Felix qui potuit rerum cognoscere causas
Lucrezio (De rerum natura)
Come si ottiene un aumento di flusso?
Aumentando S
Sottraendo P
Aumentando enzima
Causano aumenti locali che faticano a
propagarsi lungo la via (dampening)
Aumentando attività
Esaminiamo alcuni esempi di aumenti di flusso in vivo
* In lievito nello switch tra fermentazione a respirazione (DeRisi, 1997)
* Nel seme durante la mobilizzazione delle riserve lipidiche (Rylott, 2001)
* Sintesi dei lipidi durante l’embriogenesi di Arabidopsis (O’Hara, 2002)
* Altri esempi (vedi Fell)
Diauxic shift in yeast
Exploring the Metabolic and
Genetic Control of Gene
Expression on a Genomic
Scale (DeRisi et al., 1997)
Quali sono i geni che vengono
attivati e quali vengono
disattivati nella transizione da
fermentazione a respirazione?
 Microarray con tutti i geni
di lievito ibridato con mRNA a
vari tempi di crescita
Rosso = Aumento
Verde = Diminuzione
Seguiamo i trascritti nel tempo
Passando da fermentazione a respirazione
cosa cambia nel metabolismo?
4.9
PYK1
 Variazione
 Gene interessato
Rosso = Aumento
Verde = Diminuzione
Molti geni sono regolati in modo simile
Variazione coordinata di molti geni
E’ possibile classificare i geni in base alla regolazione:  6 classi
Lipid mobilization
in Arabidopsis
germinating seeds
Schematic representation of the pathways involved in storage lipid mobilization in
oilseeds: 1, ACX; 2, multifuctional protein; 3, thiolase; 4, MS; 5, ICL; 6, PEPck.
Northern analysis
Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved
in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.
(A) Stages of seedling development (B)
Northern blot analysis of gene expression
from 0 to 8 days after imbibition
Enzimi coinvolti
ACC
Malonyl-CoA transacilasi
KAS III, II & I
FAS - Acido grasso sintasi
Lipid synthesis during embryogenesis
O'Hara, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:310-320
3-oxoacyl-ACP reductase (KR)
biotin carboxylase (BC)
acyl-ACP thioesterase (TE)
enoyl-ACP reductase (ENR)
acyl-carrier protein (ACP)
FAS Components Exhibit Constant mRNA Ratios
Abbondanza relativa dei trascritti
It was demonstrated recently that mRNAs encoding the four subunits of heteromeric (ACCase) acetylCoA carboxylase accumulate at a constant molar ratio throughout silique development in Arabidopsis. The
ratios were found to be CAC1:CAC2:CAC3:(accD-A & accD-B) = 0.14:1.0:0.17:0.06 (Ke et al., 2000)
Via del triptofano in lievito
Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni
causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ ≃ CJ x ΔEi )
• Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G.
(2008) Combinatorial pathway analysis for
improved L-tyrosine production in
Escherichia coli: identification of enzymatic
bottlenecks by systematic gene
overexpression. Metab Eng. 10:69-77.
Molti altri esempi:
 Lipogenesi nei tessuti animali
 Fotosintesi
 Ciclo dell’urea
 Gluconeogenesi
 Sintesi degli steroidi
 Operoni batterici, enzimi di fusione…
 ……u.s.w.
Come fa la natura?
Strategia multisito!
Il “metodo universale”
N
J1 = J2 + J3
J1
J2
S
J3
B
Per aumentare J3 di 5 volte, dovremo
amplificare tutti gli enzimi che da S portano
a P di 5 volte.
Questo comporta un consumo di
addizionale di S. Se vogliamo mantenere
intatta [S], occorre aumentare J1 fino al
valore di (J2 +5J3)
J1'= (J2 + J3') = (J2 + 5J3)
P
Se J2 >> J3 allora si può trascurare
di aumentare J1. In caso contrario
si rischia di danneggiare J2
N
J1 = J2 + J3 + J4 + J5
J1
J2
S1
J3
S2
J4
S3
B1
B2
B3
Il metabolismo è chiaramente
più complesso, con tanti flussi
diversi, presenza di cicli con
cofattori (major obstacle)
J’1 = (J2 + J3 + J4 + 5J5)
J5
Si può risalire da P verso N lungo le
vie metaboliche fino a dove l’aumento
di flusso può essere trascurato.
P
Se il metodo universale viene
implementato in vivo, ci aspettiamo che:

Quando la quantità degli enzimi cambia in risposta a stimoli fisiologici o
ambientali, la proporzione relativa rimane costante.

Il fattore di aumento dell’attività enzimatica corrisponda al fattore di aumento
del flusso.

Il livello di cambiamento sia maggiore nel ramo metabolico interessato mentre i
tratti a monte della ramificazione vadano incontro a cambiamenti di entità minore.

Oltre all’induzione degli enzimi interessati (maggior quantità) altri meccanismi
di controllo possono essere adoperati in diversi siti.
Phenotype is flux!
Ma qualche volta phenotype is concentration
Evidenze sperimentali
Reguloni!
La concentrazione dei metaboliti varia molto meno del flusso
* Rate limiting step concept: more misguided than even MCA initially suggested
* Agire su un solo punto è poco efficace e potrebbe essere deleterio
Il metodo universale mantiene costanti le concentrazioni dei metaboliti [Si]
 evita effetti negativi dovuti all’aumento o alla riduzione di [Si]
Referenze
Referenze ai lavori sugli aumenti naturali in vivo Vedi anche Fell ultimo cap
* DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. (1997) Exploring the metabolic and
genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278:680-6.
* O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. (2002) Fatty acid and lipid biosynthetic genes are expressed at
constant molar ratios but different absolute levels during embryogenesis. Plant Physiol. 129:310-20
* Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid
mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.
* Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic
manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9.
* Zhao J, Last RL.(1996) Coordinate regulation of the tryptophan biosynthetic pathway and indolic
phytoalexin accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 8:2235-44.
* Eastmond PJ, Rawsthorne S. (2000) Ccoordinate changes in carbon partitioning and plastidial
metabolism during the development of oilseed rape embryos. Plant Physiol. 122:767-74
* Universal method: Kacser and Acerenza (1993) A universal method for achieving increases in
metabolite production Eur J. of Biochemistry 216:361-367