Il citoscheletro
1
IL CITOSCHELETRO
Coomassie blu
2
IL CITOSCHELETRO
Il citoscheletro è costituito da una fitta rete
tridimensionale di filamenti proteici che
attraversano il citoplasma
FUNZIONI
sostegno meccanico per la cellula
mantenimento e modificazioni della forma
cellulare
adesione cellula-cellula e cellula-matrice
movimento della cellula nell’ambiente
Coomassie
movimenti intracellulari: localizzazione
e blu
movimento degli organuli cellulari
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IL CITOSCHELETRO
COMPONENTI DEL CITOSCHELETRO
Filamento
Microtubuli
Diametro Medio
Componente
proteico
principale
Caratteristiche
funzionali
generali
25 nm
Tubulina
Strutture
Dinamiche
Actina
Strutture
Dinamiche
Variabile
Strutture
Statiche
Microfilamenti 6 nm
Filamenti
sottili
10 nm
Filamenti
Intermedi
Ciascun tipo di filamento ha proprietà meccaniche e
funzioni distinte nella cellula
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IL CITOSCHELETRO
Microtubuli e Microfilamenti
sono strutture dinamiche
Si assemblano e disassemblano a
partire da subunità proteiche
globulari attraverso la
formazione di legami non
covalenti
VANTAGGIO
Assemblaggio e disassemblaggio
avvengono in base alle necessità
della cellula
Es. fuso mitotico
5
CITOSCHELETRO: LOCALIZZAZIONE
GENERALE DEI SUOI COMPONENTI
Microtubuli
Filamenti
intermedi
Microfilamenti
Ciascun tipo di filamento tende a
distribuirsi nello spazio in modo diverso
nelle cellule
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Microtubuli
Microfilamenti
Filamenti intermedi
7
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
Tubuli cavi
PM 110 kDa
25 nm
parete
7nm
Gli eterodimeri sono disposti
ordinatamente testa-coda
αß-αß-αß-αßi MT sono POLARIZZATI:
presentano due estremità
chimicamente e funzionalmente
distinte, importanti per le
funzioni del MT
13
protofilamenti
8
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
Microtubuli evidenziati in
microscopia elettronica
9
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
I microtubuli ( e i microfilamenti) sono
strutture labili
Sono polimerizzati da una riserva di subunità
αß- e depolimerizzati
Nella immagine microtubuli
assemblati in vitro a partire
da MT già formati (porzione
segnalata in verde)
Termina con ß
La polarità rende le due estremità
dei filamenti diverse, con effetto
sulla velocità di pol (Vp)
L’estremità più si allunga e si
accorcia più rapidamente
Termina con α
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI
In vitro
NUCLEAZIONE
La fase di equilibrio si ottiene ad una concentrazione critica di monomeri
La quantità di monomeri aggiunta equivale a quella che si dissocia
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI
allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità
Ai dimeri αß- liberi nel citoplasma è legato GTP
Il GTP associato alla subunità beta si idrolizza
in GDP quando il dimero è aggiunto al filamento
In un microtubulo, le nuove subunità
aggiunte contengono GTP (cappuccio di
GTP), perché non è ancora avvenuta
l’idrolisi
Le vecchie subunità presentano GDP
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI
allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità
IDROLISI GTP
Quando la subunità si
Lega, il GTP è idrolizzato
e il filamento si incurva e si
destabilizza
Regione instabile
GDP
Regione stabile
GTP
Quale è la conseguenza?
13
POLIMERIZZAZIONE dei MT
allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP nella dinamicità
Il plus end è interessato dal fenomeno di instabilità dinamica
Tante subunità (elevata
concentrazione): l’aggiunta di
subunità con GTP procede più
velocemente della reazione di
idrolisi del GTP
Permane il cappuccio di GTP
che stabilizza l‘estremità più
del MT che polimerizza e
cresce
Poche subunità (bassa
concentrazione): l’aggiunta di
subunità procede più
lentamente della reazione di
idrolisi del GTP a GDP con
destabilizzazione e
depolimerizzazione
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POLIMERIZZAZIONE dei FILAMENTI
allungamento o accorciamento? Ruolo del GTP
Per certe concentrazioni
(concentrazione intermedia) il
Mt polimerizza alla estremità
più e depolimerizza alla
estremità meno, restando di
lunghezza invariata
Le subunità si spostano da + a treadmilling
Cosa regola l’allungamento, l’accorciamento e la lunghezza dei filamenti?
La concentrazione delle subunità
La idrolisi del GTP nelle subunità
Queste variazioni possono consentire variazioni della organizzazione dei MT
15
nella cellula e lo svolgimento dei loro compiti meccanici ai MT
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
Assemblaggio dei MT (processo iniziale di
polimerizzazione) inizia nei
Centri di organizzazione microtubulare (MTOC)
tripletta
MT
(centrosoma)
I MTOC sono regioni specializzate poste in
prossimità del nucleo
IL MTOC comprende una coppia di centrioli,
circondati da materiale proteico pericentriolare
centriolo
9 triplette
Dal MTOC i MT si
irradiano fino alla
16
periferia della cellula
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
MTOC:γ-tubulina
Nel materiale pericentriolare la
γ-tubulina si associa ad altre proteine
formando dei complessi ad anello
I complessi ad anello sono essenziali per
l’ inizio della polimerizzazione dei MT per
aggiunta delle subunità
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MTOC
in microscopia
elettronica
Centriolo
Microtubuli
Microtubuli neoformati
Centrioli
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
LOCALIZZAZIONE dei MT
I MT nella cellula si
distribuiscono:
Cellula in interfase
centrosoma
Cellula in mitosi
- concentrati attorno al
nucleo dal quale si irradiano
- organizzati a formare
strutture transitorie: Fuso
mitotico durante la divisione
cellulare
-organizzati in strutture
stabili: ciglia e flagelli di
alcune cellule specializzate
Fuso mitotico
Cellula con ciglia
ciglia
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IL CITOSCHELETRO
Microtubuli
MICROTUBULI
Microtubuli
citoplasmatici
nelle cellule in interfase
FUNZIONI
- Impalcatura di sostegno
per la cellula
-Posizionamento e
movimento di organuli
rivestiti da membrana
(es. Golgi, vescicole
secretorie)
Microtubuli di una cellula in interfase
evidenziati mediante IIF
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
La organizzazione e le funzioni dei microtubuli dipendono
dalla associazione con proteine dette: MAP (microtubuleassociated protein)
Esistono diversi tipi di MAP:
- MAP che stabilizzano i microtubuli e regolano la loro
organizzazione spaziale, associandosi alle subunità di
tubulina
- MAP, motori microtubulari che interagendo con i
microtubuli generano movimenti di organuli
21
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
-MAP che favoriscono la polimerizzazione, stabilizzano e
coordinano l’organizzazione dei microtubuli nel citoplasma
Le MAP2 hanno
un dominio
sporgente lungo
Le tau, MAP
con un dominio
sporgente corto
In assone di
neuroni
neuroni con MAP2
formano fasci di
MT stabili tenuti
lontani tra loro
neuroni con
TAU
formano fasci
di MT molto
compatti
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IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI
MAP: MOTORI MICROTUBULARI
- hanno un sito di attacco per il MT e per la membrana di un organulo
-si muovono in modo unidirezionale, trasportando l’organulo lungo il MT
- hanno attività ATPasica (il movimento richiede ATP)
CHINESINA
organulo
Nota importanza dell’orientamento del MT
organulo
DINEINA
23
Chinesine e Dineine passeggiano
sui microtubuli
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MICROTUBULI e
motori microtubulari
I microtubuli e i motori microtubulari sono necessari
al posizionamento corretto degli organuli nel citoplasma
MICROTUBULI
INTEGRI
L ’apparato del Golgi (VERDE) è
normalmente in posizione
perinucleare
MICROTUBULI DEPOLIMERIZZATI
(agenti farmacologici)
l’apparato del Golgi si disperde nel
citoplasma
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MICROTUBULI e
motori microtubulari
I microtubuli e i motori microtubulari sono necessari
al posizionamento di
apparato del Golgi e reticolo endoplasmatico
+
l’apparato di Golgi viene “tirato”
dalle dineine verso il centro della
cellula
il reticolo endoplasmatico viene
“tirato” verso la periferia della
cellula da chinesine
-
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MICROTUBULI e
motori microtubulari
I MT e i motori microtubulari sono concentrati
nelle cellule nervose. Nell’assone sono distribuiti
con lo stesso orientamento e garantiscono il
trasporto di vescicole e organuli (vescicole
secretorie, mitocondri) tra le diverse parti della
cellula: trasporto assonico
Alterazioni nel trasporto assonico sono associate
a patologie nuerodegenerative: Alzheimer
27
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI: fuso mitotico
I Microtubuli
costituiscono il fuso
mitotico (ME)
durante la divisione
cellulare
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I Microtubuli
costituiscono il fuso
mitotico (IIF)
Esistono molecole che interagiscono
con i componenti del fuso:
- Colchicina (da una pianta: croco)
lega la tubulina libera e ne impedisce
la polimerizzazione
-Taxolo (da un pianta: tasso)
stabilizza i MT
Queste molecole bloccano
la mitosi!
- La funzione del fuso mitotico è
mantenuta se i MT possono
polimerizzare e depolimerizzare
-Tali molecole sono utilizzate in
ambito clinico:
composti chemioterapici
29
IL CITOSCHELETRO MICROTUBULI in
strutture stabili della cellula: Ciglia e Flagelli
I MT presentano una
organizzazione specifica
in ciglia e flagelli e sono
responsabili del loro
movimento
Ciglia e flagelli sono espansioni
mobili di alcuni tipi cellulari (cellule
30
epiteliali, spermatozoo)
Microtubuli
Microfilamenti
Filamenti intermedi
31
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
La G actina ha una polarità (estremità + e -)
mantenuta nell’assemblaggio
Microfilamenti
I microfilamenti (MF) sono polarizzati come i MT
6 nm
G-actina
PM 42 kDa
F-actina
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IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Localizzazione:presenti in tutte le cellule e, in misura
maggiore, nelle cellule contrattili.
FUNZIONI
- Formano una rete di supporto per il mantenimento
e modificazioni della forma cellulare, in
particolare della superficie cellulare
-Intervengono nella adesione al substrato (matrice
extracellulare) e movimento cellulare
-Intervengono nelle attività contrattili delle cellule
- Forniscono supporto e rigidità a strutture fisse
di alcuni tipi cellulari (microvilli e stereociglia)
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IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Polimerizzazione in vitro a partire da subunità
La fase di equilibrio si ottiene
ad una concentrazione
critica di monomeri
La quantità di monomeri
aggiunta equivale a quella
che si dissocia
Le subunità di actina polimerizzano attraverso la formazione di legami
chimici non covalenti
La formazione dei primi aggregati di subunità (nucleazione) è lento
perché i piccoli aggregati sono instabili
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IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
La polimerizzazione, la organizzazione e le funzioni dei
microfilamenti dipendono anche dalla associazione con altre
proteine:
Proteine che regolano la polimerizzazione
Proteine che regolano la loro organizzazione reciproca
Proteine che regolano le funzioni
Proteine Arp
Monomeri di actina
favoriscono la
polimerizzazione
Gelsolina
Frammentazione
Cofilina
Depolimerizzazione
Proteine che
sequestrano i monomeri
Timosina e profilina
e regolano la
polimerizzazione
filamenti di actina
Proteine
cappuccio che
bloccano la35
polimerizzazione
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Proteine che regolano la polimerizzazione
La formazione dei
filamenti di actina è
indotta dalle
Proteine ARP (2 e 3)
Il complesso ARP2/3:
1)
facilita la
formazione dei
primi aggregati di
actina (nucleazione)
alla estremità meno
favorendo
allungamento
da meno a più
2)
Può legare i
filamenti di actina
favorendo la
formazione di una
rete
La attività di ARP è
spesso regolata da
36
segnali extracellulari
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Proteine che regolano la polimerizzazione
Timosina lega actina e
blocca la crescita
Profilina lega actina e
favorisce la crescita
Gelsolina lega actina e
favorisce la frammentaione
37
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Proteine che regolano la loro organizzazione reciproca
filamenti di actina
Proteine che formano
reti:
Filamina
proteine che formano
fasci:
alpha actinina
Fimbrina
38
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
I microfilamenti forniscono sostegno
per strutture stabili di alcuni tipi
cellulari specializzati: i microvilli
proteine che formano
fasci:
Fimbrina
Alla base i MF sono
stabilizzati
ancorandosi a una
fitta rete di actina
39 e
filamenti intermedi
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Proteine che regolano le funzioni
Come per i MT, proteine motrici si associano ai
microfilamenti per generare movimento: miosina
Miosina I
1 testa
e 1 coda
Questa
interazione
determina
spostamenti di
vescicole e
modificazioni
della membrana
Miosina II
2 teste
e 1 coda
Questa
interazione
determina
attività
contrattili
Miosina I
vescicola
Miosina II
40
Esempi di contrattilità associati ai microfilamenti
L’anello contrattile che consente
la separazione delle due cellule
figlie in mitosi consiste di
microfilamenti di actina e miosina
actina
miosina
Comprenderemo l’interazione
actina-miosina nei dettagli trattando del
41
Tessuto Muscolare
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Nella cellula in interfase i MF
formano una fitta rete sotto la
membrana: impalcatura di
sostegno meccanico alla superficie
cellulare
I MF in prossimità della
superficie intervengono
inoltre nel consentire:
- modificazioni della forma
es. tramite una
organizzazione in espansioni
cellulari dette pseudopodi:
filopodi (forma filiforme)
lamellipodi (forma laminare)
lobopodi (forma globosa)
- adesione al substrato
(contatti focali)
42
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI- Modello di aggregazione e
disaggregazione dei filamenti di actina nella formazione di pseudopodio
• Testo 4.4
La profilina favorisce la
nuova polimerizzazione
vecchi
43
IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Nei contatti focali (aree di adesione
estese tra cellula e matrice):
-i MF si concentrano formando fasci
I contatti focali consentono alle
cellule di:
- aderire alla matrice
extracellulare
- esercitare trazione su matrice
extracellulare
- ricevere segnali dalla matrice che
ne regolano il comportamento
- originare movimento cellulare
(ameboide)
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IL CITOSCHELETRO MICROFILAMENTI
Fibre stress
La miosina interagisce con i
microfilamenti nelle fibre da
stress: fasci di actina che hanno
attività contrattile
Actina-miosina
contatti focali
La miosina II genera
forze contrattili fra i
filamenti di actina
che si ancorano alla
membrana nei contatti
focali
45
Walcott S , Sun S X PNAS 2010;107:7757-7762
MICROFILAMENTI
MOVIMENTO AMEBOIDE
1. protrusione: la cellula
emette espansioni in
avanti, tramite
polimerizzazione di
filamenti di actina
3.Trazione.
La porzione
posteriore della
cellula si contrae
e la cellula è
tirata in avanti
Interazioni
ACTINAMIOSINA II
2.Adesione
la cellula
aderisce
al substrato
nei contatti
focali
3.Trazione in
avanti del
citoplasma
tramite
interazione
actinamiosina 46
II
MICROFILAMENTI
Nei contatti focali i MF si
concentrano formando
FIBRE da STRESS
In espansioni cellulari
possono fare fasci stretti
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Fibre da stress e filopodi
Fibroblasto in movimento ameboide osservato al
microscopio a scansione.
Tale movimento è caratteristico di diverse cellule:
fibroblasti, cellule embrionali, macrofagi, leucociti.
lamellipodi
48
MICROFILAMENTI regolazione
Segnali extracellulari possono regolare il comportamento del citoscheletro
Es. PIASTRINE
I segnale
Se
Ca++
II segnale
49
Microtubuli
Microfilamenti
Filamenti intermedi
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IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI
CLASSE ETEROGENEA
GRUPPI PRINCIPALI di filamenti intermedi
Proteine costitutive
Distribuzione
Cheratine
Epiteli e derivati
Vimentina
Desmina
GFAP
Cellule mesenchimali
Cellule muscolari
Astrociti
Periferina
Neuroni SNP
Proteine dei Neurofilamenti
(NF-L, NF-H, NF-M)
Neuroni
Lamine nucleari (A,B,C)
Involucro nucleare
51
IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI
-Organizzazione generale
comune
-Strutture filamentose
stabili formate da
subunità proteiche lineari
I dimeri hanno
direzione opposta
NO polarità!
Funzione:
conferire
resistenza a stress
meccanici da
stiramento
Concentrati in
alcune cellule:
I tetrameri si uniscono in lunghi fili
affiancati simili a corde
-cellule epiteliali
-cellule nervose
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FILAMENTI INTERMEDI di cheratina
(o tonofilamenti)
I filamenti intermedi di
cheratina si concentrano nelle
cellule epiteliali.
Formano una rete
citoplasmatica e si
concentrano in strutture
specializzate per l’adesione
cellulare (i desmososmi)
Tonofilamenti evidenziati mediante la
tecnica della Immunofluorescenza
53
IL CITOSCHELETRO FILAMENTI INTERMEDI
Il ruolo dei tonofilamenti nel conferire resistenza
meccanica è chiaramente visibile in questa immagine
Stiramento di cellule
con filamenti intermedi
Lo strato cellulare rimane
integro
Stiramento di cellule
prive di filamenti
intermedi
Rottura delle adesioni
cellulari
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FILAMENTI INTERMEDI: neurofilamenti
I neurofilamenti si concentrano negli
assoni dei neuroni fornendo resistenza
alla tensione
I neurofilamenti sono caratterizzati da
protrusioni: legami laterali che aumentano la
resistenza a tensione
Sclerosi laterale amiotrofica (SLA)
(cause sconosciute). I NF si accumulano,con
alterazione del trasporto assonale e
progressiva atrofia muscolare
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FILAMENTI INTERMEDI di lamina
I filamenti intermedi
formano una fitta
rete al di sotto
dell’involucro
nucleare:
Lamina nucleare
Lamina nucleare
si digrega e si riforma
durante la divisione
cellulare
Lamna nucleare al
microscopio elettronico
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IL CITOSCHELETRO nelle giunzioni cellulari
I componenti del citoscheletro interagiscono con i
sistemi di giunzione cellulare (tra cellula e cellula)
Lezione degli epiteli…
57