e dall’ippocampo di ratto, in quanto rappresentano le due aree più sensibili
a tale neurotrasmettitore.
Si è osservato un aumento significativo della sintesi di ATP nei mitocondri appartenenti a
tali regioni (fig. 1B) dimostrando quindi un coinvolgimento diretto del glutammato nel
metabolismo ossidativo.
A sostegno di quest’affermazione è anche il fatto che
l’oligomicina, un inibitore della F1-F0 sintasi ha inibito la sintesi di ATP stimolata da
glutammato (fig. 1B). Per escludere la dipendenza dell’aumento di ATP da possibili
contaminazioni citoplasmatiche abbiamo incubato l’estratto mitocondriale con il glucosio
che per essere metabolizzato richiede enzimi glicolitici citosolici (Hirrlinger, J. & Dringen,
R, 2010); come atteso, il glucosio non ha incrementato i livelli di ATP nel nostro sistema
(fig. 1C).
39
A
B
Cervello
Mitocondri
Corteccia Ippocampo
Ippocampo
Corteccia Ippocampo
Corteccia
1 ora esposizione
1 ora esposizione
β 1 Integrina
Porine
ATP (nmoli/mg proteine)
ATP (nmoli/mg proteine)
Calnexina
Glutammato 1 mM
50
40
30
20
10
0
Controllo
Glutammato 1 mM
18
15
12
9
6
3
0
Controllo
Oligomicina 1 mg/ml
Oligomicina 1 mg/ml
ANT
C
18
ATP (nmoli/mg proteine)
12
6
ATP (nmol/mg proteins)
D
Ippocampo
11
mM
5 mM
ora esposizione
Glutammato Glucosio
Ctl
30
Glutammato 1 mM
##
##
0
Ctl
10
30
100
9
Corteccia
10 mM
Glucosio
*
10
18
0
* *
20
***
27
***
0
Corteccia
*** p<0.001 vs Ctl
300
DL-TBOA (µ
µM)
Ctl
ATP (nmol/mg proteins)
ATP (nmoli/mg proteine)
Ippocampo
300
30
1 mM
5 mM
1 ora
esposizione
Glutammato Glucosio
Glutammato 1 mM
10 mM
Glucosio
* * * *
* * * *
20
##
10
0
Ctl
10
30
100
300
300
DL-TBOA (µ
µM)
Fig.1 Western Blotting (A) e analisi sulla produzione di ATP (B e C) di estratti mitocondriali di
ippocampo e corteccia che evidenziano la purezza del preparato e analisi dei livelli di ATP in
seguito alla stimolazione di glutammato e alla pre-incubazione con DL-TBOA (D)
40
m: membrane
mit: mitocondri
E
GLAST
GLT1
Ippocampo corteccia
m
mit
m
mit
Ippocampo corteccia
210
m
mit
m
mit
210
131
131
86
86
41
41
EAAC1
Cervello
Ippocampo corteccia
m
mit
m
mit
Stomaco
Testicoli
Fegato
204
210
131
130
92
EAAC1
86
F
38
41
β-tubulina
Ippocampo
Corteccia
F
Glutammato 1 mM
ATP (nmoli/mg proteine)
***
FFff14
ATP (nmoli/mg proteine)
***
21
Glutammato 1 mM
18
***
***
12
3.2 Coinvolgimento
di EAAT nella sintesi di ATP stimolata da glutammato
7
0
Ctl
TFB-TBOA
50 nM
6
0
Ctl
TFB-TBOA
50 nM
Fig 1bis Analisi dell’ espressione delle varie isoforme di EAATs in lisati totali e mitocondri
purificati da ippocampo e corteccia e effetto inibitorio di TF-TBOA sulla produzione di ATP
indotta da glutammato (D)
41
Considerato che il glutammato necessita di essere convertito in α-chetoglutarato per
aumentare il metabolismo ossidativo, abbiamo indagato il meccanismo che consente il suo
ingresso all’interno della matrice mitocondriale. Nella membrana plasmatica dei neuroni e
della glia sono stati identificati proteine specializzate, appartenenti alla famiglia degli
EAATs (Excitatory Amino Acid Transporters), in grado di trasportare il glutammato in
maniera Na+ dipendente (Kanai, Y et al., 1993). Abbiamo quindi considerato la possibilità
che gli EAATs fossero coinvolti nel trasporto di glutammato all’interno dei mitocondri
corticali e ippocampali, un processo che generalmente viene attribuito ai trasportatori
aspartato/glutammato Aralar/AGC1 e Citrin/AGC2 (del Arco A et al., 1998). In linea con
questa ipotesi, abbiamo osservato che la sintesi di ATP stimolata dal glutammato veniva
inibita da inibitori selettivi degli EAATs, cioè DL-TBOA e TF-TBOA (fig. 1D). Inoltre negli
estratti proteici mitocondriali di corteccia e ippocampo abbiamo rilevato la presenza di tre
differenti EAAT: Glutamate Aspartate Transporter (GLAST), Glutamate Transporter 1
(GLT1) e EAAC1(fig. 1E). Per confermare il coinvolgimento di EAAT nel metabolismo
ossidativo in condizioni fisiologiche abbiamo saggiato la capacità del glutammato di
stimolare la sintesi di ATP anche in presenza di altri intermedi metabolici come malato e
piruvato (Desagher, S et al., 1997). Nella fig. 2A si è osservato che nei preparati
mitocondriali di ippocampo e corteccia l’aumento dei livelli di ATP derivante dall’
incubazione con concentrazioni non saturanti di
malato e piruvato (0.1 mM) erano
significativamente più bassi di quelli raggiunti in presenza di glutammato; inoltre se al
glutammato venivano aggiunte concentrazioni saturanti di malato e piruvato (fino a 3 mM),
il glutammato era ancora in grado di incrementare la sintesi di ATP, fenomeno che veniva
bloccato dal TFB-TBOA (fig.2B).
Nella Fig. 3A viene evidenziato che la produzione di ATP indotta da glutammato è un
meccanismo che appartiene sia alla popolazione neuronale (SH-SY5Y) che a quella gliale
(C6).
42
Ippocampo
A
TFB - TBOA 3µ
µM
###
45
###
###
30
§§§
***
***
15
#
0
TFB - TBOA 3µ
µM
§§§ ***
45
§§§ ***
ATP (nmoli/mg proteine)
ATP (nmoli/mg proteine)
Corteccia
###
§§§
***
30
***
15
#
0
Piruvato 0.1 mMGlut 1 mM
+
+
+
-
Malato 0.1 mM
B
+
+
+
+
+
+
-
Glut 1 mM
+
+
+
Malato 0.1 mM
Piruvato 0.1 mM
-
Ippocampo
+
-
40
20
+
+
+
***
60
40
20
0
0
-
+
-
+
+
Glut 1 mM
-
+
-
+
+
+
+
Malato 2.5 mM
-
-
+
+
+
Malato 2.5 mM
-
-
+
Piruvato 2.5 mM
-
-
+
+
+
Piruvato 2.5 mM
-
-
+
+
+
TFB-TBOA 3 µM
-
-
-
-
+
TFB-TBOA 3 µM
+
+
80
***
60
Glut 1 mM
+
+
+
Corteccia
ATP (nmoil/mg proteine)
ATP (nmoli/mg proteine)
80
+
+
+
-
-
-
-
-
+
Fig.2 Effetto di concentrazioni sub-saturanti (A) e saturanti (B) di malato e piruvato sulla produzione
di ATP indotta da glutammato in mitocondri isolati da ippocampo e corteccia.
43
3.3 EAAC1 sostiene l’ ingresso di glutammato nel mitocondrio
DL-TBOA è un inibitore non in grado di discriminare GLT1, GLAST e EAAC1 quindi non è
stato
possibile
avere
informazioni
sull’isoforma
effettivamente
responsabile
del
metabolismo ossidativo del glutammato. Comunque, come si può osservare nella fig. 3B,
GLAST e GLT1 presentano un’espressione irrilevante nei preparati mitocondriali, mentre
EAAC1 risulta espresso in maniera abbondante. Per confermare che EAAC1 fosse
effettivamente coinvolto nella stimolazione di ATP indotta da glutammato abbiamo
silenziato la sua espressione in cellule C6 e SH-SY5Y attraverso un oligonucletide
antisenso (AsODN). Nelle cellule trattate con AsODN il glutammato non ha indotto la
sintesi di ATP (Fig. 3bisC), suggerendo ancora un esclusivo coinvolgimento di EAAC1
rispetto agli altri sotto tipi di EAATs. Inoltre nella fig 1F si osserva che incubando gli estratti
mitocondriali di ippocampo e corteccia con TFB-TBOA 50 nM, concentrazione che blocca
solo GLAST e GLT1 (Shimamoto K. et al., 2004), la produzione di ATP stimolata da
glutammato non viene inibita, mentre, a concentrazioni più alte in grado di inibire l’attività
di EAAC1, la sintesi di ATP viene bloccata (fig. 2A). Infine è stato escluso il coinvolgimento
di AGC, in quanto silenziando Citrin/AGC2 (unica isoforma espressa nelle linee cellulari
C6 e SH-SY5Y) con specifici ODNs (tabella 1, Materiali e Metodi) non si è osservata
nessuna alterazione significativa nella produzione di ATP stimolata da glutammato (fig.
3bisD). Le fig. 4A-E mostrano la localizzazione mitocondriale di EAAC1 all’interno di
tessuti corticali e ippocampali e la specificità dell’anticorpo è dimostrata dalla mancata
reattività in tessuti testicolari dove EAAC1 non è espresso (Lee A et al., 2011).
44
A
40
16
Glutammato 1 mM
ATP (nmoli/mg proteine)
ATP (nmoli/mg proteine)
C6
(mitocondri)
SH-SY5Y
(mitocondri)
***
Glutammato 1 mM
12
20
###
**
8
# #
4
0
0
Ctrl
Ctrl
DL-TBOA
500 mM
DL-TBOA
500 mM
B
SH-SY5Y
1
2
3
4
5
C6
1
6
2
3
4
5
6
EAAC1
1: lisato tessuto cerebrale
2: BHK-NCX1
3: lisato cellulare
4: Ip-EAAC1 (lisato tessuto cerebrale)
5: mitocondri
6: Ip-EAAC1 (mitocondri)
Fig. 3 Effetto del DL-TBOA sulla produzione di ATP stimolata da glutammato (A) ed espressione di
EAAC1 (B) in estratti mitocondriali di cellule SH-SY5Y e C6.
45
C
SH-SY5Y
Standard buffer
Glutammato
C6
D
SH-SY5Y
Standard buffer
Glutammato
+
C6
Fig. 3bis Effetto di ODN anti-EAAC1 (C) e anti-AGC2 (D) sulla produzione di ATP indotta da
glutammato in cellule SH-SY5Y e C6.
46
3.4 Il glutammato induce una depolarizzazione della membrana mitocondriale
Come è noto l’uptake di glutammato mediato da EAAT è un meccanismo elettrogenico
(Hirrlinger J & Dringen R, 2010), quindi l’ingresso del glutammato nel mitocondrio
dovrebbe provocare una depolarizzazione della membrana mitocondriale a seguito
dell’acccumulo di Na+ . Tale fenomeno è stato dimostrato con esperimenti di microscopia
confocale, dove il TMRE (Dedkova EN & Blatter, 2005; Perez-Orti, JM et al., 2004;
Nicholls DG & Ward MW, 2000), un indicatore selettivo del potenziale di membrana
mitocondriale, ha mostrato che, in cellule SH-SY5Y e C6, l’esposizione di glutammato ha
provocato una significativa depolarizzazione (fig. 5A-B). Il DL-TBOA non ha modificato il
potenziale di membrana mitocondriale in condizioni di riposo (fig. 5bisC-D) ma ha inibito
significativamente la depolarizzazione mitocondriale indotta da glutammato, confermando
il ruolo chiave del cotrasporto Na+ /glutammato in questa risposta. Per escludere un
coinvolgimento del potenziale di membrana plasmatico sono stati condotti esperimenti in
cellule SH-SY5Y permeabilizzate con digitonina. Come si osserva nelle fig. 6A-D, nelle
cellule permeabilizzate l’esposizione al glutammato ha indotto una riduzione rapida e
reversibile della fluorescenza del TMRE, che nelle nostre condizioni indica una
depolarizzazione
mitocondriale.
L’esposizione
con
FCCP
(5
µM)
al
termine
dell’esperimento ha indotto, come atteso, una eliminazione della fluorescenza del TMRE.
Nelle cellule incubate con DL-TBOA (300 µM) non era invece presente alcuna
depolarizzazione mitocondriale a seguito dell’esposizione con glutammato (fig. 6A-D), in
accordo con i risultati ottenuti dalle cellule non permeabilizzate.
47
Fig 4 Immagini di microscopia immunoelettronica che evidenziano la distribuzione subcellulare di
EAAC1, in particolare a livello della membrana mitocondriale, come indicato dalle frecce; (F:
filamenti; G: apparato del Golgi; RER: reticolo endoplasmatico rugoso; Den: dendriti; Cap: capillari)
48
A
6
ctl
GLUTAMMATO 0.5 mM
4
n.s.
CGP 37157
* **
2
* **
TMRE (F/F0)
Basal Glutam.
SH-SY5Y
0
DL-TBOA
250 s
CTL
B
TBOA
CGP
Ru360
Ru360
Basal Glutam
Basal
C6
ctl
10
5
* **
n.s.
* **
TMRE (F/F0)
GLUTAMMATO 1 mM
CGP 37157
0
DL-TBOA
200 s
CTL
TBOA
CGP
Ru360
Ru360
Fig. 5 Analisi delle variazioni in tempo reale del potenziale di membrana in cellule SH-SY5Y e in
cellule C6 intatte (pre-incubate con diversi inibitori) in seguito alla stimolazione con glutammato
49
SH-SY5Y
C
STANDARD BUFFER
+/- INIIBITORI
FCCP 5 µM
4
TMRE (F/F0)
n.s.
3
n.s.
2
1
300 s
0
CTL
TBOA
CGP37157
Ru360
C6
D
STANDARD BUFFER
+/- INIBITORI
FCCP 5 µM
TMRE (F/F0)
9
n.s.
n.s.
6
3
300 s
0
CTL
TBOA
CGP37157
Ru360
Fig. 5bis Analisi delle variazioni in tempo reale del potenziale di membrana in cellule SH-SY5Y e in
cellule C6 intatte, pre-incubate con diversi inibitori, in condizioni di riposo
50
3.5 Ruolo svolto dal calcio e dal sodio nella sintesi di ATP stimolata da
glutammato:coinvolgimento di NCX
Poiché EAAT cotrasporta Na+ /glutammato, utilizzando il gradiente di Na+ favorevole,
abbiamo ipotizzato l’intervento di un altro fattore in grado di mantenere il gradiente di Na+
attraverso l’efflusso di sodio dal mitocondrio. Il meccanismo attraverso il quale la cellula in
condizioni fisiologiche espelle Na+ dal mitocondrio prevede l’attivazione dello scambiatore
Na+ /H+ (NHE). Abbiamo quindi incubato il preparato mitocondriale di ippocampo e
corteccia con 5 –(N-Ethyl-N-Isopropyl)amiloride 10 µM (EIPA), un inibitore selettivo di
NHE, ma non abbiamo osservato nessuna alterazione nella produzione di ATP stimolata
da glutammato (fig. 7A).
Un’altra proteina in grado di sostenere l’ingresso di glutammato attraverso EAAC1 nel
mitocondrio potrebbe essere lo scambiatore sodio calcio (NCX). In condizioni di riposo
NCX estrude il Ca2+ dalla matrice scambiandolo con il Na+ citosolico ma è in grado di
revertire tale scambio in presenza di un’aumentata concentrazione di ioni Na+ (Castaldo,
P. et al.,2009; Santo-Domingo J. & Demaurex
N, 2010;
Smets I. et al., 2004).
Monitorando i livelli di Na+mit con una sonda fluorescente (CoraNa Red) abbiamo rilevato
che l’esposizione al glutammato provoca un aumento di Na+mit sia in cellule SH-SY5Y che
C6 (fig.7B). Inoltre bloccando la conduttanza di NCX con un inibitore selettivo GCP-37157
la concentrazione di Na+mit è rimasta invariata a seguito dell’esposizione al glutammato
(fig. 7B). In linea con questi risultati il CGP-37157 non è stato in grado di modulare il
potenziale di membrana mitocondriale in condizioni di riposo ma ha inibito la
depolarizzazione mitocondriale indotta da glutammato (fig. 5A-D, 6A-D).
Abbiamo quindi testato l’effetto del CGP-37157 sulla stimolazione di ATP indotta da
glutammato in mitocondri corticali e ippocampali da dove è emersa una riduzione della
sintesi di ATP dose-dipendente (fig. 7C) con una IC50 (~0.3 µM) vicina alla costante di
inibizione dell’attività di NCX (Cox D.A. et al., 1993). Considerato che gli ioni calcio
51
aumentano l’attività delle deidrogenasi mitocondriali (Smets I. et al., 2004; McCormack,
J.G et al., 1990) abbiamo considerato anche il coinvolgimento dell’ uniporter del calcio
mitocondriale (Smets I. et al., 2004; Pellerin L. & Magistretti P.J., 1997) nella sintesi di
ATP indotta da glutammato. A questo scopo abbiamo incubato l’estratto mitocondriale di
corteccia e ippocampo con un inibitore selettivo dell’uniporter, Ru360 (10 µM), ma, come
si può osservare nella fig. 7E, questo composto non modifica i livelli di ATP; inoltre Ru360
è stato incapace di alterare la depolarizzazione mitocondriale indotta da glutammato in
cellule SH-SY5Y e C6(fig. 5A-B) e non ha interferito con il potenziale di membrana
mitocondriale in condizioni di riposo (fig. 5C-D). Questi risultati ci portano ad escludere il
coinvolgimento dell’ uniporter del Ca2+ nel nostro modello.
SH-SY5Y
(cellule permeabilzzate)
2
A
B
1,5
1.5
Glutammato
Glutammato 0.5 mM
FCCP
TMRE (F/F0)
TMRE (F/F0)
malato, piruvato, glucosio, ADP, succinato
1
0.5
0
50 s
CTL
DL-TBOA
1
***
***
0,5
CGP
0
Basale
CTL
DL-TBOA
CGP
C6
(cellule permeabilizzate)
2
C
D
1.5
1
0.5
0
50 s
CTL
DL-TBOA
1,5
Glutammato 1 mM
FCCP
Glutammato
TMRE (F/F0)
TMRE (F/F0)
malato, piruvato, glucosio, ADP, succinato
1
***
***
0,5
CGP
0
Basale
CTL
DL-TBOA
CGP
Fig.6 Analisi delle variazioni in tempo reale del potenziale di membrana in cellule SH-SY5Y (A e
B) e in cellule C6 (C e D) permeabilzzate (pre-incubate con diversi inibitori) in seguito alla
stimolazione con glutammato.
52
Standard buffer
Ippocampo
SH-SY5Y
Ippocampo
SH-SY5Y
(mitocondri)
Ippocampo
Glutammato
Corteccia
C6
Corteccia
C6
(mitocondri)
Corteccia
Fig.7 Produzione di ATP modulata selettivamente da NCX in mitocondri isolati da tessuto e
da cellule(B, C e D) ed esclusione del coinvolgimento di NHE (A) e dell’uniporter (E).
53
3.6 Interazione strutturale tra NCX1 e EAAC1
In un precedente lavoro abbiamo dimostrato che i 3 prodotti genici NCX1, NCX2 e NCX3
sono localizzati anche a livello della matrice mitocondriale interna (Castaldo P. et al.,2009;
Gobbi P. et al.,2007; Minelli A. et al., 2007), pertanto abbiamo ipotizzato una possibile
interazione tra tali proteine e gli EAATs. A sostegno di tale ipotesi abbiamo
immunoprecipitato gli estratti mitocondriali di ippocampo e corteccia con anticorpi diretti
verso GLAST, GLT1 e EAAC1 e abbiamo valutato la loro immunoreattività per NCX. Si è
osservata una forte immunoreattività di NCX1 negli immunoprecipitati di EAAC1 e
viceversa ( fig.8A-B). Questo dato avvalora l’ ipotesi che nei mitocondri di ippocampo e
corteccia sono presenti dei complessi multimolecolari costituiti da NCX1 e EAAC1 e la loro
interazione risulta essere selettiva e specifica infatti:1) immunoprecipitati per EAAC1 non
sono risultati immunoreattivi per NCX2 e NCX3 (fig. 8A); 2) immunoprecipitati per NCX1
non sono risultati immunoreattivi per GLAST e GLT1 (fig.8B); 3) immunoprecipitati per il
siero di topo (ottenuto da animali non immunizzati) erano incapaci di rilevare NCX1,
EAAC1, GLAST e GLT1 ( fig.8A-B).; 4) immunoprecipitati per NCX1 e EAAC1 non hanno
mostrato la presenza della traslocasi del nucloeotide adenina (ANT), proteina della
membrana interna mitocondriale. L’interazione specifica tra NCX1 e EAAC1 è evidente
anche in esperimenti di microscopia confocale in cui si è osservata una colocalizzazione
delle due proteine in preparati mitocondriali estratti da ippocampo e corteccia (fig. 8D).
54
Ippocampo Corteccia
Ippocampo Corteccia
Ippocampo Corteccia
3 4
5
6
1: lisato tessuto cerebrale
2: BHK-NCX1
SH-SY5Y
1 2
3 7
5
8
3: lisato cellulare
4: IP-NCX1 (lisato cellulare)
Corteccia
Ippocampo Corteccia
Ippocampo Corteccia
SH-SY5Y
1 2
Ippocampo
C6
1 2
3 4
5
C6
6
5: mitocondri
6: IP-NCX1 (lisato cellulare)
1 2
3 7
5
8
7: IP-EAAC1 (lisato cellulare)
8: EAAC1 (mitocondri)
Fig.8 Immunoprecipitazione delle differenti isoforme di NCX e EAATs in lisati totali e in estratti
mitocondriali di corteccia e ippocampo (A e B) e di cellule SH-SY5Y/ C6 (C).
55
Ippocampo
Corteccia
Fig.8bis Analisi di microscopia confocale su mitocondri isolati da ippocampo e corteccia
56
3.7 NCX1 modula la sintesi di ATP indotta da glutammato
Le cellule SH-SY5Y esprimono NCX1 e NCX3 mentre le cellule C6 espimono tutte e tre le
isoforme. Per stabilire se l’interazione strutturale tra NCX1 e EAAC1 avesse una
corrispondenza anche a livello funzionale, abbiamo silenziato separatamente le 3 isoforme
utilizzando i rispettivi AsODN (Magi S. et al., 2005).
Il silenziamento di NCX1 ha
provocato un’inibizione della sintesi di ATP stimolata da glutammato sia in cellule SHSY5Y sia in cellule C6, mentre il silenziamento di NCX2 e NCX3 non ha prodotto alcun
effetto (fig.9A-B).
57
SH-SY5Y
C6
Standard buffer
Glutammato
Fig.9.Effetto degli ODN anti-NCX sulla produzione di ATP stimolata da glutammato in cellule SHSY5Y (A) e in cellule C6 (B)
58
MATERIALI E METODI
4.1 Isolamento della membrana plasmatica e dei mitocondri da tessuto di ratto da
colture cellulari
Gli esperimenti sono stati condotti su lisati totali, membrane plasmatiche e preparazioni
mitocondriali isolate da tessuto corticale e ippocampale di ratto o da colture cellulari quali
SH-SY5Y (linee cellulari di neuroblastoma) e C6 (linee cellulari di glioma). I ratti Wistar
(200-300 g) sono stati anestetizzati con etere e successivamente sacrificati attraverso
decapitazione; ippocampo e corteccia sono stati prelevati e processati separatamente. Le
frazioni di membrana sono state ottenute dai tessuti isolati (Castaldo P. et al., 2007) e
utilizzate per l’immunoprecipitazione e l’ immunoblotting. I mitocondri utilizzati negli
esperimenti di Western Blotting sono stati purificati attraverso un gradiente continuo di
Percoll (Gobbi P. et al., 2007). La purezza dei preparati mitocondriali è stata verificata
attraverso l’utilizzo di marker mitocondriali e marker della membrana plasmatica (Yu WH
et al.,1995). I mitocondri utilizzati per gli studi funzionali sono stati ottenuti da tessuti
ippocampali e corticali omogeneizzati in un buffer (8 ml/g di tessuto) contenente (in
mM):sucrosio 320, K-EDTA 1, BSA 0.1% e TRIS-HCl 10; pH 7.2 con KOH. I nuclei e le
altre frazioni cellulari vengono fatte sedimentare a 500g per 8 minuti a 4 °C. Il
supernatante viene centrifugato a 8,000g per 15 minuti a 4 °C . Il pellet contenente i
mitocondri viene risospeso e ricentrifugato a 8,000g per 15 a 4 °C in un secondo buffer
contenente (in mM): sucrosio 320, K-EDTA 1, Tris-HCl 10 a pH 7.4. I mitocondri funzionali
delle cellule in coltura sono stati ottenuti come precedentemente riportato da Almeida e
Medina (Almeida A. & Medina J.M., 1998).La vitalità dei mitocondri è stata controllata con
un’ analisi MTT e gli esperimenti su tali preparati non sono stati eseguiti oltre le 3 ore dall’
isolamento. Il test dell’ MTT, in breve, prevede un ‘incubazione dell’ estratto mitocondriale
59
per 30 minuti con una soluzione 0.5 mg/ml di MTT (Sigma) a 37 °C.Successivamente
vengono aggiunti 100 µl di DMSO per solubilizzare i precipitatati di formazano prodotti dai
mitocondri vitali. Quindi la quantità di formazano prodotto risulta proporzionale al numero
di mitocondri vitali. L’ assorbenza del composto viene letta ad una lunghezza d’ onda di
540 nm mediante un lettore di piastre (Victor Multilabel Counter, Perkin Elmer).
4.2 Western Blotting e immunoprecipitazione
Gli estratti proteici sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con
Sodio Dodecil Solfato (SDS-PAGE). I lisati cellulari e tissutali sono stati omogeneizzati in
una soluzione di lisi contenente (in mM): NaCl 150, Tris-HCl (pH 7.4) 10, EDTA (pH 8) 1,
SDS 1% e un cocktail di inibitori della protesi (Roche Diagnostics). Per verificare la
purezza delle preparazioni mitocondriali sono state eseguite le seguenti operazioni:
suddivisione degli estratti proteici di mitocondri isolati e di lisati tissutali in 4 aliquote
(contenente ognuna 50 µg di proteine) che sono stati separati attraverso un gel di
poliacrilammide all’ 8% e successivamente analizzati per western blotting con gli anticorpi
primari: goat anti- calnexin (1:350), mouse anti-β1-integrin (1:500),
rabbi tanti-porin
(1:1000), goat anti-ANT (1:500). Per normalizzare il valore delle proteine caricate qualche
filtro
è
stato
incubato
con
l’
anticorpo
primario
mouse
anti-β-tubulina.
Le proteine di membrana e mitocondriali di tessuti cerebrali o di cellule sono state
immunoprecipitate utilizzando l’anticorpo monoclonale murino IgG diretto contro EAAC1
(1:50) o NCX1 (R3F1, 1:50). Per recuperare l’ immunocomplesso i campioni sono stati
incubati con una resina A-Sepharose. Dopo la corsa elettroforetica di tali campioni su gel
di poliacrilammide e trasferimento su filtro, le membrane sono state incubate con i
seguenti anticorpi primari: mouse anti-EAAC1 (1:1000), rabbit anti-GLAST e rabbit antiGLT1 (1:1000), mouse anti-NCX1 (1:500), IgM monoclonale anti-NCX2 (1:1000) e goat
60
anti-ANT (1:500). La rilevazione del segnale e l’ analisi dei risultati sono state eseguite
mediante il sistema ChemiDoc e il software di analisi Quantity One (Bio-Rad).
4.3 Immunoistochimica su mitocondri isolati da tessuto cerebrale
I mitocondri derivanti da ippocampo e corteccia di ratto dopo essere stati purificati su
gradiente di Percoll vengono posizionati su vetrini rivestiti di poli-lisina e sottoposti a
citocentrifugazione. Metà della preparazione viene quindi incubata con MitoTracker 2 µM
per 15 minuti, fissata in PFA al 4% (15 minuti a 37°C), permeabilizzata con PBS al 10% di
normal rabbit serum e allo 0.1% di Triton (1 ora a t° ambiente), lavat a in PBS e incubata
overnight a 4 °C con l’anticorpo primario
rabbit anti-EAAC1 (1:1000) e/o mouse anti-
NCX1 (1:500) in una soluzione di PBS all’ 1% di normal rabbit serum. Dopo il lavaggio, i
mitocondri sono stati incubati con l’ anticorpo primario anti-mouse fluorescente Alexa Fluor
488 (1:500) o con l’ anticorpo primario anti-goat fluorescente Alexa Fluor 555(1:500) a
temperatura ambiente per 1 h. Il segnale fluorescente è stato visualizzato attraverso un
microscopio confocale a scansione laser LSM 510 fornito di laser ad Argon (per il
colorante Alexa Fluor 488) a HeNe (per il MitoTracker e il colorante Alexa Fluor 555).
4.4 Microscopia pre-embedding immunoelettronica di EAAC1
Ratti maschi Wistar sono stati anestetizzati e per fusi transcardialmente con PFA al 4% e
0.5% glutaraldeide in un buffer fosfato (PB) 0.1 M ad un pH 7.4. I cervelli sono stati rimossi
attentamente dal cranio, post-fissati nella stessa soluzione di fissaggio per 12 h a 4 °C e
tagliati con un vibratomo. L’ immunoistochimica di EAAC1 è stata eseguita su fettine
sagittali di uno spessore di 50 µm utilizzando l’ anticorpo primario mouse anti-EAAC1
(1:200) o un siero non immune come controllo negativo. Successivamente le fettine
vengono incubate con un appropriato goat anticorpo secondario biotinilato e con la
diaminobenzidina come substrato cromogeno (Frontini A et al., 2008). Completata la
61
marcatura, le fettine sono state lavate in PB e post-fissate in OsO4 (1 h a 4 °C). Dopo la
deidratazione in etanolo e infiltrazione sulla resina Epon-Spurr le fettine vengono
posizionate tra 2 fogli di acetato e polimerizzate a 60 °C per 48 h. Le fettine così
processate vengono esaminate al microscopio per dissezionare le strisce di corteccia e
ippocampo attraverso un ultramicrotomo MTX. Infine le fettine sono state marcate con
piombo citrato e visualizzate ad un microscopio elettronico a scansione Philips CM10.
4.5 Microscopia confocale in tempo reale
Le cellule C6 e SH-SY5Y sono state messe in coltura per 18 h su vetrini precedentemente
ricoperte con poli-lisina e successivamente sono state incubate con tetramethylrhodamine
ester (TMRE) 150 nM a 37 °C (Dedkova E.N. & Blatter L.A, 2005.). In queste condizioni, in
seguito alla depolarizzazione mitocondriale, il TMRE viene rilasciato dalla matrice al
citoplasma provocando, di conseguenza, un aumento di fluorescenza nel citoplasma;
infatti nella matrice mitocondriale la fluorescenza veniva mascherata dal fenomeno di
quenching dovuto all’elevata concentrazione mitocondriale della sonda (Nicholls D.G. &
Ward M.W, 2000). Dopo 20 minuti si esegue un lavaggio in PBS e si posiziona il vetrino
sulla cameretta del microscopio immergendolo in una soluzione standard in presenza di
TMRE 150 nM. Le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale LSM
510 equipaggiato di un sistema di rilevazione META e di un obiettivo ad immersione 40X.
L’ intensità di illuminazione è stata mantenuta al minimo (0.1-0.2% della potenza del laser)
per evitare la fototossicità; il pinhole è stato impostato in modo da ottenere un piano ottico
con uno spessore di 1 µm. Il TMRE viene eccitato ad una lunghezza d’onda di 543 nm e la
fluorescenza emessa viene misurata nell’intervallo di 580-700 nm nella regione
citoplasmatica di interesse (ROIs). Nell’ analisi dei dati la fluorescenza è stata espressa
come rapporto (F/F0 ) tra la fluorescenza emessa (F) e il background di fluorescenza prima
della stimolazione (F0 ). In un set separato di esperimenti le cellule sono state caricate con
62
TMRE 10 nM nel mezzo di coltura a 37 °C. Prima dell a misurazione le cellule sono state
permeabilzzate per 10 minuti con digitonina 5 µM in un buffer “intracellulare” composto da
(in mM): 5 NaCl, 100 KCl, 70 mannitolo, 25 sucrosio, 10 KH2PO4, 0.0001 CaCl2 , 10TrisHCl, 1 MgCl2, 5.5 glucosio, 2 piruvato 2 malato, 3 succinato, 0.1 ADP, 0.005 digitonina,
0.00001 TMRE, pH 7.3. La digitonina è stata già utilizzata per permeabilizzare la
membrana plasmatici senza danneggiare gli altri orfanelli cellulari come il mitocondrio
(Fiskum G., 1985). Successivamente le cellule piastrate sui vetrini sono state per fuse con
la soluzione “intracellulare” contenente il TMRE (10 nM) e la digitonina (5 µM) e da qui le
immagini fluorescenti sono state raccolte. Al contrario dell’aumento di fluorescenza
corrispondente ad una depolarizzazione mitocondriale
nelle modalità quenching, in
questo set di esperimenti la fluorescenza del TMRE decresce proporzionalmente alla
depolarizzazione. Quando il DL-TBOA o il CGP-37157 sono stati utilizzati, essi sono stati
aggiunti sin dallo step di permeabilizzazione fino alla fine dell’ esperimento. Inoltre la
soluzione “intracellulare” contenente magnesio ha garantito il mancato apporto dell’ attività
dell’ uniporter mitocondriale (Kirichok Y et al., 2004).
Il glutammato e/o i farmaci aggiunti sono stati diluiti nel mezzo di perfusione e applicati
attraverso lo switch dei reservoir del sistema di per fusione.
Le variazioni di concentrazione del sodio mitocondriale nelle cellule intatte sono state
monitorate attraverso l’utilizzo di un’ altra sonda fluorescente, il CoroNa Red (Bernardinelli
Y. et al., 2006).
Le cellule C6 e SH-SY5Y sono state incubate con il CoroNa Red 1 µM nel mezzo di
coltura in assenza di siero per 15 minuti a 37 °C. Il CoroNa Red viene eccitato ad una
lunghezza d’onda di 543 nm e presenta una fluorescenza di emissione che oscilla tra i 560
e 615 nm.
63
4.6 Analisi della produzione di ATP
La produzione di ATP è stata rilevata attraverso un sistema disponibile commercialmente
luciferasi-luciferina. In mitocondri isolati: i mitocondri sono stati incubati in una soluzione
contenente (in mM): KCl 100, CaCl2 0.0001, mannitolo 75, sucrosio 25, KH2PO4 (pH 7.4
con Tris) 10, Tris-HCl 10, e ADP 0.1 con o senza glutammato 0.5-1 mM. Negli esperimenti
preliminari queste concentrazioni di glutammato hanno dato la massima risposta in termini
di stimolazione di ATP senza effetti tossici al nostro sistema. I farmaci saggiati o i rispettivi
veicoli sono stati aggiunti alla sospensione mitocondriale 15 minuti prima della
stimolazione con glutammato fino alla fine dell’esperimento. La luminescenza è stata
misurata con un luminometro Victor Multilabel Counter. Tutti gli esperimenti sono stati
condotti utilizzando 60 µg di preparato mitocondriale, una quantità che nei test preliminari
ha prodotto segnali di ATP misurabili e riproducibili; inoltre negli stessi test preliminari
abbiamo verificato che 1 h di incubazione fosse un buon compromesso tra la vitalità
mitocondriale e l’ accumulo di ATP. In colture cellulari: le cellule sono state piastrate in
multiwell da 96 pozzetti (30.000 cellule/pozzetto) e 24 h dopo sono state trasfettate con
ODNs (per 24 h con ODN anti-NCX1 e EAAC1 e per 48 h con ODN anti-Citrin/AGC2). Di
seguito si è eseguito un lavaggio nella soluzione standard contenente (in mM): NaCl 140,
KCl 5, CaCl2 1, MgCl2 0.5, HEPES 10 e glucosio 5.5 ad un pH 7.4. L’incubazione di 1 h
con il glutammato 0.5-1 mM è stata eseguita nella medesima soluzione a 37 °C. I livelli di
ATP sono stati misurati dopo l’incubazione e normalizzati in base al contenuto proteico di
ogni preparazione.
4.7 Esperimenti con ODNs
Sono stati disegnati oligonucleotidi chimerici fosforotioati senso e anti-senso per diminuire
l’espressione genica di NCX1, EAAC1 e Citrin/AGC2 (Tabella 1). Le cellule C6 e SH-SY5Y
sono state trasfettate con Attractene o Lipofectamina 2000 utilizzando protocolli
64
tradizionali. L’efficienza di trasfezione è stat quantificata utilizzando un plasmide
codificante per la proteina fluorescente verde (eGFP) cotrasfettato con gli ODNs.
l’efficienza del silenziamento del gene è stata determinata attraverso esperimenti di realtime PCR ed è stata stimata attorno al 60% sia per EAAC1 che per Citrin/AGC2. Gli ODN
senso e antisenso diretti verso i sottotipi di NCX sono stati utilizzati seguendo protocolli già
standardizzati .
Tabella 1. Sequenze dei primers utilizzate per la reazione di real-time PCR e per il
silenziamento con ODNs.
r NCX1
(NM_019268)
F: TCGCCTCCTCCAGCTCCTGC
R: GCTCCAGCCCATCATCGCGAC
390
Reverse
transcription PCR
EAAC1
(D63772)
F: TGAGCATCAAGCCTGGTGTC
R: TCCCCAGTCTTCAACTTCTA
491
Reverse
transcription PCR
GAPDH
(BC087743)
F: CCATGGAGAAGGCTGGGG
R:CAAAGTTGTCATGGATGACC
195
Reverse
transcription PCR
EAAC1
(D63772)
F: GGTTCAAGCCCTAAAGCAGAAA
R: GGAGCTTGACCTTAGATGTTGT
72
78
Real Time PCR
Citrin/AGC2
(NM_014251;
XM_342640)
F:GAAGCCTGCTCTTAGCTGGT
R:CTGTAAGTGGTTTGGCCAGC
117
82
Real Time PCR
F: CCCCCAATGTATCCGTTGTG
R:TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
118
82.2
Real Time PCR
GAPDH
(BC087743)
h EAAC1
(NM_004170)
S: CCACCGTGGCCGCGGTGG
AS:CCACCGCGGCCACGGTGG
Transfection
r EAAC1
(NM_013032
XM_346583)
S: GCTCGGGATGCGACTGGC
AS: GCCAGTCGCATCCCGAGC
Transfection
1h Citrin/AGC2
(NM_014251)
S:GTCAGTGGGTCCCGCAGTCG
AS: CGAGTGCGGGACCCACTGAC
Transfection
3h/R Citrin/AGC2
(NM_014251)
S: GTGGTGGATCAGACCAAAGA
AS: TCTTTGGTCTGATCCACCAC
Transfection
65
r Citrin/AGC2
( XM_342640)
S: GGCCGCGTGGGTGGCTTTAAC
AS: GTTAAAGCCACCCACGCGGCC
Transfection
r/h Citrin/AGC2
(NM_014251;
XM_342640)
S: GATTTATATGAGCCAAGGG
AS: CCCTTGGCACATATAAATC
Transfection
4.8 Analisi di PCR
I primers per l’ amplificazione di cDNA di EAAC1, Citrin/AGC2 e del gene housekeeping
gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GADPH) sono stati selezionati in accordo con la
sequenza di ratto disponibile su GeneBank, in una regione ad elevata omologia con il
gene umano (tabella 1). L’ ottimizzazione dei primers, la dimerizzazione, il self-priming e la
temperatura di melting sono stati calcolati attraverso il programma Primer Express. I
primers gene-specifici sono stati confrontati con la Genbank in modo da confermarne la
specie e la specificità; la curva di melting è stata utilizzata per determinare la specificità di
ogni primer. Tutti i campioni dei differenti esperimenti sono stati analizzati in triplicato per
verificare la riproducibilità dell’analisi e la media di ogni punto è stata utilizzata per
quantificare l’espressione genica. Se necessario (Magi S. et al., 2005), è stata effettuata
anche una reazione di retrotrascrizione della PCR utilizzando i primers mostrati nella
tabella 1.
4.9 Analisi statistica
I valori vengono presentati come media dei valori ottenuti negli n esperimenti ± SEM
(errore standard della media) e la significatività è rappresentata da p<0.05(*). Per
confrontare le differenze tra le medie è stato utilizzato il test one-way Anova seguito dal
66
test di Dunnet. Negli esperimenti che richiedono il confronto di soli 2 gruppi è stato invece
utilizzato il Test della t di Student.
67
DISCUSSIONE
I risultati di questo lavoro rivelano per la prima volta una relazione strutturale e funzionale
tra i trasportatori EAAC1 e NCX1 espressi a livello mitocondriale nella produzione di
energia indotta da glutammato. L’affidabilità del nostro modello è dimostrata da numerosi
esperimenti volti ad escludere possibili contaminazioni della membrana plasmatica e del
citoplasma. Innanzitutto le frazioni mitocondriali sono state sottoposte a studi di
immunoblotting per verificare l’assenza o la presenza di calnexin
(un marcatore del
reticolo endoplasmatico (Kleizen B et al., 2004)), β1-integrin (un marcatore della
membrana plasmatica (Hynes Ro, 2002)), porin (un marcatore della membrana
mitocondriale esterna (Zambonin JL et al., 2011)) e ANT (un altro marcatore mitocondriale
(Zhivotovsky B et al., 2009)). Come mostrato nella fig.1A, i nostri dati suggeriscono che gli
estratti mitocondriali non sono contaminati da altri organelli o da frammenti di membrana.
Inoltre le frazioni mitocondriali non contengono contaminanti dal citosol poiché non sono in
grado di utilizzare il glucosio per produrre ATP (fig. 1C). La caratterizzazione di questo
complesso multimolecolare mitocondriale rappresenta una componente fondamentale del
nostro studio, infatti è noto che un sistema controllato di trasporto ionico attraverso la
membrana richiede un’interazione spaziale tra i trasportatori e i suoi modulatori, formando
il cosiddetto “microdominio di trasporto”. Poiché è stato dimostrato che nei mitocondri la
concentrazione di Na+ della matrice è più bassa di quella extra-mitocondriale (Jung DW et
al., 1992), è possibile sostenere l’idea che questo gradiente sia la forza trainante per
l’ingresso del glutammato attraverso EAAC1 e che l’interazione con NCX1 sia cruciale per
ristabilire il gradiente che potrebbe venire dissipato dall’ingresso del glutammato
attraverso la membrana mitocondriale. La sintesi di ATP mitocondriale non sembra essere
influenzata dalla disponibilità di altri substrati metabolici come il malato e il piruvato; infatti
la componente della risposta energetica derivante da malato e piruvato (sia a
68
concentrazioni non saturanti che saturanti) è irrisoria rispetto a quella prodotta dal
glutammato (fig. 2A-B). Un simile effetto stimolatorio del glutammato è stato recentemente
riportato da Panov et coll. (J Biol Chem, 2009) che mostrano la risposta metabolica in
mitocondri isolati dal cervello già saturati con intermedi del ciclo di Krebs. E’ interessante il
fatto che l’effetto del glutammato è bloccato in maniera selettiva dalla presenza di specifici
inibitori di EAATs, TFB-TBOA (fig. 2A-B), mentre la sintesi di ATP indotta da malato e
piruvato non risulta modificata (fig. 2A-B). Abbiamo effettuato lo stesso saggio sul
metabolismo mitocondriale in altri due modelli cellulari sia in mitocondri isolati da cellule
neuronali (SH-SY5Y) che da cellule gliali (C6) confermando che l’effetto del glutammato
sia conseguente alla stimolazione di mitocondri di origine sia neuronale sia gliale (fig.1D ).
Inoltre abbiamo sottolineato che in colture cellulari di SH-SY5Y e C6, dove i substrati
metabolici sono presenti a concentrazioni fisiologiche, il glutammato induce la sintesi di
ATP che viene selettivamente bloccata da As-ODN di EAAC1 (fig. 3C). Inoltre questa
risposta non è bloccata da AGC2-As-ODN (fig. 3D), trasportatori ai quali generalmente
viene attribuito il ruolo di trasportare il glutammato all’interno del mitocondrio. Il ruolo dello
scambiatore sodio-calcio nel metabolismo energetico cellulare
è stato studiato in
numerosi lavori (Castaldo P et al., 2009) ma il suo meccanismo d’azione non è ancora
stato chiarito. Il laboratorio in cui ho svolto la mia tesi ha in precedenza documentato la
presenza dei trasportatori NCX1, NCX2 e NCX3 nei mitocondri (Castaldo P et al., 2009;
Gobbi P et al., 2007; Minelli A et al., 2007) che originariamente si credeva fossero
localizzati esclusivamente sulla membrana plasmatica. Nel presente lavoro viene
dimostrato che soltanto l’ isoforma NCX1 è cruciale per sostenere la sintesi di ATP indotta
dall’ ingresso del glutammato attraverso EAAC1, infatti sia l’approccio farmacologico con
CGP-37157, inibitore selettivo di NCX1, che il silenziamento selettivo con AsODN
inibiscono il metabolismo energetico indotto dal glutammato. I nostri dati propongono un
modello alternativo attraverso il quale il glutammato è in grado di produrre ATP, cioè
69
attraverso un’interazione dei trasportatori NCX1 e EAAC1 a livello mitocondriale.
L’interazione fisica tra questi due trasportatori è evidente negli esperimenti di
coimmunoprecipitazione e colocalizzazione effettuata mediante tecniche di microscopia
confocale. La sintesi di ATP mitocondriale mediata da EAAC1/NCX1 potrebbe essere
considerata un nuovo meccanismo complementare in grado di attivare il metabolismo
neuronale in condizioni di elevata attivazione del sistema glutammatergico. Tale
meccanismo potrebbe quindi avere importanti implicazioni in caso di sovrasaturazione di
glutammato, come durante un’ ischemia cerebrale, in cui le concentrazioni extracellulari di
glutammato sono significativamente aumentate (Benveniste H et al., 1984). Un altro
aspetto interessante è che il glutammato nell’infarto e in traumi cerebrali, quale
neurotrasmettittore, da un lato contribuisce alla morte immediatamente dopo l’insulto
ischemico o traumatico, ma potrebbe essere essenziale per il recupero delle funzionalità
metaboliche in stadi successivi (Ikonomidou d & Turski L, 2002). Si suppone quindi che la
capacità del glutammato di aumentare la sintesi mitocondriale di ATP sia fondamentale
per il ripristino della produzione di energia, soprattutto quando la tensione di ossigeno non
è così bassa da abolire il metabolismo ossidativo, come si osserva nella penombra
ischemica
e
nelle
fasi
di
recupero
post-infarto.
70
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