Espansione di triplette Corea di Huntington Distrofia miotonica Sindrome dell’x fragile Atassie Spinocerebellari Corea di Huntinghton È una malattia neurodegenerativa ereditaria DOMINANTE Colpisce una regione cerebrale Sintomatologia Proteina mutata E’ sufficiente che una sola delle due copie del gene sia mutata affinchè si sviluppi la malattia. La regione dei gangli della base; i primi neuroni a degenerare sono gli SPINOSI MEDI DELLO STRIATO, che hanno il compito di inibire l’eccitazione corticale. IPERECCITAZIONE CORTICALE, che comporta disturbi motori, tra cui gesti involontari, disabilità motoria e più tardivamente stati depressivi, aggressività e disturbi psichici Huntingtina Incidenza e decorso della patologia 1 2 L’età di esordio si colloca in età fertile, verso i 38 anni,e progredisce per circa 1520 anni, portando all’invalidità totale È una sindrome rara, con 5 casi ogni 100.000 abitanti. Scoperta del gene-malattia… Nel 1983 A. Boston e Jim Giusella identificano il tratto di DNA in cui è localizzato il gene responsabile della malattia. Il gene fu chiamato “ IT15” ( Interesting Transcript 15 ), situato sul braccio corto del cromosoma 4 , che produce una proteina chiamata “huntingtina”. Nel primo tratto del gene è localizzata una serie di tre nucleotidi “CAG” che risulta ripetuta una dopo l’altra. NUMERO DI “CAG” POPOLAZIONE SANA : Range compreso tra 9 e 35 ripetizioni POPOLAZIONE AFFETTA : Ripetizioni di triplette sempre superiori alle 36 unità A livello genico… Durante la replicazione del filamento di DNA un frammento neo-sintetizzato, costituito da una serie ripetuta di CAG si stacca dal filamento stampo e si ripiega su se stesso, formando un “hairping”, la cui porzione terminale si associa poi in una posizione dello stampo più arretrata di quella attesa, così che verrà sintetizzato un numero eccedente di CAG. L’espansione provoca una MUTAZIONE DELLA PROTEINA HUNTINGTINA Per ogni tripletta di CAG presente nel gene viene aggiunto un amminoacido chiamato GLUTAMINA. La Corea di Huntington viene perciò detta “Malattia da poliglutamine” Gain of function L’ huntingtina mutata acquista tossicità ...il tratto poliglutaminico ne modifica la conformazione e quindi la sua funzione, Provocando interazioni anomale con altre proteine cellulari Modificandone la normale localizzazione Provocando tossicità cellulare Rendendola suscettibile al taglio proteolitico Infatti... ...L’huntingtina mutata subisce un taglio proteolitico da parte delle caspasi, la cui attività aumenta in presenza della mutazione. L’azione delle caspasi porta alla formazione di diversi frammenti di huntingtina mutata, che sono in grado, così, di attraversare le membrane nucleari e di dare origine a inclusioni. Il frammento che ha destato maggior interesse è quello amminoterminale che contiene il tratto poliglutaminico espanso; le poliglutamine si dispongono a formare una struttura a foglietto-beta che funge da collante, promuovendo la formazione di legami con altri frammenti di huntingtina mutata e con altre proteine. In questo modo hanno origine degli aggregati nucleari e citoplasmatici che alterano la normale architettura cellulare ed in cui viene inglobata l’huntingtina normale. ...Gli aggregati sono visti come causa della malattia Loss of funcion Oltre alla gain of function della huntingtina mutata, un’altra causa della patologia è la perdita della funzione della huntingtina normale: Funzione anti-apoptotica per le cellule dello striato Stimolazione del promotore del gene del BDNF In quanto interrompe la normale cascata di eventi molecolari che portano alla morte cellulare di tipo apoptotico Il BDNF è una sostanza prodotta dalla corteccia cerebrale che attraverso la via cortico-striatale arriva alle cellule dello striato proteggendole dall’azione tossica indotta dall’huntingtina mutata Sindrome dell’x Fragile… sintomatologia Ritardo mentale Ritardo dello sviluppo del linguaggio verbale Iperattività Sterilità I maschi si presentano alti, fisicamente forti, hanno naso e mandibola sporgenti, palato ogivale, orecchie di lunghezza superiore alla norma, testicoli grossi, e sono predisposti a crisi epilettiche Circa un terzo delle donne portatrici mostra un certo grado di riduzione dell’ intelligenza. L’uomo high funtioning ha una Questa forma colpisce circa sindrome molto simile alla donna Un maschio su 1500,una Portatrice. Donna su 1000 ne è portatrice. Frequenti episodi di otite media, epilessia ed iperattività. Modalità di trasmissione Anomalia ereditaria del cromosoma x Questa malattia ha un ereditarietà di tipo recessivo legato al sesso Sebbene vengano colpiti soprattutto i maschi (1 su 4000), le femmine possono essere portatrici dell’anomalia genetica responsabile della malattia (1 su 6000) e trasmetterla ai figli maschi, che ne saranno affetti, ed alle figlie femmine, che diventeranno a loro volta portatrici. Mamma XX MASCHI FEMMINE papà XY XY oppure XY 50% XX oppure XX 50% Possibilità di manifestare la malattia. 0% possibilità di Esserne portatore. di essere portatrice della malattia. 0% Possibilità di manifestarla A livello genetico La mutazione FRAXA è il risultato di due eventi indipendenti: L’espansione della sequenza ripetuta CGG nel primo esone del gene FMR1 La metilazione a livello del promotore del gene Primo fenomeno…. • Nel primo esone il cromosoma X contiene una sequenza ripetuta CGG, che viene trascritta ma non tradotta in proteina. La maggior parte delle mutazioni responsabili di questa sindrome consistono nell’amplificazione di tale sequenza ripetuta. Questa proteina (FMRP) ha la funzione di limitare la sintesi di una serie di proteine presenti nelle sinapsi, che, se presenti in eccesso, potrebbero causare difficoltà nella propagazione dell’impulso. Ed inoltre impedisce la traduzione di alcuni mRNA legandosi ad essi. o Normalità 6-55 triplette A seconda del numero di triplette ripetute si ha una condizione di… oPremutazioni 56-200 Triplette o Mutazione completa <200 triplette Metodo di Sanger: sequenziamento delDna • • • • • • • Sequenziare il Dna significa leggere la successione di basi che esso contiene: Il Dna a singola elica viene suddiviso in quattro provette separtate, ciascuna corrispondente ad uno dei quattro nucleotidi (A,C,G,T), e trattato in modo da legarsi a un piccolo innesco di 20 basi. Necessaria per estendere la catena di DNA è la DNApolimerasi: essa procede lungo la catena incorporando oltre ai normali precursori nucleotidici (dNTP) anche particolari nucleotidi (ddNTP, cioè didesossi-nucleotidi, i quali differiscono dai primi per avere un atomo di H legato al terzo atomo di carbonio piuttosto che un gruppo OH). Il loro inserimento all’interno della stringa in crescita è casuale: questi ddNTP saranno responsabili dell’interruzione della crescita del Dna nel momento in cui verranno inserite nella provetta del corrispondente dNTP (es. ddATPs – dATPs). La concentrazione del secondo è l’1% rispetto al primo. Dunque, si genereranno frammenti di lunghezza scalare, con pesi molecolari differenti: utilizzando l’elettroforesi sul gel di poliacrilammide, ciascun frammento verrà caricato in una corsia del gel relativa al ddNTPs che l’ha tagliato (es: se il frammento è stato dal ddATPs, allora si troverà nella corsia A).Le corsie sono tra loro adiacenti ed i frammenti sono disposti dal basso verso l’alto in ordine crescente di lunghezza. Una volta terminata la separazione elettroforetica, il gel viene essiccato e messo a contatto con una pellicola radiografica. L’immagine che ne deriva è caratterizzata da bande sequenziali. utilizzando l’elettroforesi sul gel di poliacrilammide e poi fissando il tutto su lastra rediografica.… • Secondo fenomeno… La metilazione del Dna è uno dei più importanti meccanismi di regolazione dei geni, essa comporta, attraverso dei processi chimici,l’ inibizione del funzionamento degli stessi.Consiste dunque nel legame covalente dei gruppi metilici alle basi azotate del DNA.Negli eucarioti avviene principalmente la metilazione delle citosine. C’è una zona particolare nel promotore del gene che è chiamato “CpG island”, zona ricca di guanina e citosina in cui NON avviene metilazione. Questo fenomeno è più ricorrente nelle zone povere di C e G. Quando la metilazione viene estesa anche alla “GpC island”, il promotore viene bloccato, impedendo le fasi di trascrizione, traduzione e produzione della proteina. Tornando al lucido precedente… Ulteriore differenza tra: Premutazione Mutazione completa il promotore è Attivato, dunque si ha la produzione di Proteina FMRP (fragile mental Retardation protein. Il promotore viene invece metilato, non Si ha produzione della proteina, e Compare il fenotipo clinico completo Della malattia Mosaicismo…e preambolo all’High functioning È quel fenomeno per il quale in un individuo coesistono due tipologie di cellule,con genotipi differenti : in particolare parliamo di mosaicismo di metilazione quando espansioni <di 200 CGG hanno un promotore parzialmente metilato o non lo sono affatto per cui producono la proteina FMRP.Il livello di proteina prodotta è variabile, dal 10% al 60% rispetto all’allele normale, ciò dipende dal grado del mosaicismo di metilazione, cioè dal rapporto tra le cellule in cui il promotore è metilato e quelle in cui non lo è. Maschi High functioning Individui con sindrome da x fragile che presentano un quoziente intellettivo nella norma (QI>70). In questi casi il grado di metilazione è >del 10%,o più raramente, il promotore è completamente non metilato. Dunque la proteina FMRP sembra essere in quantità sufficiente per garantire un adeguato sviluppo intellettivo. Distrofia Miotonica È una malattia: • Autosomica • Dominante • Multisistemica la mutazione è localizzata sui cromosomi non sessuali il fenotipo dei geni alterati si esprime sia in omozigosi che in eterozigosi interessa più apparati Sintomatologia ed incidenza Esordio in età adulta Esordio in gravidanza Su 100 bambini nati da un genitore portante della malattia 50% sani 50% malati Miotonia, debolezza, Più grave e ad insorgenza precoce. atrofia muscolare, Riduzione dei movimenti fetali, distubi al cuore,agli occhi insufficienza respiratoria grave, ed al sistema endocrino ritardato sviluppo psicomotorio 10 bambini affetti su 10.000 nati Esistono due tipi di DistrofiaMiotonica DM1 DM2 DM1 È causata dall’espansioni di ripetizioni di CTG nella regione ‘3 non tradotta del gene DMPK sul cromosoma 19q13.3 • Per gli individui affetti da D.M il numero varia da 50 a 1000 per la forma classica, da 1000 a 3000 per la forma congenita • Negli individui normali il numero delle triplette CTG è inferiore a 37 I pazienti presentano nella seconda o terza decade di vita il sintomo caratteristico di capacità ridotta nel rilassare la presa di un pugno serrato.Questa difficoltà è legata ad un anomalo stato di eccitabilità della membrana muscolare. Continua… Sintomatologia • Deficit di forza muscolare e depauperamento delle masse muscolari, con distribuzione caratteristicamente distale (cioè a carico dei distretti più distanti dal tronco,come mani, avambracci, piedi ecc.) • Ipotrofia dei muscoli temporali e dei masseteri, con ptosi palpebrale • Disturbi del ritmo cardiaco per difetti di conduzione cardiaca. • Problemi respiratori • Eccessiva sonnolenza diurna • Deficit del cognitivo, alterazione della memoria,disturbi del tono dell’umore • Alterazioni endocrine (resistenza all’insulina) • Cataratta e calvizie precoci (anche nella donna) Esordio e severità clinica • La severità clinica e la precocità dell’esordio sono proporzionali all’amplificazione della tripletta CTG… Espansioni: 50-99 Intorno ai 100 Superiori a 100 Uguali o superiori a 1000 Esordio tardivo, lieve Esordio in età adulta, moderata Esordio in età infantile/giovanile, grave Esordio neonatale, gravissima DM2 È causata da espansione di quadriplette CCTG sul cromosoma 3q21. Il numero di quadriplette può variare da un minimo di 70 ad un massimo di 11000, con una media di 5000 ripetizioni. La maggior parte di queste famiglie sono state diagnosticate come affette da miopatia miotonica prossimale, per sottolineare le modeste peculiarità cliniche rispetto alla forma DM1. A livello cellulare… Le sequenze CTG e CCTG si sono rivelate NON CODIFICANTI, ed è stato ipotizzato che nel loro espandersi, prendano il posto delle ripetizioni di sequenze CUG, le quali contribuiscono alla sintesi di proteine responsabili di importanti funzioni cellulari. Atassia spinocerebellare autosomica dominante (ADCA) Malattia neurodegenerativa caratterizzata da atassia cerebellare progressiva… Perdita progressiva della capacità di eseguire un movimento volontario propriamente orientato nella direzione, nella forza e nella Coordinazione dei muscoli necessari alla sua corretta esecuzione. . Insorgenza Sono stati stimati 1-3 casi su 100000 abitanti esorio aiene tra i 30 e i 0 anni ance se sono stati segnaati eenti a esorio recoce urante inanzia o a insorgenza taria oo i 60 anni. Col passare delle generazioni la malattia diviene più grave e l’insorgenza più precoce. A Livello genetico … Sino a oggi sono stati ientiicati 22 iersi ocus genetici coinoti in questa atogenesi (SCA 1-22). A contrario SCA 8 iene associato a un esansione CTG nea regione 3 T e SCA 10 aesansione e eentanuceotie ATTCT in a maggior arte i questi geni contiene nea sequenza coiicante una esansione i triette CAG anomaa nei soggetti aetti. Questa esansione etermina nee corrisonenti roteine una sequenza oigutaminica anomaa. a roteina sintetizzata a gene etermina a sua ota una enta e rogressia erita ee unzioni Tipologie… Il processo degenerativo può essere limitato al cervelletto (ADCA di tipo III) Includere anche la retina (ADCA di tipo II) O anche il nervo ottico, la regione ponto-midollare, i gangli della base, la corteccia cerebrale,i nervi spinali o periferici (ADCA di tipo I). Sintomatologia… • • • • • • • • • • • • Anomalie della pupilla Atassia/incordinazione Atrofia ottica Agenesia/ ipoplasia/ anomalie del cervelletto Nistagmo Disturbi del comportamento Disturbi del linguaggio Insensibilità al dolore/ disturbi sensitivi Ipertonia/ rigidità/ spasticità Miatrofia/ agenesia muscolare Iperglicemia/ diabete mellito Oftalmoplegia Un’altra forma di atassia molto diffusa…. Atassia di Friedreich • • • • Autosomica recessiva (genitori asintomatici). Incidenza: 1/30000-1/50000 nati vivi. Insorgenza solitamente prima dei 20 anni. Durata della vita ridotta Mutazione del gene FRDA che codifica la proteina Fratassina locus genetico 9q13 numero di copie normale = 6-34 Tripletta GAA numero di copie nell’A.F.= 67-1700 Come il genotipo influisce sul fenotipo… • La Riduzione dei livelli di fratassina ed il fenotipo sono entrambi proporzionali alla lunghezza dell’espansione GAA; con ripetizioni <500 si ha un insorgenza più tardiva e un fenotipo più lieve con lunghezze 500 si ha un’insorgenza più precoce, decorso più rapido, maggiore incidenza di diabete, cardiomiopatia e scoliosi, maggiore alterazione dei riflessi. Il suo deficit: causa un danno ossidativo per eccesso di ferro nei mitocondri. Il suo ruolo: Trasportare il Ferro dai mitocondri al citosol. È molto espressa nel Pancreas, nel rene, nel SNC (midollo spinale, cervelletto, corteccia cerebrale) cuore, muscolo scheletrico, fegato. Dove agisce la Fratassina SNC Pancreas Muscoli Cuore Fegato Rene Grazie… Anna Del Prete eVincenzo Caputo
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