MICROBIOLOGIA AMBIENTALE
PANORAMA sulle TECNICHE
“CLASSICHE E MOLECOLARI”
http://en.wikipedia.org/wiki/Growth_medium
Diversità morfologica dei microrganismi
MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO
Diversità morfologica dei microrganismi
Numero e
disposizione dei
flagelli in rapporto
alla cellula
Monotrico
Anfitrico
 Flagello/i non
visibile al
microscopio!!!
Lofotrico
MORFOLOGIA CELLULARE
Peritrico
Microscopia ottica ed elettronica
MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici
Microscopia ottica ed elettronica
Microscopia ottica ed elettronica
Oculare
Fascio di elettroni
Lente magnetica
Obiettivo
Campione
Campione
Lente obiettivo
Lente proiettore
Fonte luminosa
Microscopia ottica
Immagine schermo
fluorescente
Microscopia elettronica a trasmissione
(TEM)
Microscopia ottica ed elettronica
Concetti chiave
1. Ingrandimento
2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.
- occhio umano 75-100 m
- microscopio ottico: 0.2 m (200 nm)
- microscopio elettronico: 0.2-2 nm
Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (lucefascio di elettroni)
Schema: microscopio composto
OCULARETubo metallico
GENERALMENTE
BINOCULARE !!
Ruota obiettivi
Braccio
OBIETTIVO 10X
OBIETTIVO 40X
OBIETTIVO 100X
Tavolino
Porta campione
Ganci
Vite macrometrica
Condensatore
Diaframma
Vite micrometrica
Sorgente di luce
Base microscopio
MESSA A
FUOCO
Principi di base: microscopio composto
Sistema di lenti convergenti:
1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)
-
Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed
ingrandita
- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale,
capovolta ed ingrandita
Principi di base: microscopio composto
INGRANDIMENTO
FISSO
10X oculare
10X, 40X,100X
obiettivi
Ingrandimento
totale=
Ingr. oculare X
Ingr. obiettivo
OBIETTIVO ED OCULARE
LAVORANO INSIEME
PER RISOLVERE L’IMMAGINE
L’oculare “risolve” l’immagine “reale”
risolta dall’obbiettivo
Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione
- L’obiettivo 100X è sempre ad
immersione
- L’obiettivo 100X è retrattatile
- L’olio ha lo stesso indice di rifrazione
del vetro dell’obiettivo
Microscopio composto: campo chiaro- scuro e a contrasto di fase
1. CAMPO CHIARO: più comune, basata sulla proprietà della celluna di assorbire o
disperdere la luce. Illuminazione dal basso ( condensatore).
Colorazione generalmente necessaria
2. CAMPO SCURO: ideale per l’osservazione di superfici. Illuminazione laterale. Colori
“falsi”.
3. CONTRASTO DI FASE : aumenta il contrasto tra cellule e mezzo circostante, sfruttando la
differenza di “ritardo” della luce che attraversa le cellule in osservazione. Ideale per
l’osservazione di campioni in vivo.
Campo scuro
Contrasto di fase
Osservazione in vivo e le colorazioni
1. Osservazione in vivo:
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto
- vetrino + goccia campione+ coprioggetto
2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità
per specifiche componenti cellulari.
Distinguiamo :
A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e
polisaccaridi acidi, COO-] : blu di metilene, safranina e cristal violetto
B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture
cellulari citoplasmatiche].
Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.
Colorazione di Gram
1884 Hans Christian Gram
-Tecnica basata sulle proprietà fisiche
della pareta cellulare
Colorazione di Gram
Asciugare all’aria
Fissare alla fiamma
RISULTATO AL MICROSCOPIO?
Colorazione di Gram
Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?
Colorazione di Gram
…“ma…”
La colorazione di GRAM è molto utilizzata
in microbiologia clinica, ma poco
sfruttabile in microbiologia ambientale
Microscopia ad epifluorescenza
SYBR-GREEN
Labels double
DNA strain
DAPI
A simple-to-use fluorescent stain, 4',6diamidino-2-phenylindole (DAPI),
visualizes nuclear DNA in both living
and fixed cells
Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp.
1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast.
Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1.
(a) and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom
(b)
culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture
(c)
at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel
(d)
magnification was 23006 ×.
• COLTURE DI MICRORGANISMI
La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede
l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i
quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in
grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo
che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve
essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un
sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.
Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte
osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione
del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.
Colture di microrganismi
RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE
DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE
DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN
LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE
FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER
APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.
MEZZI (TERRENI) DI COLTURA
solido
liquido
TERRENI DI COLTURA
Terreni sintetici o definiti :
COMPOSIZIONE ESATTA
Terreni complessi :
COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono
Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc…
Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi,
nucleotidim vitamine
Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali
per il metabolismo cellulare.
Terreni selettivi
Terreni differenziali
Terreni di arricchimento
o
MEZZI (TERRENI)
DI COLTURA
w
.
T
h
e
S
e
r
r
The Staphylococcus aureus ferments
a Streptococcus agalactiae does not grow on
MSA because of the high salt content.
mannitol and turns the medium yellow.
t
Staphylococcus epidermidis grows but
The Serratia marcescens does not grow
does not ferment mannitol.
because of the high salt content.
i
a
m
Esempio di Terreno selettivo:
a
r
MANNITOL SALT AGAR
c
Selettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;
e
s
c
e
n
s
TERRENO DI COLTURA: differenziale
Sodium Chloride
5.0gm
Sodium Acetate
2.0gm
Monoammonium
Phosphate
1.0gm
Dipotassium
Phosphate
1.0gm
Magnesium Sulfate
0.1gm
Bromothymol Blue
0.08gm
Agar
20.0gm
Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.
Escherichia coli
Formazione di colonie su
Acetate Differential Slant.
Incubazione in aerobiosi.
24 h at 35°C
Shigella flexneri
Inibito dall’ acetato.
Assenza di crescita Acetate
Differential Slant.
Incubazione in aerobiosi .
24h a 35 °C
Diversità morfologica dei microrganismi
DIVERSITà MORFOLOGICA DELLE COLONIE
IMPORTANZA DEI PIGMENTI
E DEI MARGINI DELLE COLONIE
PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE
DIVERSITà METABOLICA
DALLA
COLONIA
Test biochimici
identificativi
DIVERSITà METABOLICA
LA COLONNA DI WINOGRADSKY
SCHEMA di una colonna
Dettaglio batteri sulfurei
rossi e verdi,
lungo un gradiente di luce
PAROLA CHIAVE:
GRADIENTE
- DI OSSIGENO
- DI LUCE
- DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)
CONTA DEI MICRORGANISMI
A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue.
A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution.
After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10-2 dilution.
This was continued to generate the dilution series.
(B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10-7, 10-8,
and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold
between the plates.
CONTA DEI MICRORGANISMI
DAPI, syber green, arancio di acridini
Sono colaranti utilizzati anche
nella conta di microganismi mediante
Microscopia a fluorescenza
MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI
RESPIRAZIONE
Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added
through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask.
During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube.
This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added and
the alkali replaced to continue the process of analysis.
MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI
AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI
METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI
-Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti
inorganici del carbonio
CH4 + 2 O2 -----> CO2 + 2 H2O + energy
- enzima chiave metano-ossigenasi
16S RNA RIBOSOMIALE
Struttura primaria e secondaria
dell’ rRNA 16S di E.coli
PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE
CFU_ colonyforming unit
Unità formante
colonia
Biolog_example of
commercial kit
PLFA:
phospholipids
fatty acid
profile
FISH: Fuorescent in situ
Hybridization technique
IS-PCR Intergenic SpacerPolymerase Chain reaction
PLFA: phospholipids fatty acid profile
PLFA analysis is based on the extraction of
"signature" lipid biomarkers from the cell
membranes and walls of microorganisms.
Organic solvents are used to extract the lipids
from cells, then the lipids are concentrated
and analyzed by GC/MS to identify individual
lipids. Certain bacterial groups make
"signature" fatty acids, so a profile of the
PLFA in a sample can be used to characterize
the microbial community according to which
fatty acids are found and in what
concentrations. Below is an example of the
PLFA chromatogram from a typical soil
sample and the signature fatty acids that
indicate the presence of particular broad
groups of organisms
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
 reazione di polimerizzazione a catena
Esempi di utilità della PCR :
1. Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie,
genere,,etcc (microbiologia clinica)
2. Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente
oligotrofico)
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
 COMPONENTI
TEMPERATURA
REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)
ELETTROFORESI
 AGAROSIO
 PERCENTUALE dipendente
dalla lunghezza del frammento
da caricare
 EBOLLIZIONE (microonde)
 PREPARAZIONE Cassetta
 “versamento”del gel nella
cassetta
ELETTROFORESI
CARICAMENTO CAMPIONI
(aggiunta di Loading Buffer)
CORSA TRA ELETTRODI
Risultati PCR su gel
1
2
3
4
5
6
7
NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO
NUOVE TECNICHE: molecolari
Microscopio ad epifluorescenza
Microscopio ad epifluorescenza
Schema sorgente di luce
1. Globo di quarzo
2. e 3. Catodo e Anodo
4. Camera di combustione (contenente Hg)
5. Arco voltaico
“linee del mercurio”
613
577
546
434 404 365 nm
“le colorazioni in” Ecologia microbica
 colorazione fluorescente: DAPI
 attraversa la membrana cellulare
[4',6-diamidino-2-phenylindole ]
 lunghezza d’onda 358 nm
 visualizzazione cellule vive o fissate
 microscopia a fluorescenza
Campione
+
Microscopio a fluorescenza
DAPI
Microscopio ad epifluorescenza: immagini
DAPI
SYBR-GREEN
Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)
Microscopio ad epifluorescenza e FISH
MICROSCOPIO CONFOCALE
MICROSCOPIO CONFOCALE
Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione.
Intensità luminosa
Segnale elettrico
Digitalizzazione
1 punto = 1 pixel
Coerenza-Alta intensità-Unica λ
Specchio dicroico
MICROSCOPIO CONFOCALE
Spostamento verticale della
sezione ottica
Sovrapposizione singoli piani
Ricostruzione 3D
Microbiologia : analisi delle acque
- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di
inquinamento
Microbiologia : analisi delle acque
- Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici)
- Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis)
- Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di inquinamento
Parametro
Livello 1
Livello 2
Livello 3
Livello 4
Livello 5
100- OD( %
sat)
>10
<20
<30
<50
>50
BOD5 (O2
mg/L)
< 2.5
<4
<8
<15
>15
COD (O2
mg/L)
<5
<10
<15
<25
>25
NH4 (N mg/L)
<0.03
<0.10
<0.50
<1.5
>1.5
NO3 (N mg/L)
<0.3
<1.5
<5.0
<10.0
> 10
P (mg/L)
<0.07
<0.15
<0.3
<0.6
>0.6
Escherichia
coli (UFC/100
<100
>1.000
< 5.000
<20.000
> 20.000
Punteggio
80
40
20
10
5
ml)
Microbiologia : analisi delle acque
- Conta dei coliformi totali (UFC/ml)
- Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml)
- Conta delgi Streptococchi fecali
TERRENO DI
COLTURA
T° INC.
TEMPO INC.
CONTA
BATTERICA
TOTALE
PCA
(Plate Agar
Count)
22°C
36°C
72h
48h
COLIFORMI
TOTALI
Membrane endo
agar less
36°C
24h
COLIFORMI
FECALI
Membrane faecal
coliform
44°C
24h
STREPTOCOCCHI
KF streptococcus
FECALI
36°C
48h
Microbiologia : Coliformi total.
Chi sono e come si “cercano”
-“Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae.
- Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti
-“Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni
- Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp.
-Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro
- Escherichia coli….
Microbiologia : Coliformi fecali
- Sinonimo di Coliformi termoresistenti
- Fermentano il lattosio a 44.5-45 °C
Microbiologia : Streptococchi fecali
- Gram positivi
- Indicatori di inquinamento non recente (vita media>)
- Terreno KF
- Sodio azide (inibitore di altri microrganismi)
- Colonie rosse con alone chiaro attorno
Microbiologia : Streptococchi fecali
- Chi sono e come si “cercano”
Species
Colonia rossa
Alone giallo
Enterococcus faecalis
+
+
Enterococcus hirae
+ (poor)
+
Enterococcus equinus
+ (poor)
+
Streptococcus pyogenes
-
-
Streptococcus agalactiae
-
-
Lactobacillus plantarum
-
-
Escherichia coli
Enterobacter cloacae
Pseudomonas aeruginosa
Microbiologia : metodo delle membrane filtranti
Metodo delle membrane filtranti
N Colonie/100 ml =
(N colonie contate/ volume campione filtrato) *100