LA SEPSI:
ANTIBIOGRAMMA
E LABORATORIO
DI MICROBIOLOGIA
Francesco Luzzaro
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Pavia, 8 febbraio 2013
Diagnostica microbiologica:
prelevare al più presto 2 o più emocolture (prima di cominciare la
terapia antibiotica) insieme a colture eseguite a partire da altri
siti secondo le indicazioni cliniche
Pavia, 8 febbraio 2013
Ricerca della fonte settica:
uno specifico sito di infezione dovrebbe essere stabilito
il più rapidamente possibile (entro le prime 6 ore di presentazione)
Pavia, 8 febbraio 2013
Pavia, 8 febbraio 2013
Gram-negativi non fermentanti e carbapenemi
P. aeruginosa (COS)
Antibiotico
MIC mg/L (S/I/R)
A. baumannii (CRAB)
Antibiotico
MIC mg/L (S/I/R)
Pip-Tazo
> 16 (R)
Imipenem
> 16 (R)
Ceftazidime
> 8 (R)
Meropenem
> 16 (R)
Cefepime
> 8 (R)
Doripenem
>
Aztreonam
>
Amikacina
> 32 (R)
Imipenem
> 8 (R)
Gentamicina
> 16 (R)
Meropenem
> 8 (R)
Tobramicina
> 16 (R)
Amikacina
> 16 (R)
Ciprofloxacina
>
Gentamicina
> 4 (R)
Colistina
2 (S)
Ciprofloxacina
>
1 (R)
Tigeciclina
2
2 (S)
Amp-sulbactam
Colistina
1 (R)
8 (R)
4 (R)
16
Pavia, 8 febbraio 2013
EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO
Paziente “settico”
Mediamente 96 h
Risultato finale
Esecuzione dei prelievi Identificazione ed
antibiogramma
Invio al laboratorio
Incubazione delle bottiglie
Crescita su piastra
Semina su terreno
100
90
% Positive samples
80
70
60
BACTEC 9240
50
BacT/Alert
40
30
20
10
0
0
8
16
24
32
40
48
Incubation time (hrs)
56
64
72
Emocoltura positiva
Colorazione di Gram
Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico
Pavia, 8 febbraio 2013
Pavia, 8 febbraio 2013
Esame microscopico (colorazione di Gram)
Pavia, 8 febbraio 2013
Identificazione dei batteri
nella routine del Laboratorio di Microbiologia
Pavia, 8 febbraio 2013
MALDI-TOF
Il sistema è costituito da
•  Sorgente (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
•  Analizzatore (Time Of Flight)
•  PC
Fornisce accurate informazioni
su struttura e peso molecolare
di biomolecole:
• peptidi
• proteine
• oligonucleotidi
• carboidrati
• polimeri sintetici
ID microbica rapida
(pochi minuti)
Pavia, 8 febbraio 2013
VITEK MS:
IDENTIFICAZIONE
CON TECNOLOGIA MALDI-TOF
Pavia, 8 febbraio 2013
Identificazione da colonia
mediante spettrometria di massa
Pavia, 8 febbraio 2013
Chiusura
del vuoto
Principio del
MALDI-TOF-MS
Sistema sotto vuoto
Piastra
del
campione
Griglie di
accelerazione
Molecole di analita
immerse nella matrice
Tubo di volo
Rilevatore di Ioni
Spettro di Massa
Lo spettro di massa riflette
essenzialmente le molecole di analita
Pavia, 8 febbraio 2013
Profilo MALDI
6254.64
5380.64
5000
7157.65
7273.87
3000
6410.90
5096.01
6315.49
4000
7870.62
2000
ribosomal Protein
RL36
RS32
RL34
RL33meth.
RL32
RL30
RL35
RL29
RL31
RS21
1000
m/z
4364,33
5095,82
5380,39
6255,39
6315,19
6410,60
7157,74
7273,45
7871,06
8368,76
8368.99
4364.06
Intens. [a.u.]
Identificazione basata su proteine ribosomiali
Spettri di massa specifici per famiglia, genere e specie
0
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
7500
8000
m/z
Escherichia coli
Pavia, 8 febbraio 2013
Tempo per l’identificazione di specie ridotto di 28.8 h
Terapia inappropriata dopo 24 h: 4.5% (-10.1%)
Appropriato trattamento antibiotico entro 24 h: 75.3% (+11.3%)
Pavia, 8 febbraio 2013
Analisi diretta degli estratti batterici mediante MALDI-TOF
§  Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)
§  Produzione di beta-lattamasi (ESBL, MBL, KPC)
§  Enterococcus faecalis/faecium resistente alla vancomicina (VRE)
Pavia, 8 febbraio 2013
Escherichia coli
ß-lattamasi-negativo
Escherichia coli
ß-lattamasi-positivo
Escherichia coli
ß-lattamasi-positivo
dopo aggiunta di acido clavulanico
Prodotti di idrolisi dell’ampicillina
Pavia, 8 febbraio 2013
Isolato produttore di carbapenemasi (KPC):
recupero della sensibilità dopo aggiunta di acido boronico
S
KPC
KPC + AB
Pavia, 8 febbraio 2013
x10 4
Intens . [a .u.]
Intens . [a .u.]
Isolato produttore di carbapenemasi (MBL):
recupero della sensibilità dopo aggiunta di EDTA
1.0
0.8
0.6
0.6
0.4
300.291
1.0
0.8
0.8
S
476.067
300.291
498.388
0.4
0.4
4
0.0
x10
x10
1.04
0.8
0.4
0.4
0.0
x10 4
1.0
0.0
x10 4
0.0
0.0
x1044
x10
1.0
0.8
0.6
0.2
Intens . [a .u.]
0.0
x10 4
1.0
0.8
300.270
476.181
498.383
476.181
520.788
520.796
ceppo3A aw
ceppo2B0 0:G
:D3 4 M
MS R aw
1.0
1.0
MBL + EDTA
0.8
0.8
0.6
0.6
300.446
300.446
0.4
0.4
0.4
0.2
0.2
0.2
Intens
. [a .u.]
Intens
. [a .u.]
0.4
Intens
Intens. . [[aa.u.]
.u.]
0.2
Intens . [a .u.]
0.2
0.6
MBL
0.8
0.2
0.2
0.8
ceppo1B 0 :H 2 MS R aw
ceppo2A 0 :C 4 MS R a w
1.0
0.6
300.270
476.067
520.280
0.6
0.6
0.6
0.0
x10 4
1.0
0.8
0.6
476.150
476.101
498.294
498.477
0.0
x10 4
0.0
4
1.0
x10
1.0
476.150
520.288476.101
520.797
MixA 0 :C 2 MS R a w
ceppo3B 0 :H 4 MS R aw
0.8
0.8
0.6
0.6
300.251
0.4
0.4
0.2
0.4
.u.]
300
0.0
x10 4
406.416
0.0
x10 4
350
300
375
325
400
350
520.289
406.416
0.2
0.0
325
475.997
498.377
300.251
0.2
0.2
0.0
475.997
428.449
428.449
0.6
.u.]
Intens . [a .u.]
x10 4
1.0
Intens
[a .u.]
Intens
. [a. .u.]
0.0
x10 4
0.4
ceppo1A 0 :G 2 MS R a w
381.372
0.2
Intens . [a .u.]
Intens . [a .u.]
0.2
381.372
1.0
0.8
0.4
Intens . [a .u.]
x10 4
425
375
450
400
Pavia, 8 febbraio 2013
475
425
500
450
525
475
m /z
MixB 0 :D 2 MS R aw
Antibiogramma diretto: Staphylococcus aureus
Isolato resistente alla meticillina (MRSA)
Pavia, 8 febbraio 2013
Pavia, 8 febbraio 2013
Antibiogramma diretto: Escherichia coli
Isolato produttore di ESBL (CTX-M-15)
Pavia, 8 febbraio 2013
Escherichia coli produttore di ESBL
< 10%
10 - 15%
16 - 20%
> 20%
Tot. isolati: 1278
Tot. testati: 555
ESBL-pos.: 15.1%
STUDIO OASIS
Pavia, 8 febbraio 2013
Klebsiella pneumoniae produttore di ESBL
< 10%
10 - 30%
31 - 50%
> 50%
Tot. isolati: 552
Tot. testati: 258
ESBL-pos.: 26.7%
STUDIO OASIS
Pavia, 8 febbraio 2013
Proteus mirabilis produttore di ESBL
< 15%
15 - 30%
31 - 50%
> 50%
Tot. isolati: 204
Tot. testati: 152
ESBL-pos.: 32.2%
STUDIO OASIS
Pavia, 8 febbraio 2013
Enterobatteri e beta-lattamici
I breakpoint per cefalosporine ed aztreonam sono in grado di
rilevare tutti i meccanismi di resistenza clinicamente
importanti (incluse ESBL e AmpC mediate da plasmidi). Alcuni
isolati produttori di beta-lattamasi sono sensibili o intermedi
alle cefalosporine di 3° o 4° generazione con questi
breakpoints e dovrebbero essere riportati
SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA
In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle
ESBL è raccomandata o obbligatoria per scopi di
controllo delle infezioni.
Pavia, 8 febbraio 2013
E’ consigliabile continuare a ricercare la produzione di ESBL con
i metodi convenzionali o con i sistemi automatici in tutti gli
isolati di enterobatteri clinicamente significativi …
… In caso di positività del test, l’interpretazione categorica
della sensibilità alle cefalosporine a spettro esteso non sarà
modificata ma si raccomanda di segnalare nel referto, mediante
apposita nota esplicativa, la presenza del meccanismo di
resistenza e le possibili implicazioni cliniche ed epidemiologiche
Pavia, 8 febbraio 2013
Antibiogramma diretto: Klebsiella pneumoniae
Isolato produttore di carbapenemasi (KPC)
Pavia, 8 febbraio 2013
Il laboratorio deve comunicare tempestivamente al reparto il
sospetto di presenza di batteri produttori di carbapenemasi in modo
da consentire l’instaurarsi di misure di isolamento da contatto
Il paziente infetto va collocato in una stanza singola
•  Se la stanza singola non fosse disponibile, andrà individuata
un’area delimitata all’interno di una stanza
•  In caso di più pazienti infetti è possibile effettuare
l’isolamento per coorte
Pavia, 8 febbraio 2013
Pavia, 8 febbraio 2013
Enterobatteri e carbapenemi
I breakpoint per i carbapenemi sono in grado di rilevare tutti i
meccanismi di resistenza clinicamente importanti (inclusa la
maggior parte delle carbapenemasi). Alcuni isolati produttori di
carbapenemasi sono sensibili con questi breakpoints e
dovrebbero essere riportati
SENZA MODIFICARE LA CATEGORIA INTERPRETATIVA
In molte aree, la rilevazione e la caratterizzazione delle
carbapenemasi è raccomandata o obbligatoria per scopi di
controllo delle infezioni.
Pavia, 8 febbraio 2013
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi
2010
2009
2%
52%
15.2%
49%
Rimini,
2011
Pavia,98novembre
febbraio 2013
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi
EARS-NET 2011
Italia: 26.7%
Figura 4.12
Pavia, 8 febbraio 2013
Comitato di Studio per gli Antimicrobici
Studio
carbapenemasi
25 Centri (2011)
Coordinatori:
§  F. Luzzaro
§  L. Pagani
§  G.M. Rossolini
Maggio – Giugno 2011
Resistenza ai carbapenemi
confermata mediante test
fenotipici e molecolari in
270 enterobatteri isolati in
23/25 Centri ospedalieri
Pavia, 8 febbraio 2013
Enterobatteri resistenti ai carbapenemi
(Totale isolati, n=270/13749)
86.7%
5.6%
K. pneumoniae
E. cloacae
2.2%
1.9%
1.9%
0.7%
K. pneumoniae
E. coli
C. freundii
E. cloacae
S. marcescens
K. oxytoca
Sorveglianza nazionale 2011
E. aerogenes
H. alvei
P. mirabilis
Pavia, 8 febbraio 2013
Meccanismi di resistenza ai carbapenemi in
Klebsiella pneumoniae (n=234)
87.2%
KPC-type
6.8%
MBL
4.3%
1.7%
KPC
MBL
Perdita di porine
Sorveglianza nazionale 2011
OXA-48
Pavia, 8 febbraio 2013
KPC
MBL
Isolati di Klebsiella pneumoniae
produttore di KPC in 21/25 Centri
Isolati di Klebsiella pneumoniae
produttore di MBL in 6/25 Centri
Sorveglianza nazionale 2011
Pavia, 8 febbraio 2013
Klebsiella pneumoniae produttore di KPC
(n=204)
21.2%
38.2%
Area chirurgica
32%
Area critica
Area medica
2.9%
Ambulatorio
RSA
Area medica
Area chirurgica
Area critica
Area riabilitativa
Sorveglianza nazionale 2011
2.9%
2.9%
Pavia, 8 febbraio 2013
Emocolture: algoritmo operativo
EMOCOLTURA
GRAM
24-48 h
TERAPIA
EMPIRICA
ISOLAMENTO
18-24 h
TERAPIA
MIRATA
IDENTIFICAZIONE
E ANTIBIOGRAMMA
18-24 h
TERAPIA
OTTIMALE
Pavia, 8 febbraio 2013
Grazie per l’attenzione !
Francesco Luzzaro
Laboratorio di Microbiologia e Virologia
Azienda Ospedaliera della Provincia di Lecco
Pavia, 8 febbraio 2013