Aprile-Giugno 2014 • Vol. 44 • N. 174 • Pp. 72-80
Ematologia Pediatrica
Quando e come sospettare una patologia della
membrana del globulo rosso
Immacolata Andolfo1,2, Roberta Russo1,2, Achille Iolascon1,2
CEINGE - Biotecnologie Avanzate, Napoli
Dipartimento di Medicina Molecolare e Biotecnologie Mediche, Università “Federico II”, Napoli
1
2
Riassunto
La membrana dell’eritrocita è una delle più conosciute in termini di struttura, funzione e disordini genetici correlati. La maggior parte delle proteine di
membrana del globulo rosso (GR) sono state studiate in grande dettaglio e anche i geni responsabili delle patologie di membrana correlate sono ad oggi
noti. I disordini legati a difetti della membrana del GR comprendono un gruppo piuttosto eterogeneo di patologie ereditarie legate ad alterazioni a carico di
varie proteine di membrane o del citoscheletro del GR, con conseguente diminuzione della deformabilità eritrocitaria, ridotta emivita e prematura rimozione
degli eritrociti dal circolo.
Tale gruppo di disordini include: sferocitosi ereditaria (HS), ellissocitosi ereditaria (HE), piropoichilocitosi ereditaria (HPP), ovalocitosi del sud-est asiatico
(SAO), stomatocitosi ereditaria deidrata (DHSt) ed overidrata (OHSt), pseudoiperkalemia familiare (FP), crioidrocitosi ereditaria (CHC).
In questa review riassumeremo i progressi fatti nella conoscenza delle patologie di membrana del GR, ed in particolare descriveremo: i) organizzazione
strutturale della membrana eritrocitaria; ii) interazione tra le varie proteine di membrane e citoscheletriche e i difetti associati ad esse; iii) metodologie,
compresa l’analisi genetica, che consentono la diagnosi di vari disturbi della membrana eritrocitaria.
Summary
The red cell membrane is one of the best known membranes in terms of structure, function and genetic disorders. The majority of the red blood cell
membrane proteins has been studied in great detail and also the genes responsible for diseases related to membrane are actually known. The disorders
associated with defects in the membrane of the red blood cell comprise an heterogeneous group of inherited diseases related to alterations in several
membrane proteins or in proteins of the cytoskeleton of the red blood cell, resulting in decreased erythrocyte deformability, reduced half-life and premature
removal of erythrocytes from circle.
This group of disorders includes: Hereditary Spherocytosis (HS), Hereditary Elliptocytosis (HE), Hereditary Pyropoikilocytosis (HPP), South East Asian Ovalocytosis (SAO), Dehydrated hereditary stomatocytosis (DHSt), Overhydrated Hereditary Stomatocytosis (OHSt), Familial Pseudohyperkalemia (FP), Cryohydrocytosis (CHC).
In this review, we will summarize the substantial progress that has been made in our understanding of membrane defects of red blood cells: i) structural
organization of the erythrocyte membrane including the complete characterization of a large number of membrane proteins, ii) structural basis for the
interactions between various membrane and cytoskeletal proteins and defects of these interactions due to mutations in genes that encode the various
proteins leading to defective membrane function; iii) appropriate methodologies including genetic analysis that allows the diagnosis of various disorders
of the erythrocyte membrane.
Parole chiave: Disordini legati a difetti della membrana del GR; Anemia; Diagnosi molecolare
Key words: Red blood cell membrane-related disorders; Anemia; Molecular diagnosis
Metodologia di ricerca bibliografica
La ricerca degli articoli rilevanti è stata effettuata tramite la banca
bibliografica PubMed, utlizzando come parole chiave: “membrane
defects of red blood cells”, “Hereditary Spherocytosis, (HS)”, “Hereditary Elliptocytosis, (HE)”, Hereditary Pyropoikilocytosis, (HPP)”,
“South East Asian Ovalocytosis, SAO”, “Xerocytosis”, “Dehydrated Hereditary Stomatocytosis, (DHSt)”, “Overhydrated Hereditary Stomatocytosis, (OHS)”, “Familial Pseudohyperkalemia, (FP)”,
“Cryohydrocytosis, (CHC)”.
Introduzione
I disordini legati a difetti della membrana del globulo rosso (MGR)
sono un gruppo eterogeneo di patologie ereditarie dovute ad alterazioni a carico di proteine di membrana o del citoscheletro del GR,
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con conseguente ridotta deformabilità e prematura rimozione degli
stessi dal circolo.
Il sospetto di una patologia della MGR viene posto in presenza di un
quadro clinico di anemia emolitica, di vario grado, ben compensata,
previa esclusione di altre cause: anemie autoimmuni, da deficit enzimatici, anemie iporigenerative, da alterata sintesi globinica. L’iter
diagnostico prevede il susseguirsi di indagini di primo, secondo e
terzo livello (Fig. 1).
Studi estensivi sulla MGR hanno permesso di conoscerne in dettaglio le funzioni e la struttura. La base molecolare della stragrande
maggioranza di casi di alterazione della MGR (sferocitosi ereditaria
[HS], ellissocitosi [HE], ovalocitosi [SAO]) sono stati completamente
definiti. Per quanto riguarda le basi molecolari dei disordini legati
all’alterata permeabilità della MGR (stomatocitosi ereditarie), durante lo scorso anno sono stati identificati i geni causativi sia della
forma deidrata che della pseudoiperkalemia familiare.
Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso
Figura 1.
Diagramma di flusso per la diagnosi delle anemie ereditarie legate
a difetti della MGR. Sono rappresentati i principali step che consentono la diagnosi differenziale.
La membrana del globulo rosso: proteine integrali di
membrana e loro interazioni con il citoscheletro
La caratteristica più importante della MGR è la deformabilità: durante i suoi 120 giorni di vita, il GR subisce deformazioni passive al fine
di circolare attraverso la fitta rete di capillari del microcircolo (Iola-
scon et al., 2010). La MGR è composta da un doppio strato lipidico
costituito da fosfolipidi e colesterolo, in cui sono immerse le proteine
trans-membrana (PTM) (Fig. 2). Queste ultime funzionano da ancora
per il citoscheletro, un network bidimensionale di proteine responsabile dell’elasticità e flessibilità del GR (An e Mohandas, 2008). Una
caratteristica peculiare della MGR è la distribuzione asimmetrica
dei fosfolipidi; ad esempio, fosfatidilcolina e sfingomielina predominano nel foglietto esterno, laddove fosfatidiletanolammina (PE) e
fosfatidelserina (PS) in quello interno (Zwaal e Schroit, 1997). La
distribuzione asimmetrica dei fosfolipidi assume una rilevanza funzionale, poiché la PS interagisce con proteine del citoscheletro, quali
la spettrina e la proteina 4.1, ancorando il citoscheletro al doppio
strato lipidico.
Come tutte le membrane plasmatiche, la MGR media le funzioni di
trasporto; sono state, infatti, identificate più di 50 PTM con funzione
di trasporto di ioni e di piccole molecole organiche. Le PTM, tuttavia,
possono anche fungere da antigeni, attraverso i glicani a loro legati,
come quelli dei gruppi sanguigni (antigeni del gruppo AB0), oppure
svolgere il ruolo di adesione cellulare con altre cellule del sangue
o con cellule endoteliali (Reid e Mohandas, 2004). Le PTM rilevanti
per l’integrità strutturale sono la banda 3 (scambiatore anionico, la
proteina più abbondante nella MGR), la glicoforina C e l’RhAG, che
legano il doppio strato lipidico al citoscheletro (spettrina) tramite
l’anchirina, le prime due, e tramite la proteina 4.1, la terza (Bennett
et al., 1983; Nicolas et al., 2003; Marfatia et al., 1995). Banda 3 e
RhAG sono PTM con funzione di trasportatori di anioni e gas (Iolascon et al., 2003).
Le principali proteine che compongono il network del citoscheletro
sono: spettrina α- e β- (le più abbondanti, circa 20-30%), actina,
proteina 4.1, adducina, dematina, tropomiosina e tropomodulina
(Mohandas e Reid, 2006). La caratteristica peculiare del lungo filamento di spettrina è una ripetizione di 106 amminoacidi presenti in
tripla elica, 21 nell’α-spettrina e 15 nella β- (Yan et al., 1993). Le
Figura 2.
Rappresentazione schematica della membrane del globulo rosso.
La membrana del globulo rosso è composta da un doppio strato fosfolipidico (indicato in celeste) con le proteine TM che lo attraversano. Il
network di proteine del citoscheletro si ancora alla membrana tramite le proteine TM.
73
I. Andolfo et al.
due spettrine formano un eterodimero anti-parallelo attraverso le
interazioni laterali tra regione C-terminale dell’α-spettrina con regione N-terminale della β-spettrina (Ursitti et al., 1996). Il dimero
di spettrina è regolato dinamicamente nel GR e la perdita di questa
interazione si esplica nella diminuzione della stabilità meccanica (An
et al., 2002). L’altra parte del dimero di spettrina forma un complesso giunzionale con l’actina e la proteina 4.1R (An et al., 2005). Il
complesso ternario di spettrina-actina e proteina 4.1 è un regolatore
critico dell’integrità meccanica della MGR (Fig. 2).
Patologie di membrana del globulo rosso:
epidemiologia, presentazione clinica, indagini di
primo livello
Sferocitosi ereditaria
La sferocitosi ereditaria (HS) è la più comune patologia di membrana
del globulo rosso, nonché la causa più comune di anemia emolitica
non-immune nella popolazione caucasica, con una prevalenza stimata tra 1:2000 e 1:5000 (Delaunay, 2007).
I principali segni sono: anemia emolitica normocitica di grado variabile, aumento della percentuale di cellule iperdense (Hb>41g/dL)
aumento della concentrazione media di Hb corpuscolare (MCHC)
>36 g/dL, reticolocitosi, ittero, splenomegalia e colelitiasi. Nelle forme più comuni essi compaiono una o due settimane dopo la nascita.
Nei primi mesi di vita la situazione può peggiorare temporaneamente a causa della ridotta attività eritropoietica, determinando un bisogno trasfusionale. Lo stato clinico tende poi a migliorare.
L’HS presenta elevata variabilità fenotipica; il quadro clinico copre,
infatti, un’ampia gamma di manifestazioni, da casi con idrope fetale
a quelli asintomatici. Può essere classificata in lieve, moderata, moderatamente grave e grave in relazione ad alcuni parametri, come
emoglobina (Hb) e conta reticolocitaria. Circa il 20% dei pazienti
presenta una HS lieve, con emolisi compensata, livelli di Hb pressoché normali, lieve reticolocitosi (< 6%) e splenomegalia. La maggior
parte dei pazienti di questo gruppo sfugge alla diagnosi fino all’età
adulta, allorquando si manifestano complicazioni legate all’emolisi
cronica, come la calcolosi biliare. La quota più numerosa di pazienti (60% dei casi) rientra nella HS di grado moderato, con livelli di
Hb compresi tra 8.0-11.0 g/dL e reticolocitosi marcata (> 8%). Una
minoranza di pazienti (10%), definiti HS moderatamente gravi, esibisce valori piuttosto bassi di Hb (6.0-8.0 g/dL), grave reticolocitosi (>
15%) e la necessità di trasfusioni intermittenti. Infine, circa il 3-5%
dei pazienti presenta anemia grave con fabbisogno regolare di trasfusioni (An e Mohandas, 2008).
Una storia familiare di HS, splenectomia, e colecistectomia aiutano
nella diagnosi, poiché gli sferociti sono spesso presenti anche in casi
di anemia emolitica autoimmune. Gli sferociti sono il risultato di una
riduzione del rapporto tra superficie e volume, correlato alla perdita
di MGR a causa dell’alterata interazione tra fosfolipidi di membrana
Tabella I.
Diagnosi differenziale dei difetti di membrana del globulo rosso.
Patologia (acronimo)
Indici eritrocitari
Analisi morfologica
dello striscio di sangue
periferico
Indici
biochimici
Ectacitometria
Forma curva
§
§
§
DImax
O’
Omin
point
Sferocitosi ereditaria
(HS)
MCV normale
MCH aumentato
MCHC aumentato
Sferociti, policromatofilia
GR a funghetto
OF ridotto
AGLT50 ridotto
PT ridotto
EMA ridotto
Stessa forma
di un CTR ma
spostata a dx
Dimuito
Spostato a sn
Spostato
a dx
Ellissocitosi ereditaria
(HE)
MCV normale
MCHC aumentato
nei casi gravi
Ellissociti, sferociti,
stomatociti, cellule
frammentate, poichilocitosi
OF può essere
aumentato nei
casi gravi
Forma
trapeiziodale
Dimuito
Normale
Normale
Piropoichilocitosi
ereditaria (HPP)
MCV diminuito
ellissociti e GR frammentati
Nd
Forma
trapezioidale
Molto
Spostato a sn
diminuito
Spostato
a sn
Ovalocitosi del sud-est MCV normale
asiatico (SAO)
MCH normale
Ovalociti con fessura
intracitoplasmatica
Nd
Forma
appiattita
verso il basso
Quasi 0
Spostato a
sn o quasi
uguale al CTR
Spostato
a sn
Stomatocitosi
ereditaria deidrata
(DHSt)
MCV aumentato
MCHC aumentato
Stomatociti (<10%)
OF aumentato
Stessa forma
di un CTR ma
spostata a sn
Normale
Spostato a sn
Spostato
a sn
Stomatocitosi
ereditaria overidrata
(OHSt)
MCV molto
aumentato
MCHC ridotto
Stomatociti in gran numero
OF diminuito
Stessa forma
di un CTR ma
spostata a dx
Normale
Spostato a dx
Spostato
a dx
Crioidrocitosi
ereditaria (CHC)
MCV lievemente
aumentato
Rari stomatociti
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Pseudoiperkalemia
familiare (FP)
MCV lievemente
aumentato
Rari stomatociti
Nd
Nd
Nd
Nd
Nd
Parametri valutati rispetto ad un individuo di controllo non patologico (CTR); dx, destra; sn, sinistra
OF, test della fragilità osmotica; AGLT50, test al glicerolo acidificato; PT, test pink; Nd, notizie non disponibili; AD, autosomico dominante; AR, autosomico recessiva
§
74
Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso
e citoscheletro (Da Costa et al., 2001). Il sequestro degli sferociti,
non deformabili, nella milza e la successiva fagocitosi da parte dei
macrofagi splenici, è responsabile dell’anemia e della splenomegalia. Nella HS la splenectomia è indicata nei casi gravi, risultando
risolutiva dello stato anemico e della calcolosi biliare. Non è invece
consigliata nei casi di HS lieve, salvo in casi specifici. In ogni caso,
l’intervento dovrebbe essere programmato solo dopo i 6 anni di età
e per via laparoscopica (Bolton-Maggs et al., 2012).
Nei casi in cui la diagnosi non sia evidente (assenza di storia familiare e di manifestazioni cliniche tipiche) bisogna effettuare test
biologici specifici. I test OF, AGLT50 e PT hanno una sensibilità bassa (~ 68%, 61% e 91%, rispettivamente). Il test EMA, invece, raggiunge una sensibilità del 92,7% ed una specificità del 99,1%, e
rappresenta il test di elezione, nonostante risulti positivo anche in
altre patologie. Questo test è effettuato mediante la colorazione dei
GR con l’eosina-5′ maleimide (EMA); è in grado di rilevare difetti di
banda 3, spettrina e proteina 4.2 mentre è meno sensibile nell’individuare difetti dell’ankirina (Da Costa et al., 2013). L’ectacitometro è
un viscometro, nel quale la deformabilità dei GR è valutata tramite la
sospensione in una soluzione viscosa e l’applicazione di uno stress
osmotico (mezzo a crescente osmolarità). L’ectacitometria costituisce un ottimo e sicuro ausilio diagnostico, ma tale mezzo è scarsamente disponibile in Italia (Tab. I).
Ellissocitosi ereditaria, piropoichilocitosi e ovalocitosi del sudest asiatico
L’ellissocitosi ereditaria (HE) ha una prevalenza stimata di
3-5:10000 a livello mondiale, sebbene risulti, analogamente ad
altri difetti del globulo rosso, più elevata nelle regioni endemiche
della malaria, raggiungendo il 2-5% in Africa Occidentale (Dhermy
et al., 2007). Analogamente alla HS, la presentazione clinica della
HE è eterogenea. La stragrande maggioranza degli individui affetti
è asintomatica e la condizione viene diagnosticata fortuitamente
in seguito all’osservazione di uno striscio di sangue, che rivela la
presenza di ellissociti, il cui numero varia da pochi fino alla quasi
totalità dei GR; tuttavia, il grado di emolisi non correla con il loro
numero. Allo striscio sono evidenziabili anche sferociti, stomatociti
e, nei casi più gravi, poichilociti e cellule frammentate (An e Mohandas, 2008). Un percentuale ridotta di pazienti (10%) esibisce
anemia emolitica grave, ittero e splenomegalia (Da Costa et al,
2013). Seppur rari, sono stati anche descritti casi ad insorgenza
neonatale e rarissimi casi di idrope fetale (Gallagher et al., 1995
e 1997). La curva ectacitometrica mostra una forma trapeiziodale
con dimunizione della DImax (Fig. 4).
La piropoichilocitosi ereditaria (HPP) fu descritta originariamente
come entità nosologica distinta causata da una maggiore sensibilità termica dei globuli rossi e caratterizzata da anomalie morfologiche insolite, simili a quelle osservate negli strisci di sangue a
seguito di gravi ustioni termiche (Zarkowsky et al., 1975). Tuttavia,
la successiva delucidazione dei difetti molecolari che sottendono
tale condizione ha definitivamente stabilito che la HPP è un sottogruppo della HE (Gallagher et al., 2004). La HPP è caratterizzata
da anemia emolitica grave con poichilocitosi, GR frammentati, con
conseguente MCV ridotto (50-60 fL), microsferociti. I pazienti esibiscono marcata splenomegalia, la splenectomia è quindi di solito
consigliata.
L’ovalocitosi del Sud-Est asiatico (SAO) è una condizione molto
comune nelle popolazioni aborigene di Papua Nuova Guinea, Indo-
Figura 3.
Strisci di sangue periferico (colorazione May-Grundwald Giemsa) di varie patologie della MGR esaminati al microscopio ottico.
A. Tipica HS con difetto nella banda 3, in cui sono evidenziati: un GR a funghetto (freccia verde), sferociti che appaiono densi ed ipercromici (frecce
nere), alcuni acantociti (frecce rosse). B. HE con indicati i classici ellissociti di forma allungata (frecce rosse) ed alcuni ovalociti (frecce blu). C. HPP,
forma severa di HE, che mostra ellissociti (frecce rosse), ovalociti (frecce blu) e GR frammentati (frecce nere). D. SAO con ovalociti (frecce nere),
manifestazione tipica di tale difetto E. DHSt in cui sono evidenziabili gli stomatociti, GR con la classica forma a bocca. F. OHSt, mostra anch’essa
stomatociti (frecce nere) ma in grande quantità rispetto a DHSt. (Modificato da Da Costa L et al., 2013).
75
I. Andolfo et al.
Figura 4.
Esempi di curve ectacitometriche di patologie della MGR.
A. HS con curva della stessa forma del CTR, con Dimax diminuito, Omin aumentato, O’ diminuito; B. HE ed HPP con curve a forma trapezoidale con Dimax molto diminuito, Omin uguale o diminuito e O’ diminuito; C. DHSt con curva spostata verso sinistra rispetto al CTR, Dimax
normale, Omin e O’ diminuiti. D. OHSt con curva spostata verso destra rispetto al CTR, Dimax normale, Omin e O’ aumentati.
*DImax (indice di massima deformabilità) è il valore massimo dell’indice di deformabilità. **Omin (punto ipo-osmotico) è l’osmolarità alla
quale l’indice di deformabilità raggiunge il minimo nella regione ipotonica (braccio sinistro della curva), equivale all’osmolarità alla quale il
50% dei GR emolizza in un test di resistenza osmotica, misura il rapporto area-volume dei GR. ***O’ (punto iper-osmotico) è l’osmolarità
nella regione ipertonica (braccio destro della curva), alla quale l’indice di deformabilità raggiunge metà del suo valore massimo. Fornisce
informazioni sull’idratazione dei GR. Curva con linea tratteggiata: soggetti di controllo (CTR); curva con linea continua: pazienti. (Adattata
da Delaunay J. 2007).
nesia, Malesia, Filippine e Tailandia meridionale, in zone in cui la
malaria è endemica, con prevalenza variabile tra 5 e 25% (Amato
e Booth, 1977). La condizione offre una certa protezione contro
tutte le forme di malaria. Nonostante la ridotta deformabilità in vitro degli eritrociti SAO, i pazienti sono completamente asintomatici e la diagnosi è posta casualmente a seguito dell’esame dello
striscio, che presenta caratteristici ellissociti arrotondati (ovalociti) (Fig. 3). Tuttavia, nei neonati può manifestarsi come anemia
emolitica e richiede fototerapia. La deformabilità degli eritrociti in
vitro risulta drasticamente diminuita all’ectacitometria, con una
curva con DImax quasi nullo (Da Costa et al., 2013). Paradossalmente, questa diminuzione in vitro ha poco effetto sulla sopravvivenza dei GR in vivo. Al contrario di altre forme di ellissocitosi, la
SAO è associata ad un’aumentata rigidità dei GR e ad una ridotta
fragilità osmotica (OF) (Tab. I).
76
Stomatocitosi ereditaria: forma deidrata e overidrata,
pseudoiperkalemia familiare isolata e crioidrocitosi
Il termine stomatocitosi include due entità nosologiche distinte: la
xerocitosi o stomatocitosi ereditaria disidratata (DHSt) e la stomatocitosi ereditaria overidrata (OHSt) (Delaunay, 2007). Entrambe mostrano alterazione della permeabilità della MGR ai cationi monovalenti Na+ e K+ con conseguente alterazione del contenuto cationico
intracellulare e alterazioni del volume cellulare. La DHSt è la più
rappresentata tra le stomatocitosi ereditarie. La sua incidenza è di
circa 1:50000 nati vivi. Come stima approssimativa, è da dieci a
venti volte meno frequente rispetto alla HS, con la quale può essere,
tuttavia, confusa. Anche in questo caso, il fenotipo può variare da
forme asintomatiche a gravi, con emolisi massiva. Generalmente,
il paziente DHSt manifesta un’anemia emolitica ben compensata,
con elevata conta reticolocitaria e tendenza alla macrocitosi, ittero
Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso
lieve e intermittente. Nella DHSt la caratteristica principale del GR
è la disidratazione cellulare, a causa della perdita del contenuto di
cationi. Di conseguenza, l’MCHC aumenta (>36 g/dL) ed il profilo
di deformabilità all’ectacitometria è spostato verso sinistra con una
DImax normale ed i parametri Omin e Hyper point ridotti, indicando
appunto disidratazione (Delaunay, 2007) (Tab. I, Fig. 4).
Allo striscio gli stomatociti, emazie con il caratteristico alone centrale a forma di bocca, sono piuttosto rari, rendendo la diagnosi spesso
difficile. Inoltre, quest’ultima può risultare difficoltosa quando il quadro clinico si associa a pseudoiperkaliemia e/o edema perinatale,
nella forma denominata sindrome pleiotropica (Delaunay, 2004). Per
tali motivi, la condizione può essere trascurata per anni o decenni
prima di raggiungere una diagnosi conclusiva. La pseudoiperkalemia
consiste nell’aumento della kalemia quando il prelievo di sangue periferico è esposto a temperature inferiori a quella corporea. L’edema
pre/perinatale è un edema di tipo chiloso, spesso già visibile tramite
ecografia in epoca gestazionale e presente alla nascita. Nei casi più
gravi l’edema richiede interventi di drenaggio, in altri casi si risolve
spontaneamente entro pochi mesi di vita.
L’OHSt è molto rara (20 casi segnalati in tutto il mondo). Contrariamente alla DHSt, i GR vengono idratati a causa di un aumento, da 20
a 40 volte, nella perdita di cationi (Stewart, 2004). L’OHSt si associa
a fenotipi più gravi, rispetto alla DHSt. Oltre alla reticolocitosi, è caratterizzata da un forte aumento dell’MCV (>110 fL) e diminuzione
dell’MCHC (24-30 g/dl) con uno spostamento verso destra del profilo
della curva ectacitometrica (Fig. 4). Il numero di stomatociti allo striscio è, di solito, molto più alto di quello osservato nella DHSt (Fig. 3).
Forme aggiuntive di stomatocitosi sono la pseudoiperkalemia familiare isolata (FP) e la crioidrocitosi (CH). La FP non è associata
ad anemia emolitica e allo striscio sono osservabili rari stomatociti.
Al contrario, nella CHC i pazienti mostrano un’anemia emolitica di
grado variabile. I GR di pazienti con FP mostrano una perdita di K+
a basse temperature (<37°C, perlopiù 8-10°C), ma non 37°C. Nella
CHC la caratteristica saliente è la dipendenza dalla temperatura della perdita di cationi: invece di essere intorno a 8-10°C, il minimo si
aggira intorno a 23°C (Delaunay, 2007).
Metodi biochimici e genetici per la diagnosi
La maggior parte dei disordini appena descritti presenta un’elevata variabilità fenotipica sia inter-familiare, correlata all’eterogeneità genetica che li caratterizza, che intra-familiare, correlata alla
co-ereditarietà di varianti in geni modificatori, ad esempio, il gene
UGT1A1 (Rocha et al., 2010) oppure di varianti a carico dei geni
dell’emocromatosi che possono aggravare il sovraccarico di ferro
in una condizione di anemia emolitica cronica, in cui l’assorbimento
del ferro è già aumentato.
Sferocitosi ereditaria (HS)
Il sospetto di diagnosi di HS è correlato alla presenza di segni di anemia normocitica con reticolociti aumentati. La normalità del test di
Coombs esclude le forme autoimmuni e la presenza di una storia familiare positiva (75% dei casi) conferma il sospetto. Nell’eventualità
che le indagini di primo livello (emocromo, conta reticolocitaria, FO ed
EMA test) siano positive non vi è motivo di richiedere approfondimenti
diagnostici. Essi, infatti, non possono aggiungere informazioni utili al
follow-up della malattia. Solo qualora ci si trovi di fronte ad un caso
di HS con genitori normali è possibile ricorrere alle indagini di secondo livello. I difetti molecolari responsabili dell’HS sono in gran parte rilevabili mediante elettroforesi delle proteine della MGR su gel di
poliacrilammide SDS-PAGE con gradiente esponenziale 4-12% (Fairbanks et al., 1971) e/o con un con gradiente lineare 6-14% (Laemmli
et al., 1970). A seguito dell’indagine biochimica è possibile effettuare l’indagine genetica. Diversi sono i geni associati all’HS (Tab. II). In
circa il 75% dei casi presenta mutazioni a trasmissione autosomica
dominante, con un genitore affetto. Il restante 25% è spiegabile con
mutazioni de novo o recessive. I geni con mutazioni dominanti e/o
de novo sono ANK1, SPTB, SLC4A1. Per quest’ultimo non sono state
descritte mutazioni sporadiche; inoltre, mutazioni nulle in omozigosi
in SLC4A1 sono associate ad anemia molto grave. Mutazioni nei geni
EPB42 e SPTA1 sono a trasmissione autosomica recessiva. Tutte le
mutazioni note del gene EPB42 cadono nella regione NH2-terminale
della proteina 4.2, che è responsabile del legame alla banda 3. Allo
stato attuale, non esistono linee guida stabilite per lo screening delle
Tabella II.
Biochimica e genetica dei difetti di membrana del globulo rosso.
Patologia (acronimo)
Trasmissione
Geni associati
SDS-PAGE
Sferocitosi ereditaria (HS)
75% AD;
25% AD
(de novo/AR)
ANK1 (50% dei casi)
SPTB (20% dei casi)
SPTA1 (molto rare)
SLC4A1 (20% dei casi)
EPB42 (rare)
Mutazioni in ANK1: riduzioni di spettrina e banda 4.2
Mutazioni in SPTB: riduzione di spettrina
Mutazioni in SLC4A1: riduzioni di banda 3 e proteina 4.2
Mutazioni in EPB42: assenza di proteina 4.2
Ellissocitosi ereditaria (HE)
AD
EPB41 (forme severe)
SPTB
SPTA1
Mutazioni in EPB41: assenza di proteina 4.1 e riduzione di
glicoforina C e D
Mutazioni in SPTA1 e SPTB: aumento del rapporto dimeri/
tetrameri di spettrina su gel non denaturante
Piropoichilocitosi ereditaria (HPP)
AR
SPTA1 + variante αLELY
-
Ovalocitosi del sud-est asiatico (SAO)
AD
SLC4A1
-
Stomatocitosi ereditaria deidrata (DHSt)
AD
PIEZO1
-
RHAG
-
Stomatocitosi ereditaria overidrata (OHSt) AD
Crioidrocitosi ereditaria (CHC)
AD
SLC4A1
-
Pseudoiperkalemia familiare (FP)
AD
ABCB6
-
AD, autosomica dominante; AR, autosomica recessiva
77
I. Andolfo et al.
mutazioni nei diversi geni responsabili della HS. Inoltre, nel 10-15%
dei casi, resta ancora da definire il gene causativo. La conoscenza
del difetto molecolare può essere fondamentale in casi particolari con
fenotipi ambigui o sovrapponibili ad altre patologie similari.
Ellissocitosi ereditaria, piropoichilocitosi e ovalocitosi del sudest asiatico
L’HE è una condizione ad ereditarietà autosomica dominante. In genere, gli individui eterozigoti per una variante HE in uno dei geni
causativi mostrano un fenotipo asintomatico, mentre gli individui
omozigoti o eterozigoti composti per varianti HE possono sviluppare
un’anemia da lieve a grave. Essa è dovuta a difetti nelle connessioni orizzontali delle proteine del citoscheletro, quali le interazioni dimero-dimero di spettrina e spettrina-actina-proteina, 4.1 del
complesso giunzionale (Fig. 2). Può essere dovuta a mutazioni nei
geni EPB41, SPTA1 e SPTB, che causano danni gravi nell’associazione dei dimeri di spettrina (Iolascon et al., 2003). L’HE mostra una
grande variabilità fenotipica inter- e intra-familiare, dovuta ad alleli
modificatori. Ne è un esempio l’αLELY (Low Expression Lyon) del
gene SPTA1, un aplotipo ipomorfo, molto frequente in tutti i gruppi
etnici, composto da due varianti, una missenso nell’esone 40 (Leu1857Val), l’altra di splicing nell’introne 45 del gene SPTA1. Quest’ultima determina, alterando lo splicing, la delezione di 6 amminoacidi
essenziali per la dimerizzazione delle catene α e β. Questo causa un
danno minimo, visto che, le catene α sono prodotte in eccesso (3-4
volte in più): infatti, pazienti omozigoti per il polimorfismo αLELY non
hanno nessun fenotipo patologico associato. Al contrario, se l’αLELY
è ereditato in trans con un allele HE, il fenotipo è grave, ovvero quello
dell’HPP (Da Costa et al., 2013). La ricerca di tale variante, infatti, è
alla base della diagnosi di HPP. La sua identificazione nel probando
e l’analisi di screening molecolare di entrambi i genitori con esame
dello striscio, con un genitore che presenta ellissociti e l’altro senza
nessuna anomalia morfologica ma portatore dell’αLELY, sono sufficienti per confermare la diagnosi HPP nel probando.
La SAO è ereditata come carattere autosomico dominante, ed è causata da una mutazione nella banda 3: si tratta di una delezione di
27 nucleotidi codificanti per gli amminoacidi da 400 a 408, localizzati tra i domini intracitoplasmatici e di membrana. La delezione è
in linkage disequilibrium con il polimorfismo Memphis (Lys56Glu). I
GR nella SAO mostrano una piccola perdita di cationi monovalenti
quando esposti a basse temperature, con una riduzione dei flussi
di anioni. La SAO potrebbe quindi essere classificata tra le malattie
genetiche che colpiscono il flusso passivo dei cationi monovalenti attraverso la MGR. Nonostante la frequenza degli eterozigoti sia
endemica, gli omozigoti non sono vitali. L’omozigosità creerebbe
un’alterazione del flusso ionico dei globuli rossi e, forse, una grave
acidosi renale distale dovuta alla perdita della banda 3 (espressa
anche nel rene), che sarebbe letale.
Stomatocitosi ereditaria: forma deidrata e overidrata,
pseudoiperkalemia familiare isolata e crioidrocitosi
La DHSt è ereditata come carattere autosomico dominante. Il locus
del gene candidato fu localizzato in 16q23-24 (Carella et al., 1998).
La tecnica dell’exome sequencing ha identificato PIEZO1 come causativo delle forme isolate e sindromiche di DHSt (Zarychanski et al.,
2012; Andolfo et al., 2013). Esso codifica per un meccanocettore, un
canale ionico attivato dalla pressione (Coste et al., 2010). La proteina
PIEZO1 è stata identificata nella membrana dei GR e nel topo è stato
dimostrato che forma un tetramero di circa 1.2 milioni di dalton, è
quindi il canale ionico più grande identificato fino ad oggi (Andolfo
et al., 2013; Kim et al., 2012). Nel nostro lavoro abbiamo identificato
78
mutazioni missenso in eterozigosi in PIEZO1 in 7 famiglie, con forme
isolate e sindromiche di DHSt. Studi funzionali condotti sia su GR di
pazienti che tramite studi di elettrofisiologia effettuati su oociti di
Xenopus hanno dimostrato che tali variazioni sono responsabili di
alterazioni del passaggio di corrente attraverso il canale (Andolfo et
al., 2013).
Recentemente sono state identificate mutazioni a carico del gene
RHAG come causative di OHSt (Genetet et al., 2012). RHAG è un
membro del complesso della banda 3 ed è un trasportatore di ammonio e/o gas. La proteina stomatina è stata trovata a livelli bassi
o assenti nella OHSt ma non sono mai state trovate mutazione nel
gene che la codifica; è quindi probabile che il difetto nella stomatina
sia secondario.
Il gene responsabile della FP, mappato sul cromosoma 2q35-q36
(Carella et al., 2004), è stato recentemente identificato, ABCB6 (Andolfo et al., 2013). Due sono state le mutazioni identificate, che interessano lo stesso codone (Tab. II). ABCB6 appartiene alla famiglia
dei trasportatori ABC con cassetta di legame per l’ATP, una delle famiglie più abbondanti di proteine integrali di membrana (Dawson et
al., 2006). ABCB6 è espresso sulla membrana dei precursori eritroidi
durante tutto il differenziamento e sulla membrana del GR maturo.
Analisi della struttura tridimensionale della proteina, suggeriscono
che le due mutazioni alterano la struttura della proteina. Studi funzionali per dimostrate il meccanismo patogenetico della malattia
sono ancora in corso.
Nella CHC sono state descritte mutazioni nella banda 3 (Tab. II),
che trasformano la banda 3 da scambiatore anione a trasportatore
cationico. La mutazione p.Leu687Pro è responsabile di una forma
intermedia tra il CHC e la FP (Blackburn stomatocitosi) (Da Costa et
al., 2013).
Infine, esistono alcune forme di stomatocitosi, dovute a mutazioni
in banda 3, riclassificate come HS con perdita di cationi a basse
temperatura (HS-LTL) (Bruce, 2005) o come stomatocitosi associate
a forme di anemia diseritropoietica (Tab. II) (Iolascon et al., 2009;
Olivieri et al., 1992).
Conclusioni
Le patologie della MGR sono un gruppo piuttosto eterogeneo di difetti ereditari, tra loro dissimili ma in alcuni casi con fenotipi molto
sovrapponibili. Effettuare una diagnosi differenziale può risultare
spesso difficile. È, pertanto, fondamentale, quando si è di fronte ad
un paziente con anemia emolitica, nel quale siano state escluse tutte le altre possibili cause di anemia, effettuare una corretta analisi
dello striscio di sangue periferico e valutare la trasmissione della
patologia nella famiglia. I test biochimici possono essere un utile
riferimento diagnostico, soprattutto nella HS, ma presentano ridotta
sensibilità. La combinazione del test EMA con l’ectacitometria risulta
risolutiva per la diagnosi di quasi tutti i difetti di membrana del GR
anche se le linee guida non la annoverano tra le analisi di elezione,
a causa della sua scarsa disponibilità. Inoltre, tale metodica viene
condotta su una esigua quantità di sangue e risulta, quindi, praticabile anche nei neonati.
L’indagine genetica è essenziale nei casi con fenotipo ambiguo. In
quest’ultimo caso, le nuove tecniche di sequenziamento, quali la
NGS saranno sempre più utili per velocizzare l’analisi, ridurre i costi
e fornire una diagnosi certa.
Le prospettive future in questo campo sono: i) sviluppo di test diagnostici più sensibili e specifici; ii) identificazione di nuovi geni causativi;
iii) creazione di indicazioni appropriate per la splenectomia, soprattutto nei bambini e nei casi in diagnosi differenziale tra HS e DHSt.
Quando e come sospettare una patologia della membrana del globulo rosso
Box di orientamento
Che cosa si sapeva prima
La struttura e la funzione della membrana del GR è conosciuta in dettaglio. I difetti di membrana del GR sono dovuti ad alterazioni di proteine di membrana e di proteine citoscheletriche, che modificano le connessioni verticali tra fosfolipidi di membrana e citoscheletro e quelle orizzontali tra proteine
del citoscheletro. Esistono metodi clinici, morfologici e biochimici per diagnosticare tali patologie. In casi particolari, il fenotipo risulta molto sovrapponile e non discriminabile con tali metodiche.
Che cosa sappiamo adesso
L’identificazione dei geni causativi di tali patologie, di recente, quelli della DHSt ed FP permettono di effettuare anche l’indagine molecolare e discriminare casi con fenotipo ambiguo o sovrapponibile a più difetti di membrana. Lo studio continuo dei test biochimici da effettuare ha permesso di capire
quale combinazione può fornire la sensibilità e la specificità più elevata.
Quali ricadute in ambito clinico
Le nuove indagini molecolari e la messa a punto di workflow diagnostici più accurati permettono di fornire una diagnosi certa nei casi sovrapponibili
tra più patologie, in modo da stabilire le indicazioni appropriate per la splenectomia al fine di evitare di eseguire tale operazione in pazienti con DHSt,
nei quali, si assiste ad un peggioramento grave dell’andamento clinico della patologia.
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Achille Iolascon, CEINGE - Biotecnologie Avanzate, via Gaetano Salvatore, 486, 80145 Napoli.
Tel.: +39 081 3737898. Fax: +39 081 3737804. E-mail: [email protected]
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