Introduzione alla Spettroscopia NMR 2D con Gradienti C.I.G.S. Modena 9 Dicembre 2003 Dr. Francesca Benevelli Bruker Biospin srl [email protected] Spettroscopia 2D Durante un esperimento 1D, la magnetizzazione viene PREPARATA, ad esempio con un impulso a 90º Successivamente si procede alla DETECTION, durante la quale si raccoglie il FID 1D preparation detection In uno spettro 2D si introduce un’ulteriore fase, chiamata EVOLUTION In alcuni esperimenti (ad es. NOESY) un periodo di MIXING viene inserito tra EVOLUTION e DETECTION mixing 2D preparation evolution increment detection Spettroscopia 2D Quindi la magnetizzazione evolve in due “ambiti temporali”: evolution e detection Da ciascuno, tramite FT, si estrae un diagramma nel dominio delle frequenze, cioè uno spettro 2D COME? 1. Eseguo una prima serie di FT lungo t2, creando F2 (2) 2. Ogni spettro si distingue per un diverso evolution time 1 Spettroscopia 2D Mettendo gli spettri, uno sopra l’altro, ogni picco è modulato, cioè cambia di intensità 4. La modulazione dipende dall’evolution time. 5. Una seconda serie di FT viene eseguita lungo t1, creando F1 (1) 3. Si ottiene così la seconda dimensione 2 N.B. Per spettri 3D o oltre, basta aggiungere piú evolution times Spettroscopia 2D F2 = 1H F2 = X proprietá ETEROCORRELAzZIONI COLOC J long range XHCORR J dirette OMOCORRELAZIONI HMBC J long range HSQC J dirette HMQC J dirette COSY J dirette COSYPS J dirette TOCSY Intero spin system NOESY Dipolar coupling ROESY Dipolar coupling Spettroscopia 2D Eterocorrelata J diretta (HSQC o HMQC) ppm 10 20 30 40 50 60 70 ppm 80 90 72 100 74 110 76 120 130 78 140 80 4.5 150 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 4.4 3.0 4.3 2.5 4.2 2.0 4.1 4.0 ppm 1.5 1.0 0.5 ppm Spettroscopia 2D Eterocorrelata J long range (HMBC) ppm 71 72 73 74 75 76 77 78 79 5.85 5.80 5.75 5.70 5.65 5.60 5.55 ppm Spettroscopia 2D Omocorrelata J diretta (COSY) ppm 4.00 4.05 4.10 4.15 4.20 4.25 4.30 4.35 4.40 5.85 5.80 5.75 5.70 5.65 5.60 5.55 5.50 ppm Spettroscopia 2D TOCSY ppm Me2 Me1 0.5 1.0 1.5 2.0 CH 2.5 3.0 3.5 4.0 5.8 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 ppm Spettroscopia 2D NOESY ppm 4.7 4.8 N-CH3 4.9 5.0 5.1 5.2 5.3 5.4 CO-CH-N 5.5 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 ppm Cos’è un gradiente? Gradiente di B0 è un campo magnetico aggiuntivo (per esempio lungo l’asse z) la cui intensità dipende dalla posizione Cos’è un gradiente? L’applicazione del gradiente rende la velocità di precessione dipendente dalla posizione del nucleo. L’effetto globale è una DEPHASING. M 0 eiBt M 0 ei B0 Bcs Gz z t M 0 ei B0 Bcs t ei Gz z t Cos’è un gradiente? Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione, che può essere rifocalizzata da un secondo gradiente. Si comporta come una disomogeneità (T2). G1 y y x G2 x y x y x Hardware La bobina di gradiente è immersa in un cilindro ceramico per che fa da supporto meccanico e da dissipatore Hardware Il generatore di corrente è una scheda del BSMS, che eroga fina a 10A. Il gradiente totale risultante è dell’ordine dei 50G/cm Cos’è un gradiente? I gradienti possono operare da soli o in coppia Un gradiente si caratterizza per • forma • intensità Gk • durata S p16 d16 • Intensità del gradiente (Gk). E’ il valore massimo che assume l’impulso di gradiente • Durata del gradiente: p16. In alta risoluzione si usa 1ms – 1.5ms • Gradient stabilization delay: d16=100usec • Forma del gradiente (S). Di solito sine.100 Sintassi dei gradienti NELLA SINTASSI GP I GRADIENTI SONO TRATTATI COME IMPULSI 1 ze 2 d1 3 p1 ph1 d0 50u UNBLKGRAD p16:gp1 d16 p0 ph2 d13 p16:gp2 d16 4u BLKGRAD go=2 ph31 d1 wr #0 if #0 id0 zd lo to 3 times td1 exit ph1=0 2 ph2=0 0 2 2 ph31=0 2 A cosa serve il gradiente? In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: 1. Imaging 2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient) 3. Sopprimere segnali indesiderati 4. Selezionare dei cammini di coerenza 5. Misurare coefficienti di diffusione Imaging Posso acquisire un FID con il gradiente accesso: 1H G L’acquisizione in presenza di gradiente fa si che la velocità di precessione (e quindi la frequenza a cui viene acquisito il segnale) dipendono dalla posizione: imaging. Questa procedura si usa anche per il gradshim. Gradienti di Spoil Si applica, per esempio nel NOESY. 1H t1 Mixing time G Durante il mixing time del NOESY, la magnetizzazione “utile” è lungo z. Tutto ciò che è rimasto sul piano trasversale va eliminato o con cicli di fase oppure con gradienti. Gli spoil gradient lavorano “da soli” e l’unica esigenza che devono soddisfare è di essere sufficientemente intensi da eliminare le coerenze indesiderate. Eliminazione di picchi indesiderati Si possono eliminare in modo molto efficiente segnali indesiderati, come ad esempio quello del solvente. 1H 90 180 180 G Il gradiente rifocalizza solo i segnali che hanno subito l’echo: gli altri vengono ulteriormente defocalizzati. (ZGESGP) In questo esperimento i gradienti lavorano in coppia. Eliminazione di picchi indesiderati: es e wg Nell’excitation sculpting l’impulso sagomato è un 180° di solito SQUA100.1000, di durata 2 ms. La potenza viene calcolata con l’auprogram PULSE. Altre sequenze con i gradienti sono P3919GP e ZGGPWG. Utilizzano entrambe la tecnica watergate, ma P3919GP usa impulsi hard per la selezione del picco mentre ZGGPWG usa impulsi sagomati. P3919GP: d19=1/SW; p27=p0=p1; pl18=pl1 ZGGPWG: shape scelta in base a selettività Selezione di coerenze I gradienti sono alternativi ai cicli di fase. Le COERENZE assieme alle popolazione dei singoli livelli energetici quantizzati descivono completamente un sistema di spin. COERENZA si verifica quando piú spin si muovono all’unisono, con la stessa fase. Per esempio: • Dopo un ’impulso di 90°, la parte polarizzata degli spin si muove all’unisono nel moto di precessione. E’ questo “moto coerente” che ci permette di osservare la FID • L’energia fra spin che si muovono all’unisono e spin defocalizzati è quasi la stessa. In un caso (a) ho coerenza, nell’altro (b) no (a) (b) Coerenze a più spin Quando ci sono più spin accoppiati, questo modello non è sufficiente a descrivere tutto coerenze osservabili popolazioni Ix Iy Iz Sx S y Sz I zSz single quantum I xSz I ySz I zSx I zS y I xSx I xS y I ySx I yS y double quantum E Ordini di Coerenza “p” e impulsi Impulsi di 90° eccitano tutti gli ordini di coerenza accessibili al sistema di spin. Impulsi di 180° invertono p in –p. 90° +3 +2 +1 0 -1 -2 -3 180° 90° COSY 90° 90° t1 t2 Ix 2JI z S z I x ( 0 ) I z Bz 2 I y S z I x Iy JI z S z I 2 y 2 I x S z I x Sx 2 I y S z 90 2 I z S y 2I zSy JI z S z Sx 2 I z S y Iz S x S y COSY con i gradienti 90 I S I zSz I zSz y y I x 2 I y S z 2 I z S y S x +1 -1 Echo Rec. +1 -1 Antiecho Rec. Evoluzione del chemical shift durante il gradiente Durante l’applicazione del gradiente evolve anche il chemical shift. Per non avere distorsioni la fase inserisco un impulso di rifocalizzazione di 180 gradi. COSYDQF 90 I S 90 I S I z Sz I z Sz y y y y I x 2I x S z 2I x S y 2I z S y Sx +2 +1 -1 -2 Rec. Gradienti e NMR Per il cammino di coerenza selezionato si deve verificare che l’effetto totale dei gradienti sia nullo durante l’intero esperimento. In pratica: Eexpt=0 E=G n(n pn) Per esempio: COSYDQF, G1=10, G2=20 +2 -1 E1=10 (H*2) E2=20 (H*(-1)) Rec. Eexpt=0 Strategia dell’esperimento inverso • Parto da magnetizzazione H: robusta, più nuclei polarizzati • Trasferisco la magnetizzazione H al nucleo X, via accoppiamento J (INEPT e simili) • Evoluzione in X • ritrasferisco la magnetizzazione ad H, per sfruttare la maggiore sensibilità del nucleo 1H • Detection su H Vantaggi: Parto da magnetizzazione “robusta” (H) Detection su 1H, più sensibile Svantaggi: Devo eliminare tutto il segnale 1H non accoppiato a C13. Sono richieste caratteristiche strumentali ottimali (impulsi esatti, strumentazione stabile). INEPT e HSQC (heteronuclear single quantum coherence) I z A z B Iz Sz Sz = 1/4JIS free precession (90x)I Iy x C (180x)I (180x)S S inept D z Decoupling t1 y x z retro-inept = 1/4 J IS free precession 1/ 2 [-Iy - 2IxSz] y y x E 1/ 2 [Iy + 2IxSz]( I +_ JIS ) t1 x z G (90y)I (90x)S x y -2IxSz (Ix antiphase magnetization) x 1H 13C 13C 1H z acquire on N or C channel y -2IzSy (Sy antiphase magnetization) t1 t2 HSQC (heteronuclear single quantum coherence) 90Ix 2JI z S z 90Iy 90Sx I z I y 2I x S z 2I z S y 0I z 2I z S y 2I z S y cos0t1 90 Ix 90Sx 2JI z S z 2 I z S y 2 I y S z I x HSQC (heteronuclear single quantum coherence) 1H 13C J J I ,S I ,S Iy 2 I y S z 2 I z S y 2 I y Sz Ix 90 1H 13C 90 Quadrature detection inn F1: echo-entiecho Per ottenere spettri 2D phase sensitive si possono usare varie metodologie (States, TPPI, States-TPPI, etc.). assorbimento dispersione Per esperimenti eteronucleari inversi di solito si usa echoantiecho, in cui si selezionano alternativamente i cammini echo o antiecho in t1. “misto” magnitude HSQCsi (sensitive improved) 1H 13C 90I ,S t1 J 2 I S 2 I S Iy z y x z J Iy 2 I y S z t1 90I ,S J 2 I S 2 I S 2 I x S x z x x x J IS 2 I x S x 90 2I x S z Iy y HMQC (heteronuclear multi-quantum coherence) t1 2JI z S z 90Ix Decouple 90Sx I z I y 2 I x S z 2 I x S y 2 I x S y 2 I x S y 2 I x S x I z t1 JI z S z 2 I x S y 2 I x S z 2 I y 90Sx HMQC con gradienti- QF 1H 13C J J S S Iy 2I x S z 90 2I x S y 90 2I x S z Ix 1H 13C Allungo il raggio di azione: eterocorrelate long range • Ricostruisco le connettività • Trovo J piccole (debole accoppiamento): tempi lunghi per il trasferimento di coerenza (10/100ms) • Non disaccoppio: ottengo infos sulla J long range • Non disaccoppio: i picchi sono sfasati spettro magnitude • Filtro via (se voglio) le connettività short range HMBC (heteronuclear multi-bond correlation) Il primo 90° 13C crea 2Q J diretta, che viene cancellata con cicli di fase. Esperimenti tipici COSY: cosygpqf cosygpmfqf HSQC: hsqcetgpsi hsqcedetgp HSQC-TOCSY: hsqcdietgpsi HMBC: hmbcgpqf Per l’esecuzione si può sempre usare RPAR
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