Eurosurveillance, Volume 15, Issue 6, 11 febbraio 2010
INDAGINI
MICROBIOLOGICHE
E
MOLECOLARI
A
SEGUITO
DELL’OSSERVAZIONE DI UN AUMENTO DI LISTERIOSI UMANA IN BELGIO,
2006-2007
M Yde (
) 1, N Botteldoorn 1, S Bertrand 1, JM Collard 1, K Dierick
Istituto scientifico della sanità pubblica, Sezione di Batteriologia, Bruxelles, Belgio
1
Stile di citazione per questo articolo: Yde M, N Botteldoorn, Bertrand S, Collard JM, Dierick K.
“ Indagini microbiologiche e molecolari a seguito dell’osservazione di un aumento di listeriosi umana in Belgio, 2006-2007.”
Euro Surveill. 2010; 15 (6): pii = 19.482.
Disponibile online: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=19482
Date of submission: 30 June 2009 Data di presentazione: 30 giugno 2009
In Belgio, la maggior parte dei casi di listeriosi sono casi sporadici. In questo studio presentiamo le evidenze di
un episodio di listeriosi: un cluster di casi che si sono verificati nel 2006 e 2007, con identificazione di ceppi
identici. L'episodio ha coinvolto 11 pazienti, affetti da Listeria monocytogenes di sierotipo 4b. La fonte di
infezione non è stata rilevata.
Introduzione
Listeria monocytogenes è un batterio gram-positivo intracellulare di origine alimentare. In
alcuni gruppi (persone immunodepresse, neonati, donne incinte ed i loro bambini non
ancora nati), può essere una causa importante di pericolo di vita, potendo causare
batteriemia e meningite. Nella Listeriosi , poichè il tempo di incubazione è relativamente
lungo (da 3 a 60 giorni), è spesso difficile rintracciare la fonte di infezione. Ciò spiega
perché la stragrande maggioranza dei casi vengono notificati come sporadici. Tuttavia,
alcuni ben documentati focolai di listeriosi sono stati segnalati da Finlandia , Francia ,
Svizzera , Regno Unito (UK) e Stati Uniti (USA) . In Belgio, una epidemia di listeriosi è
stata descritta nel 2001 ; i dati provenienti da un ulteriore studio sono stati inconcludenti .
Nel presente studio, 36 ceppi umani provenienti da laboratori ospedalieri e cinque ceppi di
origine alimentare sono stati caratterizzati tramite sierotipizzazione, metal resistance
typing e pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Questa combinazione di indagini ci ha
fornito l'opportunità di collegare i ceppi da 11 casi sporadici.
Metodi
I pazienti non sono stati sistematicamente intervistati sulle loro abitudini alimentari, i dati
clinici sono stati forniti dai laboratori .
Identificazione e tipizzazione molecolare
Dal 1966, il Centro di Riferimento Belga per la Listeria (BLRC) ha ricevuto ceppi isolati in
ospedale di L.
monocytogenes da campioni consegnati su base volontaria.
L'identificazione del ceppo è stata effettuata con il kit API Listeria (bioMérieux, Francia).
Tutti i ceppi sono sierotipizzati secondo un protocollo standard , utilizzando un test
commerciale di agglutinazione (Denka Seiken, Tokyo, Giappone) per antigeni somatici (O)
e flagellari (H) . La sensibilità all'arsenico e cadmio è stata determinata secondo
McLauchlin et al. La tipizzazione molecolare è stata eseguita su gruppi di isolati sospetti
in base a considerazioni geografiche, su verificarsi di casi multipli all'interno di un breve
periodo di tempo o su un cluster di isolati con sierotipo identici.
La PFGE è stata fatta seguendo il protocollo americano PulseNet dopo la digestione del
DNA con l'APA I e Asc I. L’ analisi delle bande è stata eseguita con il sistema di
documentazione ImageMaster video (Amersham Pharmacia Biotech) e fingerprinting II
software Informatix (Bio-Rad). L’estrazione del DNA per la Random Amplified of
Polymorphic DNA (RAPD) viene fatto con il QI Amp DNA Mini Kit; primer HLWL 74 e le
condizioni di PCR sono stati descritti da Wernars et al. .
Isolamento di Listeria monocytogenes da alimenti
25 g di campione alimentare sono stati aggiunti a 225 ml di brodo Fraser Half per 24 ore a
30 ° C, seguita da inoculazione di 0,1 ml in 10 ml di brodo di Frazer e incubazione per 24
ore a 37 ° C. Dopo l’ arricchimento, 500 microlitri della cultura sono stati utilizzati per la
prova LM02 VIDAS (bioMérieux). Nei positivi, 10 microlitri di brodo di arricchimento Fraser
sono stati posti in sottocoltura su due supporti: RAPID L. Mono (Bio-Rad) e ALOA
(bioMérieux). Colonie caratteristiche per Listeria monocytogenes sono state ulteriormente
confermate con il kit di Listeria Api.
Risultati
Il BLRC riceve ogni anno tra 30 e 68 ceppi di casi clinici di listeriosi umana, che
rappresentano un'incidenza annuale di tre a sei casi per milione di abitanti. Questa
incidenza è paragonabile a quella riportata da altri paesi industrializzati.
Nel 2006, sono stati ricevuti 56 ceppi clinici: 19 di essi erano di sierotipo 4b. Gli isolamenti
su base mensile di sierotipo 4b variano tra nessuno e due. Tuttavia, nel mese di ottobre e
novembre 2006, sono stati isolati cinque e sei ceppi, rispettivamente, suggerendo un
possibile focolaio di listeriosi (Figura 1). Questi 11 isolati sono stati differenziati testando
la resistenza al metallo. Sono stati trovati 3 tipi di resistenza: arsenico sensibili - cadmio
resistenti (SR) (un ceppo), arsenico e cadmio resistenti (RR) (due ceppi), e arsenico e
cadmio-sensibili (SS) (otto ceppi). Era chiaro a questo punto che eravamo di fronte a un
ceppo episodico del fenotipo SS.
Figura 1. Isolati clinici di Listeria monocytogenes sierotipo 4b pervenuta alla belga
Listeria Centro di Riferimento, da mesi, 2006 (n = 19)
Gli otto ceppi di fenotipo 4b SS sono stati ulteriormente subtipizzati con PFGE. Essi
appartengono a tre differenti pulsovar, con pulsovar A in sei ceppi (Figura 2). I rimanenti
due ceppi appartenevano ad un pulsovar diverso. Uno di questi pulsovar (B) è stato
filogeneticamente collegato al pulsovar A con un indice di somiglianza del 92,31% (II
Fingerprinting applicazione software Informatix).
Figura 2. Pulsed-field gel elettroforesi Asc I e Apa I profili di Listeria monocytogenes
pulsovar
A
Per valutare la durata dell'episodio, i restanti ceppi di fenotipo 4b - SS del 2006 e quelli
isolati nel 2007 sono stati subtipizzati con PFGE. Altri cinque ceppi (tutti a partire dal
2007) sono stati trovati con un profilo indistinguibile dal ceppo derivante dall’episodio in
questione. Il tasso di isolamento nel 2007 è stato irregolare: gennaio (un ceppo),
Febbraio (un ceppo), marzo (un ceppo), luglio (due ceppi) (Figura 3). Gli ultimi due casi
sono stati geograficamente collegati indicando una estensione locale dell’episodio. Prima
dell'inizio dell’episodio, ceppi pulsovar A sono stati molto rari: solo un ceppo è stato
identificato nel 2005.
Figura 3. Distribuzione mensile del episodica Listeria monocytogenes ceppo (4b, SS,
pulsovar A), il Belgio, ottobre 2006-luglio 2007 (n = 11)
11 casi sembrano essere stati coinvolti in questo episodio (sei nel 2006 e cinque nel 2007).
Le caratteristiche dei pazienti sono illustrate nella tabella. Delle culture positive di questi
pazienti, nove sono state eseguite su sangue e due dal liquido cerebrospinale; quattro casi
sono state donne in gravidanza o neonati. Una donna incinta ha avuto un gemello nato
morto. L'episodio non è stato un cluster geografico, poiché gli stipiti sono stati ricevuti da
tre diverse regioni del Belgio: Fiandre, Vallonia e Bruxelles.
Tabella. Patients 'caratteristiche dell'episodio listeriosi, Belgio, ottobre 2006-luglio 2007
(n = 11)
Il primo episodio è stato individuato dalla BLRC nel novembre 2006. Solo in quattro
occasioni i pazienti sono stati interrogati sulla loro abitudini alimentari.
Nessun
questionario standard è stato utilizzato. Campioni di prodotti alimentari sospetti sono stati
prelevati dai frigoriferi dei pazienti o dallo stesso lotto di prodotti alimentari sospetti a
livello del dettaglio. E’ stato campionato salmone affumicato, perché in un caso di parto
pretermine, la madre ricordava di aver mangiato il salmone affumicato. Carne cruda di
cervello è stata l'unica voce “alimenti sospetti” in un caso di setticemia. La donna con feto
morto ha riferito di aver mangiato lasagne preconfezionate; questo alimento era stato
sospettato dopo che alcuni dei suoi coinquilini avevano presentato gastroenterite.
Tuttavia, L. monocytogenes non è stato isolato da nessuno di questi campioni.
Poiché la fonte di contaminazione non è stata individuata, un'altra linea di indagine è stata
seguita. Abbiamo cercato nell’archivio degli isolati da alimenti del BLRC un ceppo con le
stesse caratteristiche del ceppo derivante dagli episodi in studio. Tra gli isolati da prodotti
alimentari pervenuti in BLRC nel 2006 e nel 2007, solo sei sono stati i ceppi di fenotipo 4bSS. Erano stati subtipizzati con RAPD. Due ceppi isolati da pollame hanno presentato lo
stesso profilo RADP dei ceppi provenienti dagli episodi. Tuttavia, questi ceppi erano di
pulsovar diverso, il che li esclude dal coinvolgimento nell'episodio.
Discussione
In Belgio, la maggior parte dei casi di listeriosi sono segnalati come casi singoli. I
Laboratori clinici hanno l’obbligo di legge di riportare i casi alle Autorità Sanitarie.
Tuttavia, tali autorità raramente ricevono anche informazioni sulle caratteristiche
genotipiche del ceppo, il che non facilita il collegamento tra casi sporadici. I Laboratori
clinici possono far pervenire i loro isolati al BLRC. Si stima che il BLRC riceva circa il 70%
del numero complessivo di isolati clinici in Belgio. Effettuando il BLRC la tipizzazione dei
ceppi, i gruppi di ceppi identici sono facilmente riconoscibili.
La combinazione di sierotipizzazione, resistenza al metallo e PFGE hanno portato
all'individuazione di 11 isolati identici. Il ceppo è stato episodico, di sierotipo 4b, sensibile
alle arsenico e cadmio e apparteneva a pulsovar A. Sei di essi sono stati isolati in un
periodo di alcune settimane il che è eccezionale per un paese piccolo come il Belgio. Oltre
agli isolamenti cluster nel 2006, il ceppo è stato isolato da altri cinque pazienti nel 2007,
indicando una lunga estensione dell'episodio che continuò quindi fino al luglio 2007.
La fonte di contaminazione non è stata individuata. Due fattori possono aver contribuito a
questo fallimento: la mancata intervista dei pazienti e il mancato campionamento degli
alimenti correlati. Durante questo episodio solo quattro pazienti sono stati contattati da
ispettori sanitari e solo tre campioni di prodotti alimentari sono stati prelevati e si sono
rivelati negativi per L. monocytogenes in 25 g. D'altra parte, il ceppo legato all’episodio
non era presente nella collezione BLRC di ceppi da alimenti, e quindi non si è in possesso
di nessun indizio per sospettare prodotti alimentari su cui indagare.
La non identificazione del cibo implicato non è un fatto eccezionale. Nel 1987, 23 casi di
listeriosi in Gran Bretagna sono stati attribuiti a un ceppo di sierotipo insolito designato 4b
(X); il cibo implicato non è stato identificato . Nei Paesi Bassi, un’analisi di un cluster
basata sulla sierotipizzazione e PFGE ha mostrato 15 casi di listeriosi, senza
l'individuazione di una chiara fonte di infezione .
Il sierotipo 4b non è insolito. In Europa e Nord-America, la maggior parte dei focolai di
listeriosi pubblicati negli ultimi 20 anni hanno coinvolto ceppi 4b . Inoltre, ceppi di
sierotipo 4b tendono ad essere sovrarappresentati in listeriosi perinatale, suggerendo la
possibilità del possesso di attributi di virulenza particolarmente aggressivi in gravidanza
con passaggio della barriera emato-placentare.
Si presume che il ceppo legato all’episodio sia stato particolarmente virulento, perché ha
coinvolto un numero relativamente elevato di donne in gravidanza (4 di 11) e provocato
casi di meningite, (2 di 11), rispettivamente. Secondo i dati annuali provenienti dal BLRC,
i ceppi da casi di listeriosi materno-neonatale rappresentano il 10% del numero totale di
ceppi clinici e una percentuale simile è stato osservata per i casi di meningite.
E 'generalmente accettato che le persone che presentano una malattia di base sono più
soggetti a contrarre la listeriosi. In questo episodio, le informazioni erano disponibili da
solo tre. Poichè non è obbligatorio per i laboratori clinici riportare questo genere di notizie
al BLRC, molti dati epidemiologici sono sconosciuti.
Durante questo episodio di listeriosi, abbiamo ricevuto un ceppo di Listeria umana
strettamente connesso al ceppo in studio. Questo ceppo era di sierotipo 4b, sensibile a
arsenico e cadmio, ma rappresentava un altro pulsovar (B). Pulsovar B si differenzia da
pulsovar A soltanto per tre bande nel profilo I Apa. Secondo Tenover et al. , due profili
che si differenziano soltanto per tre bande sono considerati strettamente connessi.
Tuttavia, l'indice di somiglianza tra i due profili era 92,31% e quindi inferiore al 95%, il
livello minimo di ceppi altamente correlati. Pertanto, questo ceppo è stato escluso dal
l'episodio.
L'episodio sarebbe passato inosservato se il BLRC non avesse effettuato la tipizzazione dei
ceppi. Un efficiente controllo della listeriosi richiede interviste approfondite ai pazienti con
l’utilizzo sistematico di un questionario standardizzato. La stretta cooperazione tra gli
ispettori sanitari comunitari, l'Agenzia Federale Belga per la sicurezza della catena
alimentare (FASFC) e il BLRC si tradurrebbe in un rapido collegamento di casi sporadici e
nel miglioramento della possibilità di trovare la fonte di infezione in caso di epidemia.