2° Laboratorio di Biochimica – Laurea Triennale in Scienze Biologiche
E.L.I.S.A. (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Principio di un saggio E.L.I.S.A.
Protocollo (i volumi indicati sono quelli da depositare nei pozzetti della piastra):
Coating: 70 ul di anticorpo anti-BSA (a concentrazione costante), incubazione a 4°C over-night
Lavaggi: 2 lavaggi con Tampone di Lavaggio (150 ul per pozzetto)
Blocking: 80 ul di Blocking buffer
Incubazione di 20’ a temperatura ambiente
Lavaggi: 2 lavaggi con Tampone di Lavaggio (150 ul per pozzetto)
Antigene: 50 ul di campione (BSA) preparato in Sample buffer e depositato in ogni pozzetto della
piastra  diluizioni scalari per la preparazione della curva di taratura:
[BSA]
Diluizione
250
ng/ml
125
ng/ml
62,5
ng/ml
31,25
ng/ml
15,62
ng/ml
7,8
ng/ml
3,9
ng/ml
1,95
ng/ml
0,975
ng/ml
0
ng/ml
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
dil 1:2
buffer
Incubazione di 20’ a temperatura ambiente
Lavaggi: 2 lavaggi con Tampone di Lavaggio (150 ul per pozzetto)
Anticorpo coniugato con HRP: 50 ul Anticorpo anti-BSA (marcato con HRP) diluito in Sample buffer
Incubazione di 20’ a temperatura ambiente
Lavaggi: 2 lavaggi con Tampone di Lavaggio (150 ul per pozzetto)
Substrato: 50 ul di substrato OPD preparato in Substrate buffer
Stop: 50 ul H2SO4 dopo 10'
Campione:
BSA (Bovine Serum Albumin)
Preparazione della curva di taratura (diluizioni scalari):
punto 1  BSA 250 ng/ml in Sample buffer
punto 2  diluizione 1:2 (100 ul punto 1 in 100 ul di Sample buffer)
punto 3  diluizione 1:2 (100 ul punto 2 in 100 ul di Sample buffer)
……….Diluizioni scalari 1:2…….
Disposizione curva di taratura e campioni incogniti:
1 – 250 ng/ml
2 – 125 ng/ml
3 – 62,5 ng/ml
4 – 31,25 ng/ml
5 – 15,62 ng/ml
6 – 7,81 ng/ml
7 – 3,90 ng/ml
8 – 1,95 ng/ml
9 – 0,97 ng/ml
10 – 0 (solo buffer)
11 – Campione incognito
12 – Campione incognito
Risultato dell’esperimento: maggiore intensità di colore = maggiore concentrazione del campione
Curva che si ottiene (iperbole e parte lineare della curva) dopo lettura allo Spettrofotometro:
valori sperimentali (espressi come OD, asse y) in funzione della concentrazione (ng/ml, asse x)
3.0
OD 492nm
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
50
100
150
ng/ml BSA
200
250
300