Immunofissazione & Immunosottrazione A. Martella 1 L’identificazione di una componente monoclonale contribuisce alla diagnosi, prognosi e terapia della malattia 2 Quadri clinici delle gammapatie monoclonali. Forme clinicamente occulte (asintomatiche o presintomatiche) Gammapatie monoclonali di incerto significato (MGUS) Gammapatie monoclonali “benigne” : associate a infiammazioni croniche e processi infettivi (ad es. osteomieliti, tubercolosi, infezioni biliari croniche, pielonefriti, artrite reumatoide etc); associate a dismielopoiesi e leucemie; associate a Sarcoma di Kaposi e AIDS; associate a neoplasie epiteliali, particolarmente tumori intestinali, del tratto biliare e della mammella; associate a polineuropatie idiopatiche; associate a lipodistrofie, particolarmente alla malattia di Gaucher, alla ipercolesterolemia familiare e xantomatosi. Manca la cirrosi?…..(ndr) Riv Med Lab - JLM, Vol. 2, S.1, 2001 3 Quadri clinici delle gammapatie monoclonali. Forme clinicamente occulte (asintomatiche o presintomatiche) Gammapatie monoclonali transitorie : associate con trattamento con farmaci, idantoina e sulfonamidi, immunosoppressori; associate ad infezioni virali; associate a cardiochirurgia (protesi valvolari); alcuni casi di malattia da catene pesanti α; da trasferimento placentare in neonati. Riv Med Lab - JLM, Vol. 2, S.1, 2001 4 Quadri clinici delle gammapatie monoclonali. Forme clinicamente manifeste dovute alla proliferazione del clone neoplastico Mieloma multiplo e sue varianti: - "smoldering" mieloma e mieloma indolente - mieloma non secernente - mieloma osteosclerotico - mieloma micromolecolare - IgM-mieloma Altre discrasie plasmacellulari: - leucemia plasmacellulare - plasmocitoma solitario midollare ed extramidollare Malattie linfoproliferative: - macroglobulinemia di Waldenström - malattie delle catene pesanti di tipo α, γ e µ - linfoma non-Hodgkin, leucemia linfatica cronica biochimica clinica, 2008, vol. 32, n. 6 5 Malattie con patogenesi dovuta alla presenza di una componente monoclonale Crioglobulinemia di tipo I e II Malattia cronica da crioagglutinine Malattie da deposizione di immunoglobuline monoclonali: Amiloidosi AL Malattia da deposizione di catene leggere Malattia da deposizione di catene leggere e pesanti Sindrome di Fanconi acquisita dell'adulto Sindrome da alterata permeabilità capillare sistemica Scleromixedema o lichen myxedematosus Sindrome da iperviscosità Polineuropatie Sindrome POEMS (Polyneuropathy, Organomegaly, Endocrinopathy, Monoclonal protein, Skin changes biochimica clinica, 2008, vol. 32, n. 6 6 La progressione della malattia I principali fattori di rischio per la progressione verso una condizione maligna sono tre: una CM ≥15 g/L, una CM montante una catena pesante diversa dalla IgG e un rapporto κ/λ delle catene leggere libere nel siero (κ/λ-R) alterato. L’identificazione precoce e la tipizzazione di una MGUS è quindi di estrema importanza clinica per stratificare il rischio di evoluzione verso il mieloma. E’ stato dimostrato che pazienti con CM >25 g/L rispetto a quelli con CM <5 g/L, a 20 anni dalla diagnosi di MGUS, hanno un rischio di progressione 4,6 volte maggiore. Bari: Gammopatie Monoclonali e Catene Leggere Libere Arialdo Vernocchi - Servizio di Medicina di Laboratorio IRCCS multiMedica – Milano – 7 Immunofissazione (IFE) 8 Immunofissazione (IFE) E’ tuttora ritenuta la tecnica più sensibile per la identificazione delle componenti M sieriche ed urinarie. …..È inoltre in grado di mettere in evidenza anche CM non rilevabili dal tracciato S-EF, perché di lieve entità o comigranti con altre proteine presenti fisiologicamente; questa capacità è maggiormente attribuibile all’immunofissazione, essendo questa una tecnica dotata di sensibilità più elevata rispetto alla immunosottrazione….. Da “Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali” biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 1 9 L’importanza di definire le piccole componenti monoclonali Una CM, di solito IgA Lambda, di piccole dimensioni, che spesso richiede l’immunofissazione del siero per la sua identificazione, può associarsi ad una sindrome complessa definita dall’acronimo POEMS (“polyneuropathy, organomegaly, endocrinopathy, M-protein, skin changes”). Questa sindrome non è di facile diagnosi ed è spesso l’identificazione della CM a indirizzare il clinico verso la diagnosi corretta. La disponibilità di trattamenti efficaci in grado di prevenire la progressione della neuropatia verso forme invalidanti rende ancora più importante l’aspetto diagnostico. G.Merlini - Biochimica Clinica, 2012, vol. 36, n. 1 25 10 Immunofissazione (IFE): sintesi Sfrutta la combinazione tra elettroforesi proteica su agarosio con successiva reazione delle proteine separate con anticorpi monospecifici. Campioni di siero vengono seminati in più solchi lineari su supporti di agarosio e sottoposti ad elettroforesi. Per ogni solco viene seminato un antisiero specifico per le catene pesanti e leggere (γ,α,µ, κ,λ) + 1 corsa normale Quando l’antisiero incontra l’antigene specifico determina un immunoprecipitato che rimane nel supporto di gel dopo lavaggio effettuato per allontanare le proteine non precipitate. Una opportuna colorazione metterà in evidenza l’eventuale componente M Analoga procedura potrà essere effettuata anche su campioni di urine per determinare la presenza di catene k o λ monoclonali 11 Esempi scolastici di IFE 3) CM: IgA-k 4) CM: IgM-λ 1) Cp normale 2) CM: IgG-λ + c.l. tipo λ 12 IFE: interpretazione La CM evidenziata in elettroforesi è identificata dall’antisiero anti-cat. pesante e/o anti-k o λ è importante l’allineamento perfetto della CM nelle varie corse simultanee del campione (linea rossa tratteggiata). Nel cp n° 2 non è perfetto (artefatto, difetto della corsa?) 13 IFE: il referto Rif. Campione n° 2 (descrizione) Componenti monoclonali evidenziate: catene pesanti gamma e catene leggere lambda, (deduzione) identificabili in anticorpi completi IgG-λ + una quota di catene leggere λ. (commento) Si consiglia IFE anti-D, anti-E e anti-C.L.L. Allegati: dosaggio Ig, k- λ, tracciato ef., stampato IFE con indicazione della CM 14 IFE: Il metodo 1) Diluizione del campione Ogni sistema ha una diluizione prefissata per la corsia elettroforetica e per le corsie dedicate alle catene pesanti e le catene leggere. Un eccesso di CM può richiedere una prediluizione consigliata dalla ditta o in base all’esperienza dell’operatore In caso di ipogammaglobulinemia la diluizione prefissata va ridotta In caso di forte attività reumatoide sono consigliate sol. particolari con betaMercaptoetanolo 15 IFE: una riflessione La sensibilità di IFE è definita superiore a quella dell’elettroforesi e di ISE* * : AAVV - Aspetti metodologici nella ricerca e caratterizzazione delle componenti monoclonali nel siero. Biochim Clin 2012;36 Nella nostra esperienza una piccola CM in presenza di notevoli quantità di Ig della stessa classe sono evidenziate alle EF capillare ma difficilmente all’ IFE. In tali casi si indica la necessità di continuare a monitorare la CM con EF capillare 16 IFE Un test per urine Molto interessante lo sviluppo di un kit per le CLLu che permette di identificare: proteine tubulari (β2 microglobulina, retinol Binding Protein (rBP) e α1 microglobulina), proteine glomerulari (albumina e α2 macroglobulina), Catene pesanti (gamma, alfa e mu (G, A e M), catene leggere Kappa e lambda (libere e legate) e, catene leggere libere Kappa e lambda. Si ottiene un quadro della funzionalità renale oltre all’identificazione della CM 17 Il protocollo diagnostico nelle diverse situazioni cliniche (da: “Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali” - biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 1) 18 Il protocollo diagnostico nelle diverse situazioni cliniche (da: “Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali” - biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 1) 19 Il protocollo diagnostico nelle diverse situazioni cliniche (da: “Il contributo della diagnostica proteica nella gestione delle gammopatie monoclonali” - biochimica clinica, 2014, vol. 38, n. 1) Attenzione, come ribadito nelle linee guida, l’IFE va eseguita durante il monitoraggio solo in caso di variazione qualitativa della morfologia del tracciato elettroforetico. Una elettroforesi di controllo identica alla precedente rende inutile la ripetizione dell’IFE. Il dosaggio delle Ig e delle CL può essere utile ad avallare questa decisione. 20 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgG-k (predil. 1:3) 21 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgA-k (non evidente in IFE il doppio picco) 22 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgA-λ (predil. 1:3) 23 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgM-k (siero indiluito) 24 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgA-λ (doppio picco in β1 – β2 per diverso stato di aggregazione) 25 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: CL λ (predil. 1:3. In parte IgA-λ) λtot : 396 mg/dl (v. diap. seguente) 26 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto D E CM: CLL λ (caso precedente con antisieri anti –D –E –CLL k & λ) 27 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto Modesta ipergamma con tendenza a picco (spesso IgG-k) non evidenziabile con IFE 28 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto Cirrosi: la El. capillare evidenzia la tendenza al “clone” (gener. IgG-k). Nessuna evidenza ad IFE. 29 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: CLL-λ (M. micromolecolare) caso negativo per anti-D ed Anti-E, pos. con antiCLL-λ. λ-siero : 260 mg/dl 30 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: CLL-λ (caso precedente su urine) identificate da entrambi anti-λ totali e libere. λ-urine : 4310 mg/dl 31 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgD-λ (precedenti tests negativi per G, A, M, k-F, λ-F) 32 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto Doppio Clone: IgG-λ ed IgA-λ (notare che le IgA sono “mimetizzate” in zona β) 33 Archivio IFE dell’Ospedale Civile di Taranto Interferenza da attività reumatoide: RF 41100 IU/ml Caso risolto con l’immunosottrazione (ISE) 34 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto Caso preced. CM: IgM-k Test ISE La CM reagisce con anti-M ed anti-k, e migra in zona prealbumina, facendo “scomparire” il picco 35 IMMUNOSOTTRAZIONE (ISE) 36 Immunosottrazione (ISE) Definizione La tecnica ISE è caratterizzata da una fase preliminare di immunoprecipitazione mediante l'impiego di specifici antisieri anti-catene pesanti e anti-catene leggere seguita da separazione elettroforetica del surnatante del campione pretrattato. Il profilo elettroforetico del siero ottenuto dopo l'immunoprecipitazione è confrontato con quello del campione non trattato permettendo in tal modo di identificare la CM per differenza. (Aguzzi F, Poggi N. "Immunosubtraction" electrophoresis: a simple method for identifying specific proteins producing the cellulose acetate electrophoretogram. Boll Ist Sieroter Milan 1977;56:212-6.) Notate la data! L’esperimento viene effettuato su acetato di cellulosa 37 Immunosottrazione (ISE) Il brevetto Numero di pubblicazione Tipo di pubblicazione Numero domanda Data di pubblicazione Data di registrazione Data di priorità Stato tariffa Pubblicato anche come Inventori US5567282 A Concessione US 08/186,347 22 ott 1996 25 gen 1994 25 gen 1994 Pagato DE69516048D1, Altri 5 » Hann-Ping Wang, Cheng-Ming Liu Assegnatario originale Esporta citazione Wang; Hann-Ping, Liu; Cheng-Ming BiBTeX, EndNote, RefMan 38 Immunosottrazione (ISE) Il sistema attualmente più diffuso è l’ISE su elettroforesi capillare (CZE) Si definisce come una tecnica di separazione elettrocinetica effettuata in un capillare di diametro interno inferiore a 100 µm riempito con un tampone composto da elettroliti. Per molti aspetti, questa metodologia può essere considerata intermedia tra l'elettroforesi zonale classica su supporto solido e la cromatografia in fase liquida. Il sistema CAPILLARYS usa il principio dell'elettroforesi capillare in fase libera, che rappresenta la forma più comune di elettroforesi capillare. Con questa tecnica le molecole cariche sono separate secondo la loro mobilità elettroforetica in un tampone alcalino a pH specifico. La separazione avviene in funzione del pH dell'elettrolita e del flusso elettro endo-osmotico. 39 Immunosottrazione (ISE) I reagenti una soluzione di base (soluzione ELP, fissativo), immunoglobuline totali di mammifero anti-catene pesanti gamma immunoglobuline totali di mammifero anti-catene pesanti alfa immunoglobuline totali di mammifero anti-catene pesanti mu, immunoglobuline totali di mammifero anti-catene leggere kappa libere e legate immunoglobuline totali di mammifero anti-catene leggere lambda libere e legate un diluente specifico per la diluizione dei sieri e delle urine dializzate, contenente un marcatore che permette una sovrapposizione ottimale dei profili 40 Immunosottrazione (ISE) L'immunotipizzazione viene effettuata in 4 fasi 1. Diluizione del siero o dell'urina in un diluente specifico contenuto. La diluizione viene adattata alla concentrazione delle immunoglobuline del campione. 2. Il campione diluito viene mescolato con i diversi antisieri. Il complesso antigene anticorpo si forma rapidamente in fase liquida e non richiede un tempo di incubazione o di sedimentazione. 41 Immunosottrazione (ISE) L'immunotipizzazione viene effettuata in 4 fasi 3. Iniezione dei campioni trattati per aspirazione in 6 capillari dall'estremità anodica, seguita dalla separazione elettroforetica delle proteine in tampone alcalino effettuata applicando una differenza di potenziale di diverse migliaia di Volt alle estremità dei capillari. La rilevazione diretta delle proteine viene effettuata a 200 nm, sul lato catodico. 4. Sovrapposizione del profilo di riferimento (ELP) e dei profili degli antisieri (Ig G, Ig A, Ig M, Kappa e Lambda) che permette di caratterizzare la componente monoclonale. 42 Immunosottrazione (ISE) Una gammapatia (presenza di un'immunoglobulina monoclonale) è caratterizzata dalla scomparsa di un picco in presenza di uno degli antisieri anti-catene pesanti (gamma, alfa o mu) e in presenza di uno degli antisieri anti-catene leggere (kappa o lambda). La frazione monoclonale messa in evidenza deve trovarsi allo stesso livello di migrazione della banda rilevata sul profilo di riferimento (ELP). 43 Immunosottrazione (ISE) Rif. ES.: IgG-k I grafici ottenuti dopo un ISE: il 1° è l’elettroforesi di riferimento 44 Immunosottrazione (ISE) Dove finisce l’immunocomplesso fra immunoglobuline del campione (urine o siero) immunoglobuline dell'antisiero specifico ? Il complesso appare in posizione molto anodica (zona inter alfa-1/albumina o in posizione più anodica rispetto all'albumina). 45 Immunosottrazione (ISE) La stessa interpretazione si applica in presenza di diverse proteine monoclonali. Questi casi più rari corrispondono alla proliferazione di diversi cloni di cellule B. Una gammapatia biclonale viene rilevata dalla presenza di due catene pesanti (identiche o differenti) e due catene leggere (identiche o differenti), quindi dalla scomparsa di due picchi con uno degli antisieri anti-catene pesanti (identici o differenti) e con uno degli antisieri anti-catene leggere (identici o differenti). 46 Vantaggi e limiti dell’ISE Vantaggio: Automazione completa, nessuna manualità critica come in IFE Limite: qualche difficoltà a valutare il perfetto allineamento dei picchi identificati, per valutare la presenza di CM complete e/o loro frazioni (es: CLL). Auspicabile un software che permetta di manipolare le zone di sottrazione (allineandole) per verificare che si tratti della medesima CM. 47 Interferenze dell’ISE In caso di ipergamma o grosse CM, il complesso formato con gli antisieri appare sotto forma di un picco largo ed abbondante tra la frazione albumina e alfa-1 ; la scomparsa del picco monoclonale può essere incompleta sui profili degli antisieri. Campioni contenenti una o più proteine monoclonali polimerizzate : in questo caso il complesso formato con gli antisieri può apparire sotto forma di un picco largo e abbondante tra le frazioni albumina e beta-1. 48 Interferenze dell’ISE Proteine monoclonali che migrano nelle zone beta-1 o beta-2: in caso di assenza della proteina monoclonale evidente in CZE, selezionare il tipo di diluizione adatta alla concentrazione delle immunoglobuline del campione. Numerosi lavori scientifici hanno dimostrato che la reazione antigene-anticorpo in fase liquida avviene in maniera diversa della reazione su gel. Può succedere che certi antisieri diano delle reazioni crociate con alcune CM presenti nel campione, dando un profilo di falsa biclonalità: procedere ad IFE. 49 Interferenze e limiti dell’ISE E' possibile ottenere dei leggeri sfasamenti nella sovrapposizione tra il profilo di riferimento e i profili degli antisieri (in particolare nella zona beta-1). Attenzione: questi non devono essere confusi con la scomparsa di un picco monoclonale su uno o più profili degli antisieri specifici. Si tratta di un fenomeno molto raro 50 La letteratura sull’ISE “Sebbene l'ISE sia eseguita in completa automazione, mostrando quindi una cadenza analitica più elevata rispetto all'IFE (>manualità), potrebbe mostrare limiti di rilevazione analitica per la sua intrinseca caratteristica di sottrarre proteine alla lettura, anziché aggiungerne come avviene nell'IFE.” “E' stato dimostrato che l'ISE eseguita su CZE confrontata con l'IFE in AGE mostra una sensibilità accettabile solo per CM >5 g/L, mentre per CM con concentrazioni comprese tra 1 e 5 g/L mostra una percentuale di falsi negativi intorno al 15%, che sale al 35% per CM ancora più piccole” Bienvenu J, Graziani MS, Arpin F, et al. Multicenter evaluation of the Paragon CZE 2000 capillary zone electrophoresis system for serum protein electrophoresis and monoclonal component typing. Clin Chem 1998; 44: 599-605 51 La letteratura sull’ISE “Tuttavia, dai dati della nostra valutazione questa minore sensibilità del metodo ISE/CZE nei campioni con CM compresa tra 1 e 5 g/L non era evidenziabile.” Ilenia Infusino, Alberto Dolci, Mauro Panteghini Confronto tra due sistemi per elettroforesi capillare e in gel d'agarosio per la ricerca e caratterizzazione di componenti monoclonali nel siero. Biochimica Clinica, 2008, vol. 32, n. 6 “Sono tuttavia state descritte CM rilevate in ISE ma non in IFE, specialmente in zona β-globulinica, che possono arrivare fino al 3% dei casi studiati.” Katzmann JA, Clark R, Sanders E, et al. -Prospective study of serum protein capillary zone electrophoresis and immunotyping of monoclonal proteins by immunosubtraction. Am J Clin Pathol 1998,110:503-9. 52 La letteratura sull’ISE Si dimostra che i Sistemi di elettroforesi capillare Beckman Paragon 2000 (Beckman, Brea, CA) [1,2] e Sebia Capillarys (Sebia, Norcross, GA) [3] hanno prestazioni affidabili per l'identificazione e la quantificazione di C.M. in alternativa ad AGE e IFE. 1. 2. 3. Bossuyt X, Bogaerts A, Schiettekatte G, et al. Detection and classification of paraproteins by capillary immunofixation/subtraction. Clin Chem. 1998;44:760764. Henskens Y, de Winter J, Pekelharing M, et al. Detection and identification of monoclonal gammopathies by capillary electrophoresis. Clin Chem. 1998;44:1184-1190. Gay-Bellile C, Bengoufa D, Houze P, et al. Automated multicapillary electrophoresis for analysis of human serum proteins. Clin Chem. 2003;49:1909-1915. 53 La letteratura sull’ISE Tuttavia, alcuni rapporti indicano che CZE può essere più sensibile ma meno specifico rispetto AGE a rilevare C.M. (1,2) 1. 2. Bossuyt X, Lissoir B, Marien G, et al. Automated serum protein electrophoresis by Capillarys. Clin Chem Lab Med. 2003;41:704-710. Litwin CM, Anderson SK, Philipps G, et al. Comparison of capillary zone and immunosubtraction with agarose gel and immunofixation electrophoresis for detecting and identifying monoclonal gammopathies. Am J Clin Pathol. 1999;112:411-417. 54 La letteratura sull’ISE Pubblicazione di contrastanti risultati e mancata individuazione di alcune C.M. (1,2) 1. 2. Bossuyt X. Separation of serum proteins by automated capillary zone electrophoresis. Clin Chem Lab Med. 2003;41:762-772. Wuyts B, Bossuyt X, Verhoef G, et al. Conflicting results between electrophoresis methods of serum Mproteins. Electrophoresis. 2004;25:1548-1550. 55 La letteratura sull’ISE Un lavoro fondamentale sulla valutazione delle prestazioni del sistema CAPILLARYS 2 rispetto al sistema HYDRASYS (Sebia) per la identificazione e tipizzazione delle componenti monoclonali: Performance of the Sebia CAPILLARYS 2 for Detection and Immunotyping of Serum Monoclonal Paraproteins Zhaohai Yang, MD, PhD, Keith Harrison, MD, Yara A. Park, MD, Carolyn H. Chaffin, Beatrice Thigpen, Pattye L. Easley, John A. Smith, MD, PhD, C. Andrew Robinson, PhD, Robin G. Lorenz, MD, PhD, and Robert W. Hardy, PhD - Department of Pathology, University of Alabama at Birmingham Am J Clin Pathol 2007;128:293-299 56 La letteratura sull’ISE da “Performance of the Sebia CAPILLARYS 2 for…..” 9 CM non segnalate da CZE, identificate da IFE. Nessuna CM identificata da CZE e non da IFE. Le relative % sono in parentesi. 57 La letteratura sull’ISE da “Performance of the Sebia CAPILLARYS 2 for…..” Differente identificazione della CM fra IFE ed ISE •La quantificazione è ottenuta su elettroforesi in agarosio •MM = mieloma multiplo 58 La letteratura sull’ISE da “Performance of the Sebia CAPILLARYS 2 for…..” Conclusioni La percentuale di accordo nella identificazione della CM tra ISE ed IFE è 86%. L’ISE non ha identificato alcuni CM-IgM e CM-catene leggere libere , soprattutto se presenti in basse concentrazioni. Ciò potrebbe indicare che IFE è più sensibile di ISE per la rilevazione di tali paraproteine . 59 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto L’immunosottrazione in elettroforesi capillare è stata introdotta nel lab. dell’Ospedale Civile di Taranto dai dr. F. Gugliotta e C. Vagali. Si è rivelata estremamente utile per confermare la presenza di CM sospette in aree inconsuete del tracciato (α2 – β1 - β 2). Tali CM vengono successivamente confermate con IFE. 60 Come si presenta un tracciato ISE Nelle successive la sottrazione è evidenziata come area bianca: è un artificio 61 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto Stesso caso precedente CM: IgG-λ 62 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: doppia IgG-k 63 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgA-λ in zona preβ 64 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto IgA-λ ad aspetto policlonale Non definirlo C.M. ma inviare ad IFE ed ulteriori accertamenti 65 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: doppia IgA-k (l’anti-k non riesce a complessare tutta la quota di CM: aumentare la dil. siero) 66 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgA-k, picco interβ 67 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto CM: IgM-k in zona β2 68 Archivio ISE dell’Ospedale Civile di Taranto Insuff. renale cronica : nessuna sottrazione (tanto per complicarvi la vita) 69 Per compilare un referto corretto occorrono 1. 2. 3. Conoscenza delle linee guida L’esperienza Il ragionamento 70 Le relazioni di questo convegno sono liberamente scaricabili da: www.sjdiem.it Sez. attività scientifica e-mail: [email protected] 71