Pathfinder® Chlamydia Culture
Confirmation System
30701
For the identification of Chlamydia in cell culture by
direct fluorescence.
rR
Fo
0197
ren
efe
For in vitro diagnostic use
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/
Léxico/Leksikon/Ordlista ................................................................... page 3
ce
English ............................................................................................... page 5
Français ........................................................................................... page 15
Us
Español............................................................................................ page 27
eO
Deutsch ........................................................................................... page 39
Italiano ............................................................................................. page 51
Português ........................................................................................ page 63
nly
Dansk............................................................................................... page 75
Svenska ........................................................................................... page 86
References/Bibliographie/Referencias/Literatur/
Bibliografia/Bibliografia/Referencer/Referenser .............................. page 97
FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in
place of package inserts provided with each test
kit.
ce
ren
efe
rR
Fo
nly
eO
Us
Code du lot
Manufacturer Fabricant
nly
Batch code
Fabricante
Código de
lote
eO
Us
Para uso
diagnóstico
in vitro
Dispositif
médical de
diagnostic in
vitro
Verwendbar bis
For In Vitro
Diagnostic
Use
Deutsch
Utiliser avant Fecha de
le
caducidad
Español
Use by
Français
Conformité
ConformiCE-Konforaux normes dad europea mitätskeneuropéennes
nzeichnung
European
Conformity
English
Hersteller
Chargenbezeichnung
In-vitroDiagnostikum
Fabbricante
Fabricante
Codice del Código do
lotto
lote
Per uso
Para utilizadiagnosção no diagtico in vitro nóstico in
vitro
Utilizar até
Partinummer
Producent Tillverkare
Lotnummer
MedFör in vitroicinsk
diagnostik
udstyr til
in vitrodiagnostik
Holdbar til Använd
före
Svenska
Utilizzare
entro il
Dansk
Europæis Europeisk
k overens- överensstemstämmelse
melse
Português
ConforConformimità euro- dade com
pea
as normas
europeias
Italiano
Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/Léxico/Leksikon/Ordlista
ce
ren
efe
rR
Fo
Limiti di
temperatura
Xn. Nocivo Xn. Nocivo
Zulässiger
Temperaturbereich
Xn.
Gesundheitsschädlich
Bevollmächtigter
in der
Europäischen Union
Límites de
temperatura
Xn. Nocivo
Representante autorizado en la
Comunidad
Europea
Limites de
température
Xn. Nocif
Représentant agréé
dans la Communauté
Européenne
Anticorps
monoclonal
Temperature
Limitation
Xn. Harmful
Authorized
Representative in the
European
Community
Monoclonal
Antibody
Anticuerpo
monoclonal
Monoklonaler Antikörper
Anticorpo
monoclonale
Mandatario
autorizzato per
l'Unione
Europea
Português
Dansk
Svenska
Consulte as Se brugSe brukinstruções
sanvisning sanvisninde utilização
gen
Italiano
Consultare le
istruzioni
per l'uso
Deutsch
Español
Gebrauchsanweisung
beachten
Français
Consulter les Consulte las
instructions
instrucd’utilisation
ciones de
uso
English
nly
eO
Us
Consult
Instructions
for Use
ce
ren
efe
rR
Anticorpo
Monoclonal
Representante autorizado na
Comunidade
Europeia
Auktoriserad representant i
Europeiska
gemenskap
en
MonokMonoklonalt anti- lonal antikstof
ropp
Repræsen
tant i det
Europæis
ke Fællesskab
Xn. Sund- Xn. Hälsoshedsskad kadligt
elig
Limite de
TemperTempertemperatura aturbeaturbegrängrænsning sning
Fo
INTENDED USE
The Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Assay is a direct fluorescent procedure for the identification of chlamydia in cell culture.
SUMMARY AND EXPLANATION
rR
Fo
Chlamydia organisms are the suspected causative agents in a wide variety
of health problems. Two species of Chlamydia have been identified:
Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci. Chlamydia psittaci mainly
infects birds, however humans can develop diseases such as pneumonia
or a generalized systemic infection due to exposure to infected species.
Chlamydia trachomatis generally infects only humans. The clinical syndromes most often associated with Chlamydia trachomatis include inclusion conjunctivitis; trachoma; urethritis, cervicitis and other urogenital
disorders; and lymphogranuloma venereum (LGV) (1). Transmission of
Chlamydia trachomatis may occur via sexual contact with an infected person, passage of a fetus through an infected birth canal, or as in the case of
trachoma in developing countries, primarily through non-sexual personto-person contact (2).
ce
ren
efe
Chlamydia trachomatis is currently recognized as the leading cause of
sexually transmitted disease. Unfortunately many infected individuals
remain asymptomatic allowing the organism to go undetected (3). In
women, undiagnosed genital infections may lead to permanent reproductive damage due to complications such as salpingitis or pelvic inflammatory disease (4,5). Chlamydia trachomatis is also the causative agent of
trachoma, the world’s leading cause of preventable blindness (6). Early
diagnosis of these chlamydial infections can lead to timely treatment of
the disease, thereby reducing the possibility of complications and the risk
of further transmission.
Us
nly
eO
Early methods of chlamydia isolation included growth in mice or chick
embryo yolk sacs. As tissue culture methods improved, they replaced
these more cumbersome techniques (7,8). The use of immunofluorescence and monoclonal antibody technology to detect organisms in tissue
culture has further increased the sensitivity of chlamydia culture and
reduced the need to perform passage on all specimens (9).
The Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System uses a fluorescein-conjugated monoclonal antibody to identify chlamydial inclusions in
inoculated cell cultures. This assay combines the specificity and reproducibility of monoclonal antibodies with the speed and simplicity of a direct
fluorescent test. For the detection of chlamydial organisms in culture, this
test offers a simple, sensitive alternative to other culture stains.
PRINCIPLES OF THE PROCEDURE
This test uses a fluorescein-conjugated monoclonal antibody to identify
chlamydia in culture. The antibody reacts with the lipopolysaccharide portion of the elementary bodies and reticulate bodies within the inclusion.
5
This assay will detect all known serovars of Chlamydia trachomatis,
Chlamydia psittaci, and Chlamydia pneumoniae. It will not differentiate
between species or serovars.
The monoclonal antibody reacts with chlamydial antigens, if present, in the
cell culture. A washing step removes unbound antibody. When viewed
under the fluorescent microscope, cell culture specimens infected with
chlamydia show a characteristic apple-green fluorescence of inclusions
against a red counterstained background.
KIT REAGENT
For In Vitro Diagnostic Use.
•
Store the Antibody at 2-8ºC.
•
The Monoclonal Antibody is stable to the expiration date stated on the
label, when stored as recommended.
•
Once open, the Monoclonal Antibody is stable to the expiration stated
on the label, when stored as recommended.
rR
Fo
•
ren
efe
1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody
The vial contains 4.2 mL of fluorescein-conjugated murine monoclonal
antibody to chlamydia (genus-specific) with a protein stabilizer, Evans'
blue counterstain, and 0.1% sodium azide. The liquid antibody is at the
working dilution. Diluting the antibody will reduce the sensitivity of the
test.
Increased green background on control specimens.
Change in expected reactivity with positive and negative controls.
Us
•
•
ce
Signs of possible deterioration are:
eO
WARNINGS AND PRECAUTIONS
For Professional Use Only
nly
Reagents Containing Sodium Azide
The reagent contains 0.1% sodium azide. Sodium azide may react with
lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal of liquids, flush with a large volume of water to prevent azide buildup. For further information, please refer to the Manual Guide issued by the
Centers for Disease Control (10).
Xn. Harmful
R: 21/22
Harmful in contact with skin and if swallowed.
S: 24/25-28-36/37/39
Avoid contact with skin and eyes. After contact with skin,
wash immediately with plenty of water. Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection.
6
Patient Specimens
When collecting and processing patient specimens, handle them as
potentially infectious according to universal precautions and good clinical
laboratory practices, regardless of their origin, treatment, or prior certification. Use an appropriate disinfectant for decontamination. Store and dispose of these materials and their containers in accordance with local
regulations and guidelines.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Specimen collection is a critical step in the detection of chlamydia (11).
Personnel collecting chlamydia specimens should be well-trained to minimize the possibility of inadequate specimens. A recommended procedure
for collecting cervical and male urethral specimens follows.
efe
rR
Fo
CAUTION: Follow routine biosafety procedures when collecting and processing specimens for chlamydia testing. Consider specimens and all
materials they contact as potentially infectious, and dispose of them in an
appropriate manner. Do not pipette by mouth. Avoid generation of aerosols. See Reference 12 for more information on the prevention of laboratory infections.
ren
Specimen Collection (cervical and male urethral specimens)
Materials Required
1. Large swab to clean exocervix of female prior to endocervical sampling.
ce
2. Sterile Swabs
Use swabs which do not inhibit the growth of chlamydia or cells in
culture.
Us
eO
3. Transport Medium
Use transport medium which does not inhibit the growth of chlamydia
or cells in culture.
nly
Procedure for Collection of Specimens
1. Urethral Specimens
NOTE: For an accurate diagnosis, the specimen must contain epithelial cells from the lining of the urethra. These cells are the most
susceptible to infection by chlamydia. (The exudate is not an
appropriate specimen for laboratory testing of chlamydia.) (13)
Instruct the patient to refrain from urinating for 1 hour prior to
sampling.
a. Insert small swab 2-4 cm into the urethra. (Rotate swab slightly to
aid in insertion.)
b. Gently rotate swab using enough pressure to obtain epithelial cells.
c. Allow swab to remain inserted for 1-2 seconds.
d. Withdraw swab, immediately place into transport medium and send
to the laboratory. Store specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For
longer storage, freeze at -70ºC until inoculated into culture.
7
2. Cervical Specimens
NOTE: The columnar epithelial cells of the cervical mucosa are
most susceptible to infection by the chlamydia (13). These columnar epithelial cells are located just inside the cervical opening.
In some cases, the location of the transitional zone, where the
stratified epithelium ends and the columnar epithelium begins,
may vary (14). Adhering to the following procedure will ensure that
specimens are adequate and appropriate.
efe
rR
Fo
a. Use a large swab to remove excess mucus and exudate from the
exocervix. Dispose of swab.
b. Insert sterile swab into endocervical canal about 1 to 1-1/2 cm until
most of the tip is inside the cervical opening.
c. Rotate swab for 5-10 seconds using enough pressure to obtain
cells from all surfaces of the endocervical canal.
d. Withdraw swab avoiding contact with vaginal surfaces. Immediately place into transport medium and send to the laboratory. Store
specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For longer storage freeze at
-70ºC until inoculated into cell culture.
ren
Processing of Cell Culture Specimens
Materials Required
1. Cell culture line:
Use a cell culture line susceptible to chlamydia - e.g.: McCoy cells.
ce
NOTE: The choice and condition of the cell culture line can influence the sensitivity of chlamydia detection by the culture confirmation technique.
Us
2. Cell culture controls:
Negative Control - cell culture inoculated with transport medium.
Positive Control - cell culture inoculated with a sample known to be
positive for chlamydia.
eO
•
•
•
nly
3. Other supplies and equipment for cell culture:
Culture media, culture vials or microtiter plates, centrifuge, CO2
incubator, etc.
Cell Culture Procedure
1. Following an established method, inoculate specimen onto appropriate
cell monolayer.
2. Incubate monolayer for 48 hours.
3. If desired, pass monolayer and incubate for an additional 48 hours.
8
ASSAY PROCEDURE
Materials Provided
1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody
Materials Required, But Not Provided
1. Methanol fixative - Histological grade or ACS
2. Deionized water
3. Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad Cat. No. 30693
4. Microtiter plate cover and coverslips (5 mm round), or clean glass
microscope slides, and forceps (depending on culture technique)
5. Sterile pipets
6. Humidified chamber
Fo
efe
rR
7. Fluorescent microscope - To view specimens stained with fluorescein
isothiocyanate, use a filter system which provides an excitation wavelength of 480-490 nm and an emission wavelength of 510 nm or
greater. The type and condition of microscope filters and light source
can affect the intensity of the fluorescent reaction.
ren
Procedure for Fluorescent Staining of Cell Culture
A. Microtiter Plate Technique
1. Fixing the cell monolayer
a. Carefully aspirate culture medium from each well.
ce
b. Add enough methanol to cover the monolayer in each well.
Allow to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC).
eO
Us
c. Aspirate the liquid from each well with a pipet, or invert and blot
the plate onto an absorbent paper to remove the methanol.
Stain immediately.
If staining is not performed immediately, store the plates at
-70ºC.
nly
2. Staining the cell monolayer
NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water before
staining. (Invert the plate and blot to remove excess liquid.)
a. Add 1 drop (approximately 30 µL) of the Chlamydia Culture
Confirmation Monoclonal Antibody to each well. The antibody
must completely cover the monolayer.
b. Cover the plate and incubate at room temperature (23ºC ± 3ºC)
for 30 minutes. Protect the plate from intense light during incubation.
c. Uncover the plate and remove Chlamydia Culture Confirmation
Monoclonal Antibody from each well by aspirating the liquid
with a pipet, or by inverting and blotting the plate onto an absorbent paper. Rinse with deionized water to remove residual anti9
body. Invert and blot plate onto absorbent paper to remove
excess water.
d. Add 1 drop of mounting medium to each well and apply coverslips.
NOTE: Use only Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad
Cat. No. 30693
3. Invert the microtiter plate and examine the wells through a fluorescent microscope with a long focal length objective. Look at entire
monolayer using a minimum magnification of 100X. If inclusion
appears questionable, confirm at a higher magnification.
If necessary, store the microtiter plates in the dark at 4ºC and read
them within 24 hours.
Fo
B. Shell Vial Technique
1. Fixing the cell monolayer
rR
a. Carefully aspirate culture medium from each vial.
efe
b. Add enough methanol to cover the monolayer in each vial. Allow
to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC).
c. Remove methanol by aspirating with a pipet.
ren
If staining is not performed immediately, store the vials at -70ºC.
2. Staining the cell monolayer
ce
Us
a. Using forceps, carefully remove the coverslip with the monolayer from the vial and place on an appropriately labeled, clean
glass slide with the cells facing up. Stain immediately.
eO
NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water. (Remove
excess liquid.)
nly
b. Add 1 drop (approximately 30 µL) of the Pathfinder® Chlamydia
Culture Confirmation Monoclonal Antibody to the monolayer.
The antibody must completely cover the monolayer.
c. Incubate in a humidified chamber at room temperature
(23ºC ± 3ºC) for 30 minutes. Protect the coverslips from intense
light during incubation.
d. Rinse coverslip with deionized water to remove residual antibody. (Blot excess water.)
e. Place one drop of mounting medium on another appropriately
labeled, clean glass slide. Apply the coverslip carefully to avoid
trapping air bubbles, with the monolayer of cells facing down.
10
3. Examine the slides through a fluorescent microscope. Scan entire
monolayer using a minimum total magnification of 100X. If inclusions look questionable, confirm at a higher magnification.
If necessary, store the slides in the dark at 4ºC and read them within
24 hours.
NOTE: Use only Pathfinder® Mounting Medium - Bio-Rad Cat.
No. 30693
QUALITY CONTROL
To verify the performance of the culture system, the fluorescent procedure,
and the microscope, include positive and negative cell culture controls
with each batch of patient cultures.
Fo
INTERPRETATION OF RESULTS
efe
rR
Read control specimens first. Cell culture controls aid in interpretation of
results by showing positive and negative reactions on the cell line used for
patient specimens. If controls exhibit proper reactivity, interpret patient
specimens. Repeat test if controls do not react properly. Descriptions of
positive and negative results follow.
ce
ren
Positive Results
A positive control or patient sample will exhibit characteristic fluorescence
of cytoplasmic inclusions which will be visible at 100X magnification. The
inclusion appears as a well-defined, apple-green, fluorescent mass,
located in the cytoplasm of the infected cell near the nucleus. The presence of one or more inclusions per culture is considered positive. Uninfected cells and the background of infected cells stain red due to
counterstain. Non-specific staining can be distinguished by a yellow, white
or dull-green color rather than the expected apple-green.
eO
Us
Negative Results
A negative sample will display no specific apple-green fluorescence. All
cells stain red due to counterstain. Non-specific staining is minimal.
nly
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
1. If antibody dries on the monolayer, visualization of the inclusion may be
difficult.
2. The performance of this test on patient specimens collected during
antimicrobial therapy is unknown.
3. For the detection of chlamydia, proper specimen collection is critical.
Personnel collecting specimens should be well trained to minimize
inadequate and inappropriate specimens.
4. Use of the Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody on
direct clinical specimens is not recommended. (Bio-Rad has a Chlamydia Direct Specimen Kit available - Cat. No. 30704.)
11
EXPECTED VALUES
Expected values may vary depending on the population tested. Bio-Rad
evaluated 402 specimens from patients in high and low risk populations
with the Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Test and the
MicroTrak™ Culture Confirmation Test. Any discrepancies remaining after
passage were resolved with Ortho Diagnostics' Chlamydia Cell Culture
Assay. The overall agreement between the tests was 99.5% on initial culture and 100.0% after passage. Only 1 specimen testing negative on initial
culture was positive after passage. When compared to the competitor
tests, both the sensitivity and specificity of this test after primary and passage culture were 100.0%. (See Specific Performance Characteristics
Section for details.)
SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Fo
efe
rR
Three independent laboratories evaluated the ability of the Pathfinder®
reagents to detect chlamydia in cell culture. The independent study sites
included laboratories in the East, South and West. Syva's MicroTrak™
Culture Confirmation Test was used as the reference method and Ortho
Diagnostics' kit was used to resolve any discrepancies after passage.
ce
ren
The investigators collected one endocervical or urethral swab from each
patient, and placed it into transport medium for inoculation into culture. Two
of the investigators inoculated 5 McCoy cell monolayers for each patient.
After incubating the cultures for 48 hours, they stained 2 of those monolayers, one with the Pathfinder® reagent and one with the MicroTrak™ reagent.
For those cultures with negative or discrepant results on the primary culture,
the remaining 3 cultures were disrupted and passed onto another 3 monolayers. After the next 48 hour incubation, the investigators again stained 2 of
these monolayers, one with the Pathfinder® reagent and the other with the
MicroTrak™ reagent. When necessary the remaining passage culture was
tested with Ortho's reagent to resolve any discrepancies. The third investigator inoculated 3 monolayers per patient and proceeded as above with the
exception that, when necessary, the remaining initial monolayer was disrupted and passed onto another 3 monolayers.
nly
eO
Us
Cultures with 1 or more inclusions present after primary incubation, or
after disruption and passage, were considered positive.
Investigators collected specimens from 2 populations - high risk and low
risk. The high risk population included males and females attending sexually transmitted disease clinics who presented with urogenital symptoms
or who were asymptomatic contacts of persons with a sexually transmitted disease. The overall prevalence of chlamydia in this population was
23.5%. The low risk population included females who were visiting clinics
for routine obstetric or gynecological exams, or who met the following criteria:
1) over the age of 25; 2) no sign of purulent cervical discharge, cervical
ectopy or cervical friability; and 3) no contact with a sexually transmitted
12
disease syndrome or pathogen. The overall prevalence of chlamydia in
this population was 10.0%
The performance characteristics of the Pathfinder® Culture Confirmation
Test compared to the competitor assays after primary and passage culture
are detailed in Table 1.
Table 1 - Comparison of Pathfinder® Culture Confirmation Test to Competitor
Assays after Primary and Passage Culture
High Risk
Population
n
Low Risk
Population
302
Sensitivity
TP
TP + FN
Specificity
TN
TN + FP
Positive
Predictive
Value
TP
TP + FP
100.0%
Negative
Predictive
Value
TN
TN + FN
100.0%
100.0%
Fo
100.0%
Cumlative
(High and Low
Risk Population)
100
402
100.0%
10
10
100.0%
81
81
231
231
100.0%
90
90
100.0%
321
321
71
71
100.0%
10
10
100.0%
81
81
231
231
100.0%
90
90
100.0%
321
321
ren
efe
rR
71
71
NOTE: TP = true positive, FP = false positive, FN = false negative, TN = true negative.
ce
Table 2 summarizes the data comparing the Pathfinder® Culture Confirmation Reagent to the MicroTrak™ Reagent after primary culture only.
n
TP
TP + FN
302
Cumlative
(High and Low
Risk Population)
100
100.0%
69
69
Specificity
TN
TN + FP
99.6%
232*
233
98.9%
Positive
Predictive
Value
TP
TP + FP
98.6%
69*
70
Negative
Predictive
Value
TN
TN + FN
100.0%
232
232
402
nly
Sensitivity
Low Risk
Population
eO
High Risk
Population
Us
Table 2 - Comparison of the Pathfinder® Culture Confirmation Reagent to the
MicroTrak™ Assay after Primary Culture Only
100.0%
78
78
90*
91
99.4%
322*
324
90.0%
9*
10
97.5%
78*
80
100.0%
90
90
100.0%
322
322
100.0%
9
9
* Two specimens positive on primary culture by the Pathfinder ® test and negative by the
MicroTrak™ test were positive by either the MicroTrak™ or Ortho method on passage.
When considering these specimens true positives, the specificity and positive predictive
value for the high risk, low risk, and cumulative populations become 100%.
13
The performance characteristics for the high risk male and female populations were comparable.
Table 3 details the numbers of positive results after primary culture and
after primary culture and passage. The Pathfinder® reagent detected 2.5%
more positive results on primary culture than the MicroTrak™ reagent. Use
of the Pathfinder® assay on a passage culture resulted in 1.2% more positive results than a primary culture alone.
Table 3 - Chlamydia Detection on Primary Culture and
After Primary Passage Culture
Primary Culture Passage Culture
®
80
81
Positives by MicroTrak™
78
80
Positives by Pathfinder
rR
Fo
CROSS-REACTIVITY
efe
Bio-Rad tested the organisms in Table 4 for possible cross-reactivity in the
Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation Assay. The organisms listed
were tested on fixed substrate slides and showed no cross-reactivity with
the Pathfinder® Monoclonal Antibody.
Herpes viruses
Reactivity with the
Chlamydia Culture
Confirmation Antibody
ce
Organism
ren
Table 4 - Cross-Reactivity Studies with Potential Cell Culture Contaminants
Us
Cytomegalovirus
Negative
Herpes simplex Type I
Negative
eO
Herpes simplex Type II
Negative
Varicella zoster Virus
Negative
Negative
nly
Acholeplasma laidlawii
Mycoplasma arginini
Negative
Mycoplasma hominis
Negative
Mycoplasma hyorhinis
Negative
Mycoplasma orale
Negative
Mycoplasma salivarium
Negative
14
Pathfinder® Chlamydia Système
de Confirmation sur Culture 30701
Pour l’identification de Chlamydia dans les cultures
cellulaires par fluorescence directe.
Fo
rR
DOMAINE D’APPLICATION
efe
Le Pathfinder® Chlamydia système de confirmation sur culture est un test
d’identification de Chlamydia dans les cultures cellulaires par fluorescence
directe.
ren
RESUME ET EXPLICATION
ce
Le Chlamydia est un organisme pouvant être soupçonné d’être l’agent
causal d’un vaste éventail de problèmes de santé. Deux espèces de
Chlamydia ont été identifiées : Chlamydia trachomatis et Chlamydia psittaci. Cette dernière espèce de Chlamydia infecte principalement les
oiseaux, toutefois les humains peuvent développer des maladies telles
que la pneumonie ou une infection généralisée suite à une exposition à
une espèce aviaire infectée. Chlamydia trachomatis n’infecte généralement que l’homme. Les syndromes cliniques les plus fréquemment associés à une infection à Chlamydia trachomatis comprennent la conjonctivite
à inclusions; le trachome; l’urétrite; la cervicite et d’autres troubles des
voies uro-génitales; et le lymphogranulome vénérien (LGV) (1). Chlamydia
trachomatis peut se transmettre par contact sexuel avec une personne
infectée, par passage au fœtus lors de l’accouchement, ou dans le cas du
trachome dans les pays en développement, principalement par contact
non sexuel entre deux personnes (2).
nly
eO
Us
Chlamydia trachomatis est actuellement reconnu comme étant la première
cause de maladie sexuellement transmissible. Malheureusement, de nombreux individus infectés restent asymptomatiques, ce qui permet à
l’organisme de passer inaperçu (3). Chez la femme, les infections génitales
non diagnostiquées peuvent compromettre de façon définitive les capacités reproductrices en raison de complications telles que la salpingite ou la
pelvipéritonite (4,5). Chlamydia trachomatis est également l’agent causal
du trachome, la première cause de cécité dans le monde, une cécité qu’il
est possible de prévenir (6). Le diagnostic précoce de ces infections à
15
Chlamydia peut permettre de traiter la maladie à temps, ce qui réduit le
risque de complications et de transmission future.
Les premières méthodes d’isolement du Chlamydia reposaient sur la culture dans des vésicules vitellines d’embryons de souris ou de poule. Avec
l’amélioration des méthodes de culture tissulaire, ces dernières ont remplacé les techniques antérieures, moins commodes (7,8). L’utilisation de la
technologie de l’immunofluorescence et des anticorps monoclonaux dans
la détection des organismes dans les cultures de tissu a encore amélioré
la sensibilité des tests du Chlamydia et réduit le besoin de réaliser un passage sur tous les échantillons (9).
rR
Fo
Le Système Pathfinder® fait appel à un anticorps monoclonal conjugué à
la fluorescéine pour identifier les inclusions chlamydiales dans des cellules
en culture inoculées avec des échantillons potentiellement infectés. Ce
test allie la spécificité et la reproductibilité des anticorps monoclonaux à la
rapidité et la simplicité d’un test par fluorescence directe. Pour la détection du Chlamydia dans les cultures de cellules, ce test offre une alternative simple et sensible à d’autres méthodes de coloration.
efe
PRINCIPES DE LA METHODE
ce
ren
Ce test utilise un anticorps monoclonal conjugué à la fluorescéine dans le
but d’identifier le Chlamydia dans des cultures cellulaires. L’anticorps réagit
avec le fragment lipopolysaccharidique des corps d’inclusion et des corps
réticulés qui sont présents dans les inclusions. Ce test détecte tous les
sérovars connus de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci et Chlamydia pneumoniae. Il ne fait pas la différence entre les espèces ou les sérovars.
nly
eO
Us
Le cas échéant, l’anticorps monoclonal réagit avec les antigènes chlamydiens qui sont présents dans la culture cellulaire. Une étape de rinçage permet d’éliminer l’anticorps non lié. Visualisés au microscope à fluorescence,
les échantillons de culture cellulaire infectés par le Chlamydia présentent
une fluorescence vert pomme caractéristique des inclusions, sur un fond
contre-coloré en rouge.
TROUSSE DE REACTIFS
•
Pour usage diagnostique in vitro.
•
Conserver l’anticorps entre 2°C et 8°C.
•
Quand il est stocké conformément aux recommandations, l’Anticorps
Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette.
•
Une fois ouvert, quand il est stocké conformément aux recommandations, l’Anticorps Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption
indiquée sur l'étiquette.
16
1. Anticorps Monoclonal pour confirmation de la présence de
Chlamydia dans les cultures cellulaires
Le flacon contient 4,2 mL d’une solution d’anticorps monoclonal murin
anti-Chlamydia (spécifique du genre) conjugué à la fluorescéine. La
solution contient en outre un agent stabilisant les protéines, un contrecolorant Bleu Evans, et 0.1% d’azoture de sodium. La solution d’anticorps est prête à l’emploi. Toute dilution supplémentaire réduirait la
sensibilité du test.
Les signes d’une détérioration possible du produit sont les suivants :
•
•
Intensification du fond vert des échantillons témoins.
Altération de la réactivité nominale des témoins positifs et négatifs.
Fo
MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS D’EMPLOI
Réservé à un usage professionnel uniquement
Xn. Nocif
ren
efe
rR
Réactifs contenant de l’azoture de sodium
Le réactif contient 0,1% d’azoture de sodium. L’azoture de sodium est
susceptible de réagir avec le plomb et le cuivre des canalisations et former
ainsi des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de la mise au
rebut des liquides, rincer abondamment à l’eau afin d’éviter l’accumulation d’azotures. Pour de plus amples informations, se référer au Manuel
édité par les CDC (Centers for Disease Control) (10).
ce
R: 21/22
Nocif en cas de contact avec la peau et par ingestion.
S: 24/25-28-36/37/39
Éviter le contact avec la peau et les yeux. Après contact avec
la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de
l'eau. Porter un vêtement de protection approprié, des gants
et un appareil de protection des yeux/du visage.
eO
Us
nly
Échantillons patients
Lors du recueil et du traitement des échantillons patients, ces produits
doivent être considérés comme potentiellement infectieux et donc
manipulés en respectant les précautions d'usage et les bonnes pratiques
du laboratoire clinique, quels que soient leur origine, leur traitement ou
leur certification antérieur. Utiliser un désinfectant approprié pour la
décontamination. Ces produits et leurs récipients doivent être stockés et
mis au rebut conformément à la législation et aux directives en vigueur.
RECUEIL ET PREPARATION DES SPECIMENS
Le recueil des échantillons est une étape critique pour la détection du
Chlamydia (11). Le personnel procédant au recueil des échantillons doit
être pleinement qualifié afin de minimiser le risque de prélever des échantillons insuffisants ou inadéquats. Une procédure recommandée pour le
prélèvement des échantillons du col utérin et de l’urètre chez l’homme est
décrite ci-dessous.
17
ATTENTION : Suivre les règles de sécurité biologique habituelles lors du
recueil et du traitement des échantillons destinés à la détection de
Chlamydia. Considérer les échantillons et tous les matériels avec lesquels
ils entrent en contact comme potentiellement infectieux, et les mettre au
rebut suivant les procédures établies. Ne pas pipeter à la bouche. Eviter la
production d’aérosols. Consulter la référence 12 pour de plus amples
informations sur la prévention des infections au laboratoire.
Recueil des échantillons (échantillons du col utérin et de l’urètre masculin)
Matériels requis
1. Tampon de grande taille destiné à nettoyer l’exocol avant le prélèvement d’un échantillon endocervical.
2. Tampons stériles
Fo
Utiliser des tampons qui n’inhibent pas la prolifération du Chlamydia
ou des cellules en culture.
rR
3. Milieu de transport
efe
Utiliser un milieu de culture qui n’inhibe pas la prolifération du
Chlamydia ou des cellules en culture.
Recueil des échantillons : mode opératoire
1. Échantillons urétraux
ren
ce
REMARQUE : Pour un diagnostic précis, l’échantillon doit contenir
des cellules épithéliales provenant de la muqueuse de l’urètre.
Ces cellules sont les plus sensibles à l’infection par le Chlamydia.
(L’exsudat ne constitue par un échantillon approprié pour le test
du Chlamydia en laboratoire.) (13)
Us
Donner pour instruction au patient de s’abstenir d’uriner pendant
l’heure qui précède le prélèvement.
eO
nly
a. Insérer un petit tampon à l’intérieur de l’urètre, à une profondeur de
2 à 4 cm. (L’insertion sera facilitée en imprimant un léger mouvement de rotation au tampon.)
b. Imprimer un mouvement de rotation au tampon en exerçant une
pression suffisante pour obtenir des cellules épithéliales.
c. Laisser le tampon en place pendant 1 à 2 secondes.
d. Retirer le tampon, le placer immédiatement dans le milieu de transport et l’envoyer au laboratoire. L’échantillon peut être conservé à
2-8°C pendant 24 heures maximum. Pour une conservation plus
longue, congeler à –70°C jusqu’à l’inoculation.
2. Échantillons cervicaux
REMARQUE : Les cellules épithéliales cylindriques de la
muqueuse cervicale sont les plus sensibles à l’infection par le
Chlamydia (13). Ces cellules cylindriques se situent juste à
l’intérieur de l’orifice du col.
18
La situation de la zone de transition, où se termine l‘épithélium
stratifié et commence l’épithélium cylindrique, peut varier dans
certains cas (14). Le respect de la procédure suivante garantira
que les échantillons sont suffisants et appropriés.
efe
rR
Fo
a. A l’aide d’un tampon de grande taille, débarrasser l’exocol de
l’excès de mucus et d’exsudat. Mettre le tampon au rebut.
b. Insérer un tampon stérile dans le canal endocervical, sur une profondeur d’environ 1 à 1,5 cm jusqu’à ce que la majeure partie du
tampon ait franchi l’orifice du col.
c. Imprimer une rotation au tampon pendant 5 à 10 secondes en
exerçant suffisamment de pression pour obtenir des cellules provenant de toutes les faces du canal endocervical.
d. Retirer le tampon en évitant tout contact avec les muqueuses vaginales. Placer immédiatement dans le milieu de transport et envoyer
au laboratoire. L’échantillon peut être conservé à 2-8°C pendant 24
heures maximum. Pour une conservation plus longue, congeler
l’échantillon à –70°C jusqu’à son inoculation dans la culture cellulaire.
Traitement des échantillons en vue de la culture cellulaire
Matériels requis
1. Lignée de cellules
ren
Utiliser une lignée de cellules sensible au Chlamydia – par exemple,
des cellules McCoy.
ce
REMARQUE : Le choix et l’état des cellules de culture peuvent influencer la sensibilité de la technique de détection du Chlamydia par
culture de confirmation.
Us
2. Cultures cellulaires témoins
Témoin négatif – cellules inoculées avec le milieu de transport seul
Témoin positif – cellules inoculées avec un échantillon positif pour
le Chlamydia.
eO
•
•
nly
3. Autres fournitures et équipements de culture cellulaire
•
Milieux de culture, flacons, plaques de microtitration, centrifugeuse,
incubateur à atmosphère contrôlée en CO2, etc.
Procédure de mise en culture
1. Suivant une méthode établie, inoculer l’échantillon sur une couche de
cellules confluentes.
2. Incuber la couche monocellulaire pendant 48 heures.
3. Si désiré, réaliser un passage et incuber pendant 48 heures de plus.
19
PROCEDURE DE TEST
Matériels fournis
1. Anticorps monoclonal anti-Chlamydia
Matériels requis mais non fournis
1. Fixateur : méthanol de qualité histologique ou analytique
2. Eau désionisée
3. Milieu de montage Pathfinder® – N° de catalogue Bio-Rad : 30693
4. Plaque de microtitration pour microscopie avec lamelles adaptées
(diamètre 5 mm), ou lames de microscope en verre et pinces (selon la
technique de culture utilisée)
5. Pipettes stériles
Fo
6. Chambre d’humidification
efe
rR
7. Microscope à fluorescence – Pour visualiser les échantillons colorés à
l’isothiocyanate de fluorescéine, utiliser un système de filtres qui donne
une longueur d’onde d’excitation de 480-490 nm et une longueur
d’onde d’émission égale ou supérieure à 510 nm. Le type et l’état des
filtres et de la source lumineuse peuvent affecter l’intensité de la réaction fluorescente.
ce
ren
Procédure de coloration fluorescente de la culture cellulaire
A. Technique de culture sur plaque de microtitration
1. Fixation de la couche de cellules
a. Aspirer avec précaution le milieu de chaque puits.
Us
b. Ajouter suffisamment de méthanol pour couvrir la couche monocellulaire dans chaque puits. Fixer pendant 10 minutes à
température ambiante (23°C ± 3°C).
eO
c. Aspirer le liquide de chaque puits à l’aide d’une pipette, ou renverser la plaque et l’éponger sur un papier absorbant afin
d’éliminer le méthanol. Colorer immédiatement.
2. Coloration de la couche monocellulaire
nly
Si la coloration n’est pas réalisée immédiatement, conserver les
plaques à –70°C.
REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter à l’eau
désionisée avant la coloration. (Renverser la plaque et éponger
afin d’éliminer l’excès de liquide.)
a. Déposer 1 goutte (environ 30 µL) d’anticorps monoclonal antiChlamydia dans chaque puits. La solution d’anticorps doit
recouvrir la totalité de la couche monocellulaire.
b. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante (23°C ±
3°C) pendant 30 minutes. Protéger la plaque de la lumière
intense durant l’incubation.
20
c. Découvrir la plaque et éliminer l’anticorps monoclonal des puits
en aspirant le liquide à la pipette, ou en renversant la plaque et
en l’épongeant sur du papier absorbant. Rincer à l’eau désionisée afin d’éliminer les anticorps résiduels. Renverser la plaque
et éponger sur du papier absorbant afin d’éliminer l’excès
d’eau.
d. Déposer 1 goutte de milieu de montage dans chaque puits et
recouvrir d’une lamelle.
REMARQUE : Utiliser uniquement le milieu de montage
Pathfinder®, N° de catalogue Bio-Rad 30693
Fo
3. Inverser la plaque de microtitration et examiner les puits au microscope à fluorescence à l’aide d’un objectif à longue focale. Examiner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement
minimum de 100 X. Si la présence de corps d’inclusion est douteuse, confirmer à un grossissement plus fort.
efe
rR
Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être conservées à l’obscurité à 4°C. Elles doivent toutefois être examinées
dans les 24 heures qui suivent.
ren
B. Technique de culture en flacon
1. Fixation de la couche monocellulaire
a. Aspirer avec précaution le milieu de culture dans chaque flacon.
ce
b. Ajouter dans chaque flacon une quantité suffisante de méthanol
pour couvrir la couche de cellules. Fixer pendant 10 minutes à
température ambiante (23°C ± 3°C).
eO
Us
c. Eliminer le méthanol par aspiration à la pipette.
Si la coloration n’est pas réalisée immédiatement, conserver les
flacons à –70°C.
nly
2. Coloration de la couche monocellulaire
a. A l’aide de pinces, retirer avec précaution la lamelle portant la
couche de cellules confluentes du flacon et la déposer sur une
lame de verre propre, convenablement étiquetée, les cellules
étant dirigées vers le haut. Colorer immédiatement.
REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter avec de
l’eau désionisée. (Eliminer ensuite l’excès de liquide.)
b. Déposer 1 goutte (environ 30 µL) de la solution d’anticorps
monoclonal Pathfinder® sur la couche de cellules. La solution
d’anticorps doit recouvrir complètement la couche de cellules.
c. Incuber dans une chambre d’humidification à température
ambiante (23°C ± 3°C) pendant 30 minutes. Protéger les
lamelles des sources de lumière intense durant l’incubation.
d. Rincer la lamelle à l’eau désionisée afin d’en éliminer les anticorps non liés. (Eponger l’excès d’eau.)
21
e. Placer une goutte de milieu de montage sur une lame de verre
propre, convenablement étiquetée. Y déposer la lamelle avec
précaution, en évitant de piéger des bulles d’air, la couche de
cellules étant dirigée vers le bas.
3. Examiner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement
minimum de 100 X. Si la présence de corps d’inclusion est douteuse, confirmer à un grossissement plus fort.
Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être conservées à l’obscurité à 4°C. Elles doivent toutefois être examinées
dans les 24 heures maximum.
REMARQUE : Utiliser exclusivement le milieu de montage
Pathfinder® de Bio-Rad N° de Catalogue 30693
Fo
CONTROLE DE QUALITE
efe
rR
Un témoin positif et un témoin négatif seront joints à chaque lot de cultures patients afin de vérifier la performance du système de culture, de la
technique fluorescente et du microscope.
INTERPRETATION DES RESULTATS
ce
ren
Examiner d’abord les échantillons témoins. Les cultures cellulaires
témoins facilitent l’interprétation des résultats en illustrant les réactions
positive et négative sur la lignée de cellules utilisée pour les échantillons
patients. Si la réactivité des témoins est conforme, passer à l’interprétation des échantillons patients. En cas de réaction inappropriée des
témoins, répéter le test. Les réactions positive et négative sont décrites de
manière détaillée ci-dessous.
Us
nly
eO
Résultats positifs
Un témoin ou un échantillon patient positif présentera des inclusions cytoplasmiques fluorescentes caractéristiques qui seront visibles à un grossissement de 100 X. L’inclusion apparaît comme une masse fluorescente
bien définie, de couleur vert pomme, dans le cytoplasme de la cellule
infectée, à proximité du noyau. La présence d’une ou de plusieurs inclusions dans une culture détermine un résultat positif. Les cellules non
infectées et le fond des cellules infectées sont colorés en rouge par le
contre-colorant. La coloration non spécifique se distingue par une teinte
jaune, blanche ou verte terne plutôt que vert pomme.
Résultats négatifs
Un échantillon négatif ne présentera aucune fluorescence vert pomme
spécifique. Toutes les cellules seront colorées en rouge par le contre-colorant. La coloration non spécifique est minime.
22
RESTRICTIONS
1. La visualisation des inclusions peut s’avérer difficile si l’anticorps
sèche sur la couche monocellulaire.
2. La performance de ce test sur des échantillons prélevés chez des
patients sous traitement antimicrobien est inconnue.
3. Pour détecter le Chlamydia, il est impératif que le prélèvement des
échantillons soit effectué dans les règles. Le personnel chargé du
recueil des échantillons doit être pleinement qualifié afin de minimiser
le risque d’obtenir des échantillons insuffisants ou inappropriés.
VALEURS PREVISIBLES
rR
Fo
4. L’utilisation de l’anticorps monoclonal anti-Chlamydia destiné à tester
les cultures de confirmation sur des échantillons cliniques directs est
déconseillée. (Bio-Rad propose une trousse spécifiquement conçue
pour la détection du Chlamydia dans les échantillons directs – N° de
catalogue 30704.)
ce
ren
efe
Les valeurs prévisibles peuvent varier selon la population testée. Bio-Rad
a soumis 402 échantillons provenant de patients issus de populations à
haut et à bas risque aux tests de confirmation par culture Pathfinder® et
MicroTrak™. Les discordances restant après un passage ont été
tranchées en utilisant le test du Chlamydia sur culture cellulaire de Ortho
Diagnostics. La concordance globale entre les deux tests était de 99,5%
pour les cultures primaires et de 100,0% pour les cultures secondaires.
Seul 1 échantillon ayant donné un résultat négatif pour la culture primaire
s’est avéré positif après un passage. Par comparaison avec les tests concurrents, la sensibilité et la spécificité du test Pathfinder® étaient toutes
deux de 100,0% pour les cultures primaires et secondaires. (Se reporter à
la section Caractéristiques de performance spécifiques pour de plus
amples informations.)
eO
Us
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE SPECIFIQUES
nly
Trois laboratoires indépendants ont évalué la capacité du réactif Pathfinder® de détecter le Chlamydia dans les cultures cellulaires. Les trois
sites d’étude indépendants étaient situés l’un dans l’Est, l’autre dans le
Sud et le troisième dans l’Ouest des Etats Unis. Le test de confirmation
sur culture MicroTrak™ de Syva a été utilisé comme méthode de référence
et la trousse commercialisée par Ortho Diagnostics a servi à résoudre les
discordances éventuelles entre les résultats après un passage.
Les investigateurs ont recueilli un frottis endocervical ou un frottis urétral
chez chaque patient, placé le tampon dans le milieu de transport en vue
de son inoculation dans une culture cellulaire. Deux des investigateurs ont
inoculé 5 couches de cellules McCoy à confluence pour chaque patient.
Après 48 heures d’incubation, deux des cultures ont été colorées, l’une
avec le réactif Pathfinder®, l’autre avec le réactif MicroTrak™. Pour les cultures donnant des résultats négatifs ou discordants pour les cultures pri23
maires, les 3 cultures restantes ont été fractionnées et transférées sur 3
autres cultures de cellules. Après 48 heures d’incubation supplémentaires,
les investigateurs ont à nouveau coloré 2 des cultures monocouches,
l’une avec le réactif Pathfinder®, l’autre avec le réactif MicroTrak™. Le cas
échéant, la culture secondaire restante a été testée à l’aide du réactif de
Ortho Diagnostics afin de résoudre les discordances éventuelles. Le
troisième investigateur a inoculé 3 monocouches par patient et procédé
comme ci-dessus, à l’exception du fait que, le cas échéant, la couche
monocellulaire restante était fractionnée en trois nouvelles couches monocellulaires.
Les cultures comportant au moins 1 inclusion après l’incubation primaire
ou après le fractionnement et le premier passage étaient considérées
comme positives.
ren
efe
rR
Fo
Les échantillons provenaient de deux populations distinctes, une population à haut risque et une population à bas risque. La population à haut risque se composait d’hommes et de femmes consultant dans des cliniques
spécialisées dans les maladies sexuellement transmissibles et présentant
des symptômes uro-génitaux ou d’hommes et de femmes asymptomatiques en contact avec des patients porteurs d’une maladie sexuellement
transmissible. La prévalence globale du Chlamydia dans cette population
était de 23,5%. La population à bas risque se composait de femmes consultant en vue d’examens obstétriques ou gynécologiques de routine, ou
qui répondaient aux critères suivants :
ce
1) âge supérieur à 25 ans ; 2) aucun signe de pertes cervicales purulentes,
d’ectopie cervicale ou de friabilité cervicale ; et 3) aucun contact avec un
patient porteur d’un syndrome ou d’un pathogène associé à une maladie
sexuellement transmissible. Dans cette population, la prévalence globale
du Chlamydia était de 10,0%.
Us
nly
eO
Les caractéristiques de performance du Test de Confirmation sur Culture
Pathfinder® après culture primaire et secondaire sont détaillées dans le
Tableau 1, par comparaison avec le test concurrent.
24
Tableau 1 - Comparaison du Test de Confirmation sur Culture Pathfinder® et du test
concurrent après culture primaire et secondaire
Population à
haut risque
n
Population à
bas risque
302
Cumulée
(Population à
haut et à bas
risque)
100
402
VP
VP + FN
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Spécificité
VN
VN + FP
100,0%
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
Valeur
prédictive
positive
VP
VP + FP
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Valeur
prédictive
négative
VN
VN + FN
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
Fo
Sensibilité
100,0%
rR
REMARQUE : VP = vrai positif, FP = faux positif, FN = faux négatif, VN = vrai négatif
efe
Le Tableau 2 résume les données comparant le Réactif Pathfinder® et le
Réactif MicroTrak™ sur les cultures primaires uniquement
ce
ren
Tableau 2 - Comparaison du Réactif Pathfinder® et du Réactif MicroTrak™ sur les
cultures primaires uniquement
Population à haut
risque
302
Cumulée
(Population à
haut et à bas
risque)
100
69
69
VN
VN + FP
99,6%
Valeur
prédictive
positive
VP
VP + FP
Valeur
prédictive
négative
VN
VN + FN
402
9
9
100,0%
78
78
232*
233
98,9%
90*
91
99,4%
322*
324
98,6%
69*
70
90,0%
9*
10
97,5%
78*
80
100,0%
232
232
100,0%
90
90
100,0%
322
322
eO
100,0%
nly
100,0%
Spécificité
Us
n
VP
VP + FN
Sensibilité
Population à
bas risque
* Deux échantillons positifs d’après le test Pathfinder® et négatifs d’après le test
MicroTrak™ après la culture primaire ont donné des résultats positifs après le premier
passage aussi bien avec le test MicroTrak™ qu’avec la méthode Ortho Diagnostics. En
considérant que ces échantillons sont des positifs vrais, la spécificité et la valeur prédictive positive du test Pathfinder ® atteignent 100% pour les populations à haut risque, à
bas risque et cumulée.
Les caractéristiques de performance étaient comparables pour les hommes et les femmes de la population à haut risque.
25
Le Tableau 3 détaille les nombres de résultats positifs obtenus après les
cultures primaires et secondaires. Le réactif Pathfinder® a permis de
détecter 2,5% de résultats positifs de plus que le réactif MicroTrak™
parmi les cultures primaires. L’utilisation du test Pathfinder® sur les cultures secondaires a donné 1,2% de résultats positifs de plus que sur les
cultures primaires.
Tableau 3 -Détection du Chlamydia dans des cultures primaires et secondaires
Culture primaire Culture secondaire
Pathfinder®
80
81
Positives avec MicroTrak™
78
80
Positives avec
Fo
REACTIVITE CROISEE
efe
rR
Bio-Rad a testé la réactivité croisée des organismes repris dans le Tableau
4 avec le réactif Pathfinder®. Les organismes cités ont été testés sur des
lames à substrat fixé et n’ont manifesté aucune réactivité croisée vis-à-vis
de l’anticorps monoclonal Pathfinder®.
Tableau 4 - Etudes de la réactivité croisée de contaminants potentiels
des cultures cellulaires vis-à-vis de l’anticorps
Cytomegalovirus
ce
Herpes viruses
Réactivité croisée avec
l’anticorps monoclonal
anti-Chlamydia
ren
Organisme
Négatif
Négatif
Us
Herpes simplex Type I
Herpes simplex Type II
Négatif
Mycoplasma arginini
eO
Mycoplasma hominis
Négatif
Mycoplasma hyorhinis
Négatif
Mycoplasma orale
Négatif
Mycoplasma salivarium
Négatif
Varicella zoster Virus
Négatif
Acholeplasma laidlawii
Négatif
nly
Négatif
26
Pathfinder® Chlamydia Sistema de
Confirmación en Cultivos
30701
Para la identificación de Chlamydia en los cultivos
celulares por fluorescencia directa.
Fo
rR
CAMPO DE APLICACIÓN
efe
El Pathfinder® Chlamydia Sistema de Confirmación en Cultivos es una
prueba de identificación de Chlamydia en los cultivos celulares por fluorescencia directa.
ren
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
ce
Chlamydia es un organismo sospechoso de ser el agente causal de una
amplia gama de problemas de la salud. Se han identificado dos especies
de Chlamydia: Chlamydia trachomatis y Chlamydia psittaci. Esta última
especie de Chlamydia infecta principalmente a los pájaros, pero los
humanos pueden desarrollar enfermedades como la neumonía o una
infección generalizada tras su exposición a una especie aviar infectada.
Generalmente Chlamydia trachomatis sólo infecta al hombre. Los síndromes clínicos que con mayor frecuencia se asocian a una infección por
Chlamydia trachomatis incluyen las conjuntivitis de inclusiones, el tracoma, la uretritis, la cervicitis y otras afecciones de las vías urogenitales, y
el linfogranuloma venéreo (LGV) (1). Chlamydia trachomatis puede transmitirse por contacto sexual con una persona infectada, por paso al feto
durante el parto, o, en el caso del tracoma en países en vías de desarrollo,
principalmente por contacto no sexual entre dos personas (2).
nly
eO
Us
Actualmente, Chlamydia trachomatis se conoce por ser la primera causa
de enfermedades de transmisión sexual. Desgraciadamente, muchos individuos infectados son asintomáticos, lo que permite al organismo pasar
desapercibido (3). En la mujer, las infecciones genitales sin diagnosticar
pueden comprometer de forma definitiva sus capacidades reproductoras
debido a ciertas complicaciones como la salpingitis o la pelviperitonitis
(4,5). Chlamydia trachomatis también es el agente causal del tracoma, la
primera causa de ceguera en el mundo, una ceguera que se puede prevenir (6). El diagnóstico precoz de estas infecciones por Chlamydia tra-
27
chomatis permite tratar la enfermedad a tiempo, lo que reduce el riesgo
de complicaciones y de una futura transmisión.
Los primeros métodos de aislamiento de Chlamydia se basaban en el cultivo en vesículas vitelinas de embriones de ratón o de pollo. Cuando mejoraron los métodos de cultivos tisulares, éstos remplazaron las técnicas
anteriores que eran menos cómodas (7,8). La utilización de la tecnología
de la inmunofluorescencia y de los anticuerpos monoclonales en la detección de organismos en los cultivos de tejidos mejoró aún más la sensibilidad de las pruebas de Chlamydia y redujo la necesidad de efectuar un
pasaje por todas las muestras (9).
efe
rR
Fo
El Sistema Pathfinder® utiliza un anticuerpo monoclonal conjugado con
fluoresceína para identificar las inclusiones de Chlamydias en las células
en cultivo inoculadas con muestras potencialmente infectadas. En esta
prueba se unen la especificidad y la reproducibilidad de los anticuerpos
monoclonales con la velocidad y la sencillez de una prueba por fluorescencia directa. En la detección de Chlamydia en los cultivos celulares,
este test ofrece una alternativa sencilla y sensible a otros métodos de coloración.
PRINCIPIOS DEL MÉTODO
ce
ren
Esta prueba utiliza un anticuerpo monoclonal conjugado con fluoresceína
para identificar la Chlamydia en los cultivos celulares. El anticuerpo reacciona con el fragmento lipopolisacárido de los cuerpos de inclusión y de
los cuerpos reticulados que se encuentran en las inclusiones. Esta prueba
detecta todos los serotipos conocidos de Chlamydia trachomatis,
Chlamydia psittaci, y Chlamydia pneumoniae. No diferencia entre especies
ó serotipos. Llegado el caso, el anticuerpo monoclonal reacciona con los
antígenos de Chlamydia que se encuentran presentes en el cultivo celular.
En la etapa de aclarado se elimina el anticuerpo no unido. Cuando se
visualizan en el microscopio de fluorescencia, las muestras de cultivo
celular infectadas por Chlamydia presentan una fluorescencia verde manzana característica de los cuerpos de inclusión, sobre un fondo con una
contratinción roja.
nly
eO
Us
KIT DE REACTIVOS
•
Para uso diagnóstico in vitro.
•
Conservar el anticuerpo entre 2°C y 8°C.
•
El anticuerpo monoclonal está estable hasta la fecha de caducidad
establecida en la etiqueta cuando el producto está almacenado según
las recomendaciones.
•
Una vez abierto, el anticuerpo monoclonal está estable hasta la fecha
de caducidad establecida en la etiqueta cuando el producto está
almacenado según las recomendaciones.
28
1. Anticuerpo Monoclonal para confirmar la presencia de Chlamydia
en los cultivos celulares.
El frasco contiene 4,2 mL de una solución de anticuerpos monoclonales múridos anti-Chlamydia (específicos del género) conjugados
con fluoresceína. La solución también contiene un agente estabilizante
de las proteínas, una contratinción Azul de Evans y 0,1% de azida
sódica. La solución de anticuerpos está lista para usar. Cualquier
dilución suplementaria reducirá la sensibilidad de la prueba.
Los signos de un posible deterioro del producto son los siguientes:
•
•
Una intensificación del fondo verde de las muestras control.
Una alteración de la reactividad nominal de los controles positivo y
negativo.
Fo
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Reservado para uso profesional únicamente
Xn. Nocivo
ren
efe
rR
Reactivos que contienen azida sódica
El reactivo contiene 0,1% de azida sódica. La azida sódica puede reaccionar con las tuberías de plomo o cobre para formar azoturos metálicos
altamente explosivos. Para evitar las acumulaciones de estos azoturos en
las cañerías, enjuagar las tuberías con abundante agua mientras se eliminan estos líquidos por el desagüe. Para más información, por favor consulte el Manual editado por los CDC (Centers for Disease Control) (10).
ce
R: 21/22
Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
S: 24/25-28-36/37/39
Evítese el contacto con los ojos y la piel. En caso de contacto
con la piel, lávese inmediata y abundantemente con agua.
Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para
los ojos/la cara.
eO
Us
nly
Muestras de pacientes
Durante la obtención y el tratamiento de muestras procedentes de
pacientes, suponga que son capaces de transmitir agentes infecciosos,
no obstante su origen, tratamiento o autorización previa. Manipular tales
muestras con precauciones universales, siguiendo prácticas adecuadas
establecidas por trabajo en el laboratorio clínico. Emplear un desinfectante adecuado para realizar la descontaminación. El almacenaje y la
eliminación de estas sustancias y los recipientes correspondientes deben
realizarse según las normas y directrices locales.
OBTENCIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
La toma de muestras es una etapa crítica en la detección de Chlamydia
(11). El personal encargado de recoger las muestras deberá estar totalmente cualificado para minimizar el riego de obtener muestras insuficientes o inadecuadas. Posteriormente se describe el procedimiento
29
recomendado para la toma de muestras del cuello uterino, y de la uretra
en el hombre.
ATENCIÓN: Respetar las reglas de seguridad biológica habituales durante
la obtención y el tratamiento de las muestras destinadas a la detección de
Chlamydia. Todas las muestras y todo el material con el que entren en
contacto deberán considerarse como potencialmente infeccioso, y se
eliminarán según los procedimientos adecuados. No pipetear con la boca.
Evitar la producción de vapores. Para más información sobre la prevención de infecciones en el laboratorio, consultar la referencia 12.
Fo
Obtención de las muestras (muestras del cuello uterino y de la uretra
masculina)
Material necesario
1. Tampón grande para limpiar la exocervix antes de obtener una muestra
endocervical.
2. Tampones estériles
3. Medio de transporte
efe
rR
Utilizar tampones que no inhiban la proliferación de Chlamydia o de las
células en cultivo.
Utilizar un medio de cultivo que no inhiban la proliferación de
Chlamydia o de las células en cultivo.
ren
Obtención de las muestras: procedimiento
1. Muestras uretrales
ce
eO
Us
ADVERTENCIA: Para un diagnóstico riguroso, la muestra debe
contener células epiteliales procedentes de la mucosa de la uretra. Estas células son las más sensibles a la infección por Chlamydia. (El exudado no constituye una muestra adecuada para la
prueba de Chlamydia en el laboratorio) (13).
Se indicará al paciente que debe abstenerse de orinar durante la
hora anterior a la recogida de la muestra.
nly
a. Insertar un tampón pequeño en el interior de la uretra, a una profundidad de 2 a 4 cm. (La inserción será más fácil si se ejerce un
ligero movimiento de rotación sobre el tampón).
b. Ejercer un movimiento de rotación sobre el tampón al mismo
tiempo que se presiona lo suficiente para obtener células epiteliales.
c. Mantener el tampón en la uretra durante 1 a 2 segundos.
d. Retirar el tampón, colocarlo inmediatamente en el medio de transporte y enviarlo al laboratorio. La muestra puede conservarse a
2-8°C durante un máximo de 24 horas. Para un almacenamiento
más largo, congelar a –70°C hasta la inoculación.
30
2. Muestras cervicales
ADVERTENCIA: Las células epiteliales cilíndricas de la mucosa
cervical son las más sensibles a la infección por Chlamydia (13).
Estas células cilíndricas se localizan justo en el interior del orificio
del cuello.
La situación de la zona de transición, donde termina el epitelio
estratificado y comienza el epitelio cilíndrico, puede variar en ciertos casos (14). Se debe respetar el siguiente procedimiento para
garantizar que las muestras son suficientes y adecuadas.
ce
ren
efe
rR
Fo
a. Con un tampón grande, limpiar la exocervix eliminando el exceso
de mucus y de exudado. Tirar el tampón.
b. Insertar un tampón estéril en el canal endocervical, a una profundidad de aproximadamente 1 a 1,5 cm hasta que la mayor parte del
tampón pase el orificio del cuello.
c. Ejercer un movimiento de rotación sobre el tampón durante 5 a 10
segundos al mismo tiempo que se presiona lo suficiente para
obtener células procedentes de todas las caras del canal endocervical.
d. Retirar el tampón evitando su contacto con las mucosas vaginales.
Colocarlo inmediatamente en el medio de transporte y enviarlo al
laboratorio. La muestra puede conservarse a 2-8°C durante un
máximo de 24 horas. Para un almacenamiento más largo, congelar
a –70°C hasta su inoculación en el cultivo celular.
Tratamiento de las muestras para el cultivo celular
Material necesario
1. Línea de células
Us
Utilizar una línea de células sensible a Chlamydia – por ejemplo,
células McCoy.
eO
nly
ADVERTENCIA: La elección y el estado de las células de cultivo
pueden influir en la sensibilidad de la técnica de detección de
Chlamydia por cultivo de confirmación.
2. Cultivos celulares control
•
•
Control negativo – células inoculadas con el medio de transporte
sólo.
Control positivo – células inoculadas con una muestra positiva para
Chlamydia.
3. Otros aparatos y equipos para el cultivo celular
•
Medios de cultivo, frascos, placas de microtitulación, centrifugadora, incubadora con atmósfera controlada en CO 2, etc.
31
Procedimiento para cultivar
1. Siguiendo un método establecido, inocular la muestra sobre una capa
de células en confluencia.
2. Incubar la capa monocelular durante 48 horas.
3. Si se desea, realizar un pasaje e incubar durante otras 48 horas.
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Material suministrado
1. Anticuerpo monoclonal anti-Chlamydia
Material necesario pero no suministrado
1. Fijador: metanol de calidad histológica o analítica
2. Agua desionizada
Fo
3. Medio de montaje Pathfinder® – N° de catálogo Bio-Rad : 30693
5. Pipetas estériles
efe
rR
4. Placa de microtitulación para microscopio con cubreobjetos adaptados
(diámetro 5 mm), o portas de microscopio de vidrio y pinzas (según la
técnica de cultivo utilizada)
6. Cámara de humidificación
ren
ce
7. Microscopio de fluorescencia – Para visualizar las muestras coloreadas con isotiocianato de fluoresceína, utilizar un sistema de filtros
con una longitud de onda de excitación de 480-490 nm y una longitud
de onda de emisión igual o superior a 510 nm. El tipo y el estado de los
filtros y de la fuente luminosa pueden afectar a la intensidad de la reacción fluorescente.
Us
eO
Procedimiento de coloración fluorescente del cultivo celular
A. Técnica de cultivo en placa de microtitulación
1. Fijación de la capa de células
a. Aspirar con cuidado el medio de cada pocillo.
nly
b. Añadir suficiente metanol para cubrir la capa monocelular en
cada pocillo. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente
(23°C ± 3°C).
c. Aspirar el líquido de cada pocillo con una pipeta, o dar la vuelta
a la placa sobre una hoja de papel absorbente para eliminar el
metanol. Realizar la tinción inmediatamente.
Si la coloración no se efectúa inmediatamente, conservar las
placas a –70°C.
32
2. Coloración de la capa monocelular
ADVERTENCIA: Si las células se secan, humedecer con agua
desionizada antes de la tinción (dar la vuelta a la placa para
eliminar el exceso de líquido).
a. Depositar 1 gota (aproximadamente 30 µL) de anticuerpo monoclonal anti-Chlamydia en cada pocillo. La solución de anticuerpos debe cubrir toda la capa monocelular.
b. Tapar la placa e incubar a temperatura ambiente (23°C ± 3°C)
durante 30 minutos. Mantener la placa protegida de la luz
intensa durante la incubación.
rR
Fo
c. Destapar la placa y eliminar el anticuerpo monoclonal de los
pocillos aspirando el líquido con la pipeta, o dar la vuelta a la
placa sobre una hoja de papel absorbente. Aclarar con agua
desionizada para eliminar los anticuerpos residuales. Dar la
vuelta a la placa sobre una hoja de papel absorbente para eliminar el exceso de agua.
efe
d. Depositar 1 gota de medio de montaje en cada pocillo y colocar
un cubreobjetos.
ren
ADVERTENCIA: Utilizar únicamente el medio de montaje
Pathfinder®, N° de catálogo Bio-Rad 30693
ce
3. Invertir la placa de microtitulación y examinar los pocillos en el
microscopio de fluorescencia con un objetivo de distancia focal
larga. Examinar toda la capa monocelular con un aumento mínimo
de 100 X. Si la presencia de cuerpos de inclusión es dudosa, confirmar a mayor aumento.
Us
nly
B. Técnica de cultivo en frasco
1. Fijación de la capa monocelular
eO
En caso necesario, las placas de microtitulación pueden conservarse en oscuridad a 4°C. No obstante, deben examinarse en las
siguientes 24 horas.
a. Aspirar con cuidado el medio de cultivo de cada frasco.
b. Añadir en cada frasco la cantidad suficiente de metanol para
cubrir la capa de células. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
c. Eliminar el metanol aspirando con la pipeta.
d. Si la coloración no se efectúa inmediatamente, conservar los
frascos a –70°C.
2. Coloración de la capa monocelular
a. Con unas pinzas, retirar del frasco cuidadosamente el cubre
que tiene la capa de células en confluencia; colocar el cubre
33
sobre un porta de vidrio limpio, convenientemente etiquetado, y
con las células dirigidas hacia arriba. Realizar la tinción inmediatamente.
ADVERTENCIA: Si las células se secan, humedecer con
agua desionizada (después, eliminar el exceso de líquido).
b. Depositar 1 gota (aproximadamente 30 µL) de la solución de
anticuerpo monoclonal Pathfinder® sobre la capa de células. La
solución de anticuerpos debe cubrir toda la capa monocelular.
c. Incubar en una cámara de humidificación a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) durante 30 minutos. Mantener los cubres protegidos de las fuentes de luz intensa durante la incubación.
Fo
d. Aclarar el cubre con agua desionizada para eliminar los anticuerpos no unidos (eliminar el exceso de agua).
efe
rR
e. Depositar una gota de medio de montaje sobre un porta de vidrio limpio, convenientemente etiquetado. Colocar el cubre con
cuidado, evitando que queden burbujas de aire, y dirigiendo
hacia abajo la capa de células.
ren
3. Examinar toda la capa monocelular con un aumento mínimo de
100 X. Si la presencia de cuerpos de inclusión es dudosa, confirmar a mayor aumento.
ce
En caso necesario, las placas de microtitulación pueden conservarse en oscuridad a 4°C. No obstante, deben examinarse en las
siguientes 24 horas.
ADVERTENCIA: Utilizar únicamente el medio de montaje Pathfinder® de Bio-Rad N° de catálogo 30693
Us
CONTROL DE CALIDAD
eO
En cada lote de cultivos de pacientes se incluirá un control positivo y un
control negativo para garantizar las especificaciones del sistema de cultivo, de la técnica fluorescente y del microscopio.
nly
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En primer lugar, examinar las muestras control. Los cultivos celulares control facilitan la interpretación de los resultados mostrando las reacciones
positiva y negativa en la línea de células utilizada para las muestras
pacientes. Si la reactividad de los controles es correcta, examinar las
muestras de pacientes. El ensayo se repetirá si los controles no reaccionan correctamente. Las reacciones positiva y negativa se describen detalladamente a continuación
Resultados positivos
Un control o una muestra de paciente positiva presentará inclusiones citoplásmicas fluorescentes características que son visibles con un aumento
de 100 X. La inclusión aparece como una masa fluorescente bien definida,
34
de color verde manzana, en el citoplasma de la célula infectada cerca del
núcleo. La presencia de una o varias inclusiones en un cultivo determina
un resultado positivo. Las células no infectadas y el fondo de las células
infectadas se colorean en rojo por la contratinción. La coloración no específica se distingue por un tono amarillo, blanco o verde claro más que
verde manzana.
Resultados negativos
Una muestra negativa no presentará la fluorescencia verde manzana específica. Todas las células se colorean en rojo por la contratinción. La coloración no específica es mínima.
LÍMITES
Fo
1. Si el anticuerpo se seca sobre la capa monocelular, la visualización de
las inclusiones puede ser difícil.
rR
2. No se conocen las especificaciones de esta prueba en muestras
obtenidas de pacientes bajo tratamiento antimicrobiano.
efe
3. Para detectar la Chlamydia, es imprescindible que la obtención de
muestras se efectúe cumpliendo las normas. El personal encargado de
la toma de muestras deberá estar totalmente cualificado para minimizar el riego de obtener muestras insuficientes o incorrectas.
ce
ren
4. No se recomienda utilizar del anticuerpo monoclonal anti-Chlamydia
destinado a ensayar los cultivos de confirmación, en el estudio de las
muestras clínicas directas (Bio-Rad dispone de un kit específicamente
diseñado para la detección de Chlamydia en las muestras directas –
N° de catálogo 30704.)
Us
VALORES PREVISIBLES
nly
eO
Los valores previsibles pueden variar según la población estudiada. BioRad ha evaluado 402 muestras procedentes de pacientes de poblaciones
de alto y bajo riesgo con las pruebas de confirmación en cultivo Pathfinder® y MicroTrak™. Las discordancias existentes tras un pasaje se subsanaron realizando la prueba de Chlamydia en cultivos celulares de Ortho
Diagnostics. La concordancia global entre las dos pruebas fue del 99,5%
para los cultivos primarios y del 100,0% para los cultivos secundarios.
Sólo 1 muestra que había resultado negativa en el cultivo primario dio un
resultado positivo tras un pasaje. Cuando se compara con las pruebas de
la competencia, tanto la sensibilidad como la especificidad de la prueba
Pathfinder® resultaron del 100,0% para los cultivos primarios y secundarios (para más información, ver el apartado Características de las especificaciones).
CARACTERÍSTICAS DE LAS ESPECIFICACIONES
Tres laboratorios independientes han evaluado la capacidad del reactivo
Pathfinder® para detectar Chlamydia en cultivos celulares. Estos tres centros de estudio independientes se localizaban: el primero en el Este, otro
35
en el Sur y el tercero en el Oeste de los Estados Unidos. Como método de
referencia se utilizó la prueba de confirmación en cultivo MicroTrak™ de
Syva, y el kit comercializado por Ortho Diagnostics sirvió para resolver las
posibles discordancias entre los resultados después de realizar un pasaje.
efe
rR
Fo
Los investigadores recogieron un frotis endocervical o un frotis uretral en
cada paciente y colocaron el tampón en el medio de transporte para su
inoculación en un cultivo celular. Dos de los investigadores inocularon 5
capas de células McCoy en confluencia para cada paciente. Tras una
incubación de 48 horas, dos de los cultivos se colorearon, uno con el
reactivo Pathfinder® y el otro con el reactivo MicroTrak™. En cuanto a los
cultivos que daban resultados negativos o discordantes en los cultivos
primarios, los 3 se fraccionaron y se transfirieron sobre otros 3 cultivos de
células. Tras una incubación suplementaria de 48 horas, los investigadores volvieron a colorear 2 de los cultivos en monocapa, uno con el reactivo Pathfinder® y el otro con el reactivo MicroTrak™. El cultivo secundario
restante se ensayó con el reactivo de Ortho Diagnostics para solventar las
eventuales discordancias. El tercer investigador inoculó 3 monocapas por
paciente y procedió como se ha descrito anteriormente, con la excepción
del hecho de que la capa monocelular restante se fraccionaba en tres
nuevas capas monocelulares.
ren
Los cultivos que presentaban al menos 1 inclusión tras la incubación primaria o tras el fraccionamiento y el primer pasaje se consideraban positivas.
ce
Las muestras procedían de dos poblaciones diferentes, una población de
alto riesgo y una población de bajo riesgo. La población de alto riesgo
estaba formada por hombres y mujeres que acudían a consulta en clínicas
especializadas en enfermedades de transmisión sexual y que presentaban
síntomas urogenitales, o por hombres y mujeres asintomáticos en contacto con pacientes portadores de una enfermedad de transmisión sexual.
La prevalencia global de Chlamydia en esta población era del 23,5%. La
población de bajo riesgo estaba formada por mujeres que acudían a consulta para exámenes obstétricos o ginecológicos de rutina, o que
respondían a los siguientes criterios:
nly
eO
Us
1) edad superior a 25 años; 2) ningún signo de pérdidas cervicales purulentas, de ectopía cervical o de friabilidad cervical; y 3) ningún contacto
con un paciente portador de un síndrome o de un patógeno asociado a
una enfermedad de transmisión sexual. En esta población, la prevalencia
global de Chlamydia era del 10,0%.
36
Las características de las especificaciones de la Prueba de Confirmación
en Cultivo Pathfinder® tras el cultivo primario y secundario se detallan en
la Tabla 1, comparándolas con la prueba de la competencia.
Tabla 1 - Comparación de la Prueba de Confirmación en Cultivo Pathfinder® y de la
prueba de la competencia tras cultivo primario y secundario
Población de
alto riesgo
n
Población de
bajo riesgo
302
VP
VP + FN
Especificidad
VN
VN + FP
Valor
predictivo
positivo
VP
VP + FP
Valor
predictivo
negativo
VN
VN + FN
100
100,0%
71
71
402
100,0%
10
10
100,0%
231
231
100,0%
rR
Fo
Sensibilidad
100,0%
Acumulado
(Población de alto
y bajo riesgo)
efe
100,0%
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
ren
NOTA: VP = verdadero positivo, FP = falso positivo, FN = falso negativo, VN = verdadero
negativo
En la Tabla 2 se resumen los datos que comparan el Reactivo Pathfinder®
y el Reactivo MicroTrak™ únicamente en cultivos primarios
ce
Tabla 2 - Comparación del Reactivo Pathfinder® y del Reactivo MicroTrak™ únicamente en
cultivos primarios
302
Población de
bajo riesgo
eO
n
Us
Población de
alto riesgo
Acumulado
(Población de alto
y bajo riesgo)
100
Sensibilidad
VP
VP + FN
100,0%
69
69
100,0%
Especificidad
VN
VN + FP
99,6%
232*
233
98,9%
Valor
predictivo
positivo
VP
VP + FP
98,6%
69*
70
Valor
predictivo
negativo
VN
VN + FN
100,0%
232
232
402
100,0%
78
78
90*
91
99,4%
322*
324
90,0%
9*
10
97,5%
78*
80
100,0%
90
90
100,0%
322
322
nly
9
9
* Dos muestras positivas según la prueba Pathfinder® y negativas según la prueba
MicroTrak™ tras el cultivo primario, dieron resultados positivos tras el primer pasaje tanto
con la prueba MicroTrak™ como con el método de Ortho Diagnostics. Considerando que
estas muestras son verdaderos positivos, la especificidad y el valor predictivo positivo de
la prueba Pathfinder® alcanzan el 100% en las poblaciones de alto riesgo, de bajo riesgo
y en el acumulado.
37
Las características de las especificaciones eran comparables para los
hombres y las mujeres de la población de alto riesgo.
En la Tabla 3 se detalla el número de resultados positivos obtenidos tras
los cultivos primarios y secundarios. El reactivo Pathfinder® permitió
detectar un 2,5% de resultados positivos más que el reactivo MicroTrak™
en los cultivos primarios. La utilización de la prueba Pathfinder® en cultivos secundarios da un 1,2% de resultados positivos más que en los cultivos primarios.
Tabla 3 - Detección de Chlamydia en cultivos primarios y secundarios
Cultivo primario Cultivo secundario
®
80
81
Positivos con MicroTrak™
78
80
Positivos con Pathfinder
Fo
rR
REACTIVIDAD CRUZADA
ren
efe
Bio-Rad ha estudiado la reactividad cruzada de los organismos que se
incluyen en la Tabla 4 con el reactivo Pathfinder®. Los organismos citados
se estudiaron sobre portas con sustrato fijado y no presentaron reactividad cruzada frente al anticuerpo monoclonal Pathfinder®.
Tabla 4 - Estudios de reactividad cruzada de potenciales
contaminantes de los cultivos celulares frente al anticuerpo
Reactividad cruzada con el
anticuerpo monoclonal
anti-Chlamydia
ce
Organismo
Us
Herpesvirus
Cytomégalovirus
Negativa
Negativa
eO
Herpes simplex Type I
Herpes simplex Type II
Negativa
Varicella zoster Virus
Negativa
nly
Acholeplasma laidlawii
Negativa
Mycoplasma arginini
Negativa
Mycoplasma hominis
Negativa
Mycoplasma hyorhinis
Negativa
Mycoplasma orale
Negativa
Mycoplasma salivarium
Negativa
38
Pathfinder® Chlamydia
Kulturbestätigungsstest
30701
Zur Identifizierung von Chlamydien in Zellkulturen im
direkten Immunfluoreszenztest.
Fo
rR
VERWENDUNGSZWECK
Der Pathfinder® Chlamydia Kulturbestätigungsassay ist ein direktes Fluoreszenzverfahren zur Identifizierung von Chlamydien in Zellkulturen.
efe
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG
ce
ren
Chlamydien werden als Erreger vieler Symptome vermutet. Von zwei
bisher identifizierten Chlamydien-Spezies, Chlamydia trachomatis und
Chlamydia psittaci, befällt Chlamydia psittaci hauptsächlich Vögel. Bei
Menschenkann er aber auch Erkrankungen wie Lungenentzündung oder
generalisierte systemische Infektionen hervorrufen. Chlamydia trachomatis
führt dagegen überwiegend bei Menschen zu Infektionen. Zu den häufigsten, mit Chlamydia trachomatis assoziierten Syndromen gehören die Einschluss-Konjunktivitis, das Trachom, Entzündung der Harnröhre und des
Gebärmutterhalses sowie andere urogenitale Erkrankungen und das Lymphogranuloma venereum (LGV) (1). Chlamydia trachomatis wird durch
Sexualkontakt mit einer infizierten Person, durch die Geburt durch einen
infizierten Geburtskanal oder, wie im Fall des Trachoms in Entwicklungsländern, hauptsächlich durch nicht-sexuellen Kontakt von Mensch
zu Mensch übertragen (2).
nly
eO
Us
Chlamydia trachomatis gilt als eine der Hauptursachen für Geschlechtskrankheiten. Viele infizierte Personen bleiben symptomfrei, so dass der
Erreger nicht entdeckt wird (3). Bei Frauen können nicht diagnostizierte
Genitalinfektionen zu dauerhaften Reproduktionsschäden aufgrund von
Komplikationen wie Entzündungen der Eileiter oder des Beckens führen
(4,5). Chlamydia trachomatis ist darüber hinaus der Erreger des Trachoms,
der weltweiten Hauptursache vermeidbarer Erblindung (6). Durch eine
frühe Diagnose dieser Chlamydia-Infektionen kann die rechtzeitige Behandlung dieser Erkrankungen eingeleitet werden wodurch t reduziert werden
können. Frühe Methoden zur Isolierung von Chlamydia beinhalteten ein
Wachstum in Mäusen und Hühnerembryodottersäcken. Durch die Ver39
besserung von Gewebekulturmethoden wurden diese aufwendigen Techniken ersetzt (7,8). Durch die Anwendung von Immunfluoreszenz und
Techniken mit monoklonalen Antikörpern zum Nachweis von Organismen
in Gewebekulturen wurde die Sensitivität von Chlamydia-Kulturen erhöht
und die Notwendigkeit einer Übertragung auf alle Proben reduziert (9).
Der Pathfinder® Chlamydia Kulturbestätigungsassay verwendet einen
monoklonalen Fluorescein-konjugierten Antikörper zur Identifzierung von
Chlamydia-Einschlüssen in beimpften Zellkulturen. Dieser Assay verbindet
die Spezifität und Reproduzierbarkeit monoklonaler Antikörper mit der
schnellen und einfachen Anwendbarkeit eines direkten Fluoreszenztests.
Für den Nachweis von Chlamydien in Kulturen bietet dieser Test eine einfache und sensitive Alternative zu anderen Färbemethoden.
TESTPRINZIP
Fo
ren
efe
rR
Der Test verwendet einen monoklonalen Fluorescein-konjugierten Antikörper für den Nachweis von Chlamydien in Zellkulturen. Der Antikörper
reagiert mit dem Lipopolysaccharidanteil der Elementarkörperchen bzw.
von Retikularkörperchen in Zelleinschlüssen. Mit diesem Test werden alle
bekannten Serovare von Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und
Chlamydia pneumoniae erkannt. Der Test unterscheidet nicht zwischen
Spezies oder Serovaren.
ce
Der monoklonale Antikörper reagiert mit den Chlamydia-Antigenen in der
Zellkultur. Durch einen Waschschritt werden ungebundene Antikörper
entfernt. Unter dem Fluoreszenzmikroskop weisen die mit Chlamydieninfizierten Zellkulturproben gegen einen roten Hintergrund eine spezifische,apfelgrüne Fluoreszenz auf.
Us
REAGENZIEN
Für Die In-Vitro-Diagnostik
•
Lagerung des Antikörpers bei 2 bis 8°C.
•
Monoklonaler Antikörper ist bei der empfohlenen Lagerung bis zu dem
auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum haltbar.
•
Nach dem Öffnen, Monoklonaler Antikörper ist bei der empfohlenen
Lagerung bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum
haltbar.
nly
eO
•
1. Monoklonaler Antikörper zur Bestätigung von Chlamydienin
Zellkulturen
Das Fläschchen enthält 4,2 mL fluorescein-markierten, monoklonalen
Maus-Antikörper gegen Chlamydien (genusspezifisch) mit einem Proteinstabilisator, Evans-Blau-Farbstoff und 0,1% Natriumazid. Die Antikörperlösung ist gebrauchsfertig. Ein Verdünnen der Antikörperlösung
reduziert dieSensitivität des Tests.
40
Anzeichen für einen möglichen Reagenzienzerfall sind :
•
•
Eine erhöhte grüne Hintergrundfluoreszenz der Kontrollproben.
Eine veränderte erwartete Reaktivität der positiven und negativen
Kontrollen
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
Nur zur Verwendung durch Fachpersonal.
Natriumazidhaltige Reagenzien
Das Reagenz enthält 0,1% Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei und
Kupfer in Leitungen unter Bildung hochexplosiver Metallazide reagieren.
Um die Bildung solcher Metallazide zu vermeiden, nach Ausgießen von
Lösungen mit reichlich Wasser nachspülen. Weitere Informationen entnehmen Sie ggf. den Richtlinien des Centers for Disease Control (10).
Fo
ren
efe
rR
Xn. Gesundheitsschädlich
R: 21/22
Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut und beim
Verschlucken.
S: 24/25-28-36/37/39
Berührung mit den Augen und der Haut vermeiden. Bei
Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser.
Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe
und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
ce
Patientenproben
Bei der Entnahme und der Handhabung von Patientenproben Diese
Produkte sollten, unabhängig von ihrem Ursprung, ihrer Vorbehandlung
oder früherer Zertifizierung, als potentiell infektiös betrachtet und gemäß
den Vorsichtsmaßnahmen und den GLP-Richtlinien gehandhabt werden.
Für die Dekontaminierung ein geeignetes Desinfektionsmittel verwenden.
Diese Materialien und ihre Behälter gemäß den gültigen Sicherheitsbestimmungen lagern und entsorgen.
eO
Us
PROBENENTNAHME UND -AUFBEREITUNG
nly
Die Probenentnahme ist ein kritischer Schritt beim Nachweis von Chlamydien (11). Fachpersonal, das Chlamydia-Proben entnimmt, sollte gut geschult sein, um das Vorkommen ungeeigneter Proben auf ein Minimum zu
reduzieren. Nachfolgend ist ein Verfahren für die Entnahme von Zerivikalabstrichen bzw. von Urethralabstrichen bei Männern beschrieben.
VORSICHT: Bei der Entnahme und Handhabung von Proben für die Untersuchung auf Chlamydien bitte die Routineverfahren zur Biosicherheit
beachten. Betrachten Sie Proben und alle Materialien, die mit diesen
Proben in Berührung kommen, als potentiell infektiös und entsorgen Sie
sie in entsprechender Weise. Nicht mit dem Mund pipettieren. AerosolBildung vermeiden. Weitere Informationen zur Vermeidung von Laborinfektionen entnehmen Sie bitte dem Literaturhinweis 12.
41
Probenentnahme (Zervikalabstriche bei Frauen bzw. Urethralabstriche
bei Männern)
Benötigtes Material
1. Großer Tupfer zum Reinigung der Ektozervix vor der Entnahme der
Endozervikalprobe.
2. Sterile Abstrichtupfer
Nur Tupfer verwenden, die das Wachstum von Chlamydien oder von
Kulturzellen nicht hemmen.
3. Transportmedium
Nur ein Transportmedium verwenden, das das Wachstum von
Chlamydien oder Kulturzellen nicht hemmt.
Fo
Verfahren zur Probenentnahme
1. Urethralabstriche
efe
rR
HINWEIS: Für eine korrekte Diagnose muss die Probe Epithelzellen
vom Grund der Harnröhre enthalten. Diese Zellen sind am empfindlichsten für eine Chlamydia-Infektion. (Das Exsudat ist keine
geeignete Probe für die Labordiagnostik von Chlamydien.) (13)
Weisen Sie den Patienten an, 1 Stunde vor der Probenentnahme
nicht mehr zu urinieren.
ce
ren
a. Einen kleinen Abstrichtupfer 2-4 cm in die Harnröhre einführen.
(Den Tupfer beim Einführen leicht drehen.)
b. Den Tupfer vorsichtig drehen und dabei genügend Druck ausüben,
um Epithelzellen zu gewinnen.
c. Tupfer 1-2 Sekunden eingeführt lassen.
d. Den Tupfer herausziehen sofort in das Transportmedium geben und
an das Labor schicken. Die Probe kann bei 2-8°C bis zu 24
Stunden gelagert werden. Für eine längere Lagerung sollten die
Proben bei -70°C gelagert werden, bis die Kultur damit beimpft
wird.
eO
Us
nly
2. Zervikalabstriche
HINWEIS: Das Zylinderepithel der Zerivikalschleimhaut ist
besonders anfällig für eine Chlamydien-Infektion (13). Es befindet
sich unmittelbar hinter der Cervixöffnung.
Gelegentlich kann der Übergangsbereich zwischen Plattenepithel
und Zylinderepithel variieren. (14). Trotzdem kann die Entnahme
von Zylinderepithelzellen durch das folgende Vorgehen sichergestellt werden :
a. Mit einem grossen Tupfer die Portiooberfläche von überschüssigem
Schleim und Sekret reinigen. Den Tupfer entsorgen.
b. Einen sterilen Abstrichtupfer ca. 1-1½ cm in den Endozervikalkanal
einführen, bis sich die Spitze größtenteils in der Zervikalöffnung
befindet.
42
c. Das Stäbchen 5-10 Sekunden mit genügend Druck drehen, um
Zellen von allen Oberflächen des Endozervikalkanals zu gewinnen.
d. Das Stäbchen entnehmen, ohne die Vaginalwände zu berühren.
Das Stäbchen unverzüglich in das Transportmedium geben und an
das Labor schicken. Die Probe kann bei 2-8°C bis zu 24 Stunden
gelagert werden. Für eine längere Lagerung sollten die Proben bis
zur Beimpfung der Zellkultur bei -70°C eingefroren werden.
Aufbereitung von Zellkulturproben
Benötigtes Material
1. Zellkulturlinie
Eine für Chlamydia empfindliche Zellkulturlinie verwenden – z. B.:
McCoy-Zellen.
rR
Fo
HINWEIS: Die Auswahl und die Beschaffenheit der Zellkulturlinie
kann die Sensitivität des Chlamydien-Nachweises durch die Kulturbestätigungstechnik beeinflussen.
2. Zellkulturkontrollen
Negative Kontrolle – mit Transportmedium beimpfte Zellkultur.
Positive Kontrolle – mit einer für Chlamydia bekannt positiven
Probe beimpfte Zellkultur.
efe
•
•
ren
3. Weitere Materialien für die Zellkultur
•
ce
Zellkulturmedien,, Zellkulturflaschen oder Mikrotiterplatten, Zentrifuge, CO2-Inkubator, usw.
Zellkulturverfahren
1. Beimpfen Sie einen geeigneten Zellrasen mit der Probe, entsprechend
einer etablierten Methode.
Us
2. Inkubieren Sie den Zellrasen 48 Stunden.
eO
3. Falls erwünscht, eine Subkultur anlegen und diese weitere 48 Stunden
inkubieren.
nly
TESTDURCHFÜHRUNG
Mitgelieferte Reagenzien
1. (M)onoklonaler Antikörper für den Kulturbestätigungstest von Chlamydien.
Benötigtes, jedoch nicht mitgeliefertes Material
1. Methanol – für Histologie oder ACS.
2. Entionisiertes Wasser.
3. Pathfinder® Eindeckmittel – Bio-Rad Art. Nr. 30693.
4. Folie zum Abdecken der Mikrotiterplatte und Deckgläser (ca. 5 mm)
oder saubere Glasmikroskopobjektträger und Pinzette (je nach Kulturtechnik).
5. Sterile Pipetten.
43
6. Feuchte Kammer.
7. Fluoreszenzmikroskop – für die Beurteilung von mit FluoreszeinIsothiocyanat gefärbten Proben, ein Filtersystem mit einer Anregungswellenlänge von 480-490 nm und einem Fluoreszenzlicht von mindestens 510 nm verwenden. Der Typ und die Beschaffenheit der
Mikroskopfilter und der Lichtquelle können die Intensität der Fluoreszenzreaktion beeinflussen.
Durchführung der direkten Immunfluoreszenz
A. Mikrotiterplattentechnik
1. Fixieren des Zellrasenst
efe
rR
Fo
a. Das Kulturmedium vorsichtig aus jeder Vertiefung absaugen.
b. Ausreichend Methanol in jede Vertiefung geben, um den Zellrasen
vollständig damit zu bedecken. Bei Raumtemperatur (23°C ± 3°C)
10 Minuten fixieren.
c. Die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung mit einer Pipette absaugen oder
die Platte umdrehen und mit saugfähigem Papier abtupfen, um das
Methanol zu entfernen. Unverzüglich färben.
Wird die Färbung nicht sofort vorgenommen, sollten die Platten bei
-70°C gelagert werden.
2. Färben des Zellrasens
ren
ce
HINWEIS: Falls die Zellen ausgetrocknet sind, müssen sie vor dem
Färben mit entionisiertem Wasser angefeuchtet. werden (Die
Platte umdrehen und mit saugfähigem Papier abtupfen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.)
nly
eO
Us
a. 1 Tropfen (ca. 30 µL) des monoklonalen Antikörpers zum Nachweis
von Chlamydien in jede Vertiefung geben. Der Antikörper muss den
Zellrasen vollständig bedecken.
b. Die Platte abdecken und bei Raumtemperatur (23°C ± 3°C) 30
Minuten inkubieren. Die Platte während der Inkubation vor intensiver Lichteinwirkung schützen.
c. Die Abdeckung von der Platte nehmen und den monoklonalen Antikörper aus jeder Vertiefung entfernen, indem die Flüssigkeit
entweder mit einer Pipette abgesaugt oder die Platte umgedreht
und mit saugfähigem Papier abgetupft wird. Mit entionisiertem
Wasser spülen, um den restlichen Antikörper zu entfernen. Die
Platte erneut umdrehen und mit saugfähigem Papier abtupfen, um
überschüssiges Wasser zu entfernen.
d. 1 Tropfen Eindeckmittel in jede Vertiefung geben und Deckgläser
verwenden.
HINWEIS: Lediglich Pathfinder® Eindeckmittel Bio-Rad Art. Nr.
30693 verwenden.
3. Die Mikrotiterplatte umgekehrt unter einem Fluoreszenzmikroskop mit
einem Objektiv mit großer Brennweite untersuchen. Den gesamten
44
Zellrasen bei einer kleinsten Vergrößerung von 100x durchmustern und
fragliche Einschlüsse bei einer höheren Vergrößerung bestätigen.
Falls erforderlich können die Mikrotiterplatten bei 4°C lichtgeschützt
aufbewahrt und innerhalb von 24 Stunden abgelesen werden.
B. Kulturflaschentechnik (“Shell Vial Technique”)
1. Fixieren des Zellrasens
Fo
a. Das Kulturmedium vorsichtig aus jedem Fläschchen absaugen.
b. Genügend Methanol zusetzen, um die Zellmonolayer jeweils vollständig damit zu bedecken. Bei Raumtemperatur (23°C ± 3°C) 10
Minuten fixieren.
c. Das Methanol mit einer Pipette absaugen.
Wenn die Färbung nicht sofort erfolgen kann, sollten die
Fläschchen bei -70°C gelagert werden.
2. Färben des Zellrasens
rR
ce
ren
efe
a. Mit einer Pinzette das Deckglas mit dem Zellrasen vorsichtig aus
dem Fläschchen nehmen und auf einen entsprechend beschrifteten, sauberen Glasobjektträger mit den Zellen nach oben legen.
Unverzüglich färben.
HINWEIS: Falls die Zellen ausgetrocknet sind, diese mit entionisiertem Wasser anfeuchten. (Überschüssige Flüssigkeit
entfernen.)
b. 1 Tropfen (ca. 30 µL) des monoklonalen Pathfinder® Antikörpers zur
Kulturbestätigung von Chlamydien auf jeden Monolayer geben. Der
Antikörper muss den Zellrasen vollständig bedecken.
c. In einer feuchten Kasmmer bei Raumtemperatur (23°C ± 3°C) 30
Minuten inkubieren. Die Deckgläser während der Inkubation vor
intensiver Lichteinwirkung schützen.
d. Die Deckgläser mit entionisiertem Wasser spülen, um ungebundene
Antikörper zu entfernen. (Überschüssiges Wasser abtupfen.)
e. 1 Tropfen Eindeckmittel auf einen anderen, entsprechend beschrifteten, sauberen Objektträger geben. Mit dem Deckglas vorsichtig
abdecken, ohne Luftblasen einzuschließen (Zellschicht nach oben).
nly
eO
Us
3. Die Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Den
gesamten Zellrasen bei einer kleinsten Vergrößerung von 100x durchmustern. Fragliche Befunde mit einer höheren Vergrößerung bestätigen.
Falls erforderlich können die Objektträger bei 4°C lichtgeschützt aufbewahrt und innerhalb von 24 Stunden abgelesen werden.
HINWEIS: Lediglich Pathfinder® Eindeckmittel Bio-Rad rt. Nr.
30693 verwenden.
45
QUALITÄTSKONTROLLE
Um die korrekte Funktion des Kultursystems zu überprüfen, sollten bei
jeder Zellkultur mit Patientenproben, immer positive und negative Zellkulturkontrolle mitgetestet werden.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Zunächst die Kontrollproben ablesen. Die Zellkulturkontrollen sind für die
Interpretation der Ergebnisse hilfreich, da sie positive und negative Reaktionen auf der für die Patientenproben verwendeten Zelllinie anzeigen.
Weisen die Kontrollen eine korrekte Reaktivität auf, die Patientenproben
interpretieren. Den Test wiederholen, falls die Kontrollen nicht die
erwartete Reaktivität zeigen. Eine Beschreibung der positiven und negativen Ergebnisse folgt.
Fo
ce
ren
efe
rR
Positive Ergebnisse
Eine positive Kontrolle bzw. eine positive Patientenprobe weist bei einer
100-fachen Vergrößerung eine charakteristische Fluoreszenz der zytoplasmatischen Einschlüsse auf. Ein Einschluss erscheint als ein scharf umrissener apfelgrüner Fluoreszenzfleck im Zytoplasma und in unmittelbarer
Nähe des Zellkerns einer infizierten Zelle. Ein oder mehrere vorhandene
Einschlüsse pro Kultur werden als positiv betrachtet. Nicht- infizierte
Zellen, sowie der Hintergrund infizierter Zellen erscheinen wegen der
Gegenfärbung rot. Eine gelbe,weisse oder blaßgrüne Färbung, anstelle
einer apfelgrünen Fluoreszenzist ein Hinweis für eine nicht spezifische
Reaktion.
eO
Us
Negative Ergebnisse
Eine negative Probe zeigt keine spezifische apfelgrüne Fluoreszenz. Aufgrund der Gegenfärbung erscheinen alle Zellen rotgefärbt.Unspezifische
Verfärbungen sind dabei auf ein Minimum begrenzt.
GRENZEN DES VERFAHRENS
nly
1. Ein Austrocknen des Antikörpers auf der Auftragsstelle kann dazu
führen,dass evtl. Zelleinschlüsse nicht erkannt werden.
2. Die Leistung des Tests mit Patientenproben, die unter einer Antibiotikatherapie entnommen wurden, wurde nicht evaluiert.
3. Für den Nachweis von Chlamydien ist die korrekte Probenentnahme
von entscheidender Bedeutung. Fachpersonal, das Proben entnimmt,
sollte gut geschult sein, um das Auftreten ungeeigneter Proben auf ein
Minimum zu reduzieren.
4. Die Verwendung des monoklonalen Antikörpers zur Kulturbestätigung
von Chlamydien wird nicht für die Abarbeitung von Direktabstrichen
empfohlen. (Von Bio-Rad ist ein Chlamydia-Kit für den direkten Nachweis in Abstrichen erhältlich - Art. Nr. 30704.)
46
ERWARTETE WERTE
Die erwarteten Werte können je nach getesteter Population variieren. BioRad evaluierte 402 Proben von Patienten aus Populationen mit hohem und
niedrigem Infektionsrisiko mit dem Pathfinder® Chlamydia Kulturbestätigungstest und dem MicroTrak™ Kulturbestätigungstest. Alle nach der
Subkultur noch verbliebenen Diskrepanzen wurden mit dem ChlamydiaZellkulturassay von Ortho Diagnostics abgeklärt. Die Gesamtübereinstimmung zwischen beiden Tests lag nach Primärkultur bei 99,5% und nach
einer Passage bei 100,0%. Lediglich 1 in der Primärkultur negative Probe
war nach der Passage positiv. Im Vergleich zu Tests anderer Hersteller
lagen die Sensitivität und die Spezifität dieses Tests nach Primärkultur und
Passage bei 100,0%. (Siehe Abschnitt „Spezifische Leistungsmerkmale“
für weitere Informationen.)
Fo
SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE
ren
efe
rR
In drei unabhängigen Labors wurde die Eignung der Pathfinder®-Reagenzien, Chlamydien in Zellkulturen nachzuweisen, evaluiert. Zu den unabhängigen Labors dieser Studie zählten Labors im Osten, Süden und
Westen der USA. Der MicroTrak™ Kulturbestätigungstest von Syva wurde
als Referenzmethode und der Kit von Ortho Diagnostics zur Abklärung von
Diskrepanzen nach Passage verwendet.
ce
Von jedem Patienten wurde ein Endozervikal- bzw. Urethralabstrich entnommen und vor der Beimpfung einer Kultur in Transportmedium gegeben. In zwei Labors wurden 5 McCoy-Monolayer pro Patienten beimpft.
Nach 48-stündiger Inkubation der Kulturen wurden 2 dieser Monolayer
gefärbt, eine mit dem Pathfinder®-Reagenz und eine mit dem
MicroTrak™-Reagenz. Bei den Kulturen mit negativem oder nicht übereinstimmendem Ergebnis in der Primärkultur wurden die übrigen 3 Kulturen
abgebrochen und auf drei weiteren Zellrasen subkultiviert.. Nach der
nächsten 48-stündigen Inkubation wurden wiederum 2 dieser Monolayer
gefärbt, eine mit dem Pathfinder®-Reagenz und die andere mit dem
MicroTrak™-Reagenz. Falls erforderlich wurde die übrige Passagekultur
zur Abklärung von Diskrepanzen mit dem Reagenz von Ortho Diagnostics
getestet. Das 3. Labor beimpfte 3 Monolayer pro Patient und ging wie
oben beschrieben vor, mit dem Unterschied, dass die noch verbleibende
Kultur gegebenenfalls abgebrochen und auf weiteren drei Monolayern
subkultiviert wurde.
nly
eO
Us
Kulturen mit mindestens einem Einschluss nach der Primärinkubation oder
nach Unterbrechung und Passage wurden als positiv betrachtet.
Es wurden Proben von 2 Populationen mit hohem bzw. niedrigem Infektionsrisiko entnommen. Zu der Population mit hohem Infektionsrisiko
zählten Frauen und Männer einer Klinik für Geschlechtskrankheiten, die
Symptome im Urogenitalbereich aufwiesen oder asymptomatisch in Kontakt mit Personen mit Geschlechtskrankheiten standen. Die Gesamtprävalenz von Chlamydia in dieser Population lag bei 23,5%. Zu der
47
Population mit geringem Risiko zählten Frauen, die Kliniken zu gynäkologischen oder Geburtsroutineuntersuchungen aufsuchten oder folgende
Kriterien erfüllten:
1) über 25 Jahre alt; 2) keine Anzeichen für eitrigen Zervikalausfluss, Zervixektopie oder leichte Verletzbarkeit der Zervix bei Probeentnahmeverfahren und 3) keinen Kontakt zu Personen mit sexuell übertragbaren
Erkrankungen oder Erregern. Die Gesamtprävalenz von Chlamydia in
dieser Population lag bei 10,0%.
In Tabelle 1 sind die Leistungsmerkmale des Pathfinder® Kulturbestätigungstests im Vergleich zu Assays anderer Hersteller nach Primärkultur
und Passage detailliert angegeben.
Tabelle 1 - Vergleich des Pathfinder® Kulturbestätigungstests zu Tests anderer
Hersteller nach Primärkultur und Passage
Population
mit geringem
Risiko
302
efe
rR
Fo
n
Population
mit hohem
Risiko
100
Sensitivität
EP
EP + FN
Spezifität
EN
EN + FP
100,0%
231
231
Positiver
Vorhersagewert
EP
EP + FP
100,0%
71
71
Negativer
Vorhersagewert
EN
EN + FN
100,0%
231
231
100,0%
71
71
Insgesamt
(Population mit
hohem und
geringem Risiko)
402
100,0%
10
10
ce
ren
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
100,0%
10
10
100,0%
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
Us
100,0%
HINWEIS: EP = echt-positiv, FP = falsch-positiv, FN = falsch-negativ, EN = echt-negativ
nly
eO
48
In Tabelle 2 sind die Daten des Vergleiches des Pathfinder® Kulturbestätigungsreagenzes mit dem MicroTrak™ Reagenz lediglich nach Primärkultur angegeben.
Tabelle 2 - Vergleich des Pathfinder® Kulturbestätigungsreagenzes mit dem
MicroTrak™ Assay lediglich nach Primärkultur
Population
mit hohem
Risiko
n
Population
mit geringem
Risiko
302
100
Insgesamt
(Population mit
hohem und
geringem Risiko)
402
EP
EP + FN
100,0%
69
69
100,0%
9
9
100,0%
78
78
Spezifität
EN
EN + FP
99,6%
232*
233
98,9%
90*
91
99,4%
322*
324
Positiver
Vorhersagewert
EP
EP + FP
98,6%
Negativer
Vorhersagewert
EN
EN + FN
rR
Fo
Sensitivität
100,0%
69*
70
232
232
90,0%
100,0%
9*
10
90
90
97,5%
100,0%
78*
80
322
322
efe
ren
* Zwei auf Primärkultur im Pathfinder®-Test positive und im MicroTrak™-Test negative
Proben waren sowohl mit MicroTrak™ als auch mit der Ortho-Methode nach Passage
positiv. Werden diese Proben als richtig positiv betrachtet, liegen die Spezifität und der
positive Vorhersagewert für die Populationen mit hohem und geringem Risiko und für die
Gesamtpopulation bei 100%.
ce
Die Leistungsmerkmale für die Populationen der Männer und Frauen mit
hohem Risiko sind vergleichbar.
nly
eO
Us
In Tabelle 3 sind die Zahlen der positiven Ergebnisse nach Primärkultur
sowie nach Primärkultur und Passage angegeben. Das Pathfinder®Reagenz wies 2,5% mehr positive Ergebnisse auf Primärkultur nach als
das MicroTrak™-Reagenz. Durch Verwendung des Pathfinder®-Assays
mit Passage wurden 1,2% mehr positive Ergebnisse als mit einer
Primärkultur allein erzielt.
Tabelle 3 – Chlamydia-Nachweis auf Primärkultur und nach Primärkultur und
Passage
Primär-kultur
Passage
Pathfinder®
80
81
Positiv im MicroTrak™
78
80
Positiv im
KREUZREAKTIVITÄT
Bei Bio-Rad wurden die in Tabelle 4 angegebenen Organismen auf eine
mögliche Kreuzreaktivität im Pathfinder® Chlamydia-Kulturbestätigungsassay getestet. Die angegebenen Organismen wurden auf fixierten Sub-
49
stratobjektträgern getestet und wiesen keine Kreuzreaktivität mit dem
monoklonalen Pathfinder®-Antikörper auf.
Tabelle 4 - Kreuzreaktivitätsstudie mit für Zellkulturen potentiell kontaminierenden
Substanzen
Reaktivität mit dem
Chlamydia-Antikörper zur
Kulturbestätigung
Organismus
Herpes viren
Zytomegalievirus
Negativ
Herpes simplex Typ I
Negativ
Herpes simplex Typ II
Negativ
Varicella-Zoster-Virus
Negativ
Negativ
Mycoplasma arginini
Negativ
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma salivarium
Negativ
Negativ
efe
Mycoplasma orale
rR
Fo
Acholeplasma laidlawii
Negativ
Negativ
ce
ren
nly
eO
Us
50
Pathfinder® Chlamydia Sistema di
conferma mediante coltura 30701
Per l’identificazione della Clamidia nelle colture cellulari
mediante fluorescenza diretta.
rR
Fo
SCOPO DEL TEST
efe
Il sistema di conferma mediante coltura Pathfinder® Chlamydia è un test di
identificazione della Clamidia in colture cellulari mediante fluorescenza
diretta.
ren
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE
ce
La Clamidia è un organismo che si presume essere l'agente causale di
un'ampia varietà di problemi di salute. Sono state identificate due specie di
Clamidia: Chlamydia trachomatis e Chlamydia psittaci. Quest'ultima specie
di Clamidia infetta soprattutto gli uccelli, tuttavia anche nell'uomo possono
svilupparsi patologie come la polmonite o infezioni generalizzate, in seguito
a esposizione ad una specie aviaria infettata. Generalmente la Chlamydia
trachomatis provoca infezioni soltanto nell'uomo. Le sindromi cliniche associate con maggiore frequenza ad un'infezione da Chlamydia trachomatis
sono: congiuntivite a inclusioni, tracoma, uretrite, cervicite e altri disturbi
delle vie urogenitali, oltre al linfogranuloma venereo (LGV) (1). La Chlamydia
trachomatis può trasmettersi per contatto sessuale con una persona infetta,
per passaggio al feto durante il parto o, nel caso del tracoma nei paesi in via
di sviluppo, soprattutto per contatto non sessuale tra due persone (2).
nly
eO
Us
La Chlamydia trachomatis è attualmente riconosciuta come causa principale di malattie sessualmente trasmissibili. Purtroppo, in molti casi l'infezione è asintomatica nelle persone che ne sono infettate, permettendo
all'organismo di passare inosservato (3). Nella donna, le infezioni genitali
non diagnosticate possono compromettere in modo definitivo le capacità
riproduttive a causa di complicanze come la salpingite o la pelviperitonite
(4, 5). La Chlamydia trachomatis è altresì causa del tracoma, la prima
causa di cecità nel mondo, una forma di cecità che può essere prevenuta
(6). La diagnosi precoce di tali infezioni da Clamidia può aiutare a intervenire in tempo sulla malattia, riducendo il rischio di complicanze e di trasmissione futura.
51
I primi metodi di isolamento della Clamidia si basavano sulla coltura in
sacche vitelline di embrioni di topo o pollo. Con il perfezionamento dei
metodi di coltura tissutali, questi ultimi hanno sostituito le tecniche precedenti, meno pratiche (7, 8). L’impiego della tecnologia dell’immunofluorescenza e degli anticorpi monoclonali nell’individuazione degli organismi
nelle colture tissutali ha ulteriormente migliorato la sensibilità dei test
basati su coltura Clamidia e ridotto l'esigenza di eseguire un ulteriore passaggio su tutti i campioni (9).
PRINCIPI DEL METODO
rR
Fo
Il sistema Pathfinder® si basa sull’utilizzo di un anticorpo monoclonale
coniugato con fluoresceina per identificare le inclusioni di Clamidia nelle
cellule in colture inoculate con campioni potenzialmente infettati. Questo
test combina la specificità e la riproducibilità degli anticorpi monoclonali
alla rapidità e alla semplicità di un test mediante fluorescenza diretta. Per
la rivelazione della Clamidia nelle colture di cellule, questo test costituisce
un'alternativa semplice e sensibile ad altri metodi di colorazione.
ren
efe
Il presente test utilizza un anticorpo monoclonale coniugato con fluoresceina allo scopo di identificare la Clamidia in colture cellulari. L'anticorpo
reagisce con la frazione lipopolisaccaridica dei corpi elementari e dei corpi
reticolari presenti nelle inclusioni. Questo dosaggio rileverà tutti i sierotipi
conosciuti di Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci e Chlamydia
pneumoniae. Non differenzia tra specie e sierotipi.
ce
L'anticorpo monoclonale reagisce con gli antigeni della Clamidia, se presenti, nella coltura cellulare. Una fase di lavaggio permette di eliminare
l'anticorpo non legato. Visti al microscopio in fluorescenza, i campioni di
coltura cellulare infettati dalla Clamidia presentano una fluorescenza color
verde mela caratteristica delle inclusioni, su un fondo con colore di contrasto rosso.
eO
Us
KIT DI REAGENTI
Per uso diagnostico in vitro.
•
Conservare l'anticorpo ad una temperatura compresa tra 2°C e 8°C.
•
Anticorpo Monoclonale è stabili fino alla data di scadenza indicata
sull'etichetta se conservati attenendosi alle raccomandazioni.
•
Una volta aperti, Anticorpo Monoclonale è stabili fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta se conservati attenendosi alle raccomandazioni.
nly
•
1. Anticorpo Monoclonale per la conferma della presenza di Clamidia
nelle colture cellulari.
Il flacone contiene 4,2 mL di una soluzione di anticorpo monoclonale
murino anti-Clamidia (specifico del genere) coniugato con fluoresceina.
La soluzione contiene inoltre un agente stabilizzante delle proteine, un
colorante di contrasto Blu Evans e lo 0,1% di sodio azide. La soluzione
52
di anticorpo è pronta per l'uso. Qualunque ulteriore diluizione ridurrebbe la sensibilità del test.
Di seguito sono indicati i segni di un possibile deterioramento del prodotto:
•
•
Intensificazione della colorazione verde del fondo dei campioni di
controllo.
Alterata reattività dei controlli positivi e negativi, rispetto a quella
attesa.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI PER L’USO
Riservato esclusivamente ad uso professionale
Xn. Nocivo
efe
rR
Fo
Reagenti contenenti sodio azide
Il reagente contiene lo 0,1% di sodio azide. La sodio azide potrebbe reagire con il piombo o il rame presente nelle tubature di scarico e produrre di
conseguenza azoturi metallici altamente esplosivi. Al momento dell'eliminazione dei liquidi, sciacquare abbondantemente con acqua al fine di evitare l'accumulo di azoturi. Per maggiori informazioni, fare riferimento al
Manuale pubblicato dal CDC (Center for Disease Control). (10).
ce
ren
R: 21/22
Nocivo a contatto con la pelle e per ingestione.
S: 24/25-28-36/37/39
Evitare il contatto con gli occhi e con la pelle. In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua. Usare indumenti protettivi, guanti e
protezioni adatte per gli occhi e il viso.
nly
eO
Us
Campioni paziente
Durante il prelievo e il trattamento dei campioni paziente, si raccomanda
di manipolare questi materiali come potenzialmente infettivi, secondo le
precauzioni internazionali e le buone pratiche di laboratorio, indipendentemente dalla loro origine, trattamento o precedente certificazione. Impiegare un disinfettante adeguato per la decontaminazione. Conservare ed
eliminare i suddetti materiali ed i loro contenitori in ottemperanza alle regolamentazioni e alle linee guida localmente in vigore.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il prelievo dei campioni rappresenta una fase critica per la rivelazione della
Clamidia (11). Il personale incaricato della raccolta dei campioni deve
essere pienamente qualificato al fine di ridurre al minimo il rischio di prelevare campioni insufficienti o inadeguati. Di seguito è descritta una procedura consigliata per il prelievo dei campioni dal collo dell'utero e
dall'uretere nell'uomo.
ATTENZIONE: Durante il prelievo e il trattamento dei campioni destinati
alla rivelazione della Clamidia, attenersi alle norme di sicurezza biologica
di routine. Considerare i campioni e tutti i materiali con cui vengono in
53
contatto come potenzialmente infettivi ed eliminarli secondo le procedure
stabilite. Non pipettare con la bocca. Evitare la formazione di aerosol.
Consultare la nota 12 della bibliografia per maggiori informazioni sulla prevenzione delle infezioni in laboratorio.
Raccolta dei campioni (campioni del collo dell’utero e dell’uretra
maschile)
Materiale necessario
1. Tampone formato grande per pulire l’area esocervicale prima del prelievo di un campione endocervicale.
2. Tamponi sterili
Utilizzare tamponi che non inibiscano la proliferazione della Clamidia o
delle cellule in coltura.
Fo
3. Mezzo di trasporto
rR
Utilizzare un terreno di coltura che non inibisca la proliferazione della
Clamidia o delle cellule in coltura.
Raccolta dei campioni: procedura operativa
1. Campioni uretrali
efe
ce
ren
NOTA: Per una diagnosi precisa, il campione deve contenere cellule epiteliali provenienti dalla mucosa uretrale. Queste cellule
sono le più sensibili all'infezione da Clamidia. (L'essudato non
costituisce un campione adatto per il test della Clamidia in laboratorio). (13)
Ordinare al paziente di astenersi dall'urinare nell'ora precedente il
prelievo.
nly
eO
Us
a. Inserire un piccolo tampone all’interno dell’uretra fino ad una profondità di 2 - 4 cm. (L'inserimento sarà facilitato imprimendo al tampone un leggero movimento di rotazione).
b. Imprimere al tampone un movimento di rotazione esercitando una
pressione sufficiente a prelevaredelle cellule epiteliali.
c. Tenere fermo il tampone per 1 - 2 secondi.
d. Ritirare il tampone, metterlo immediatamente nel mezzo di
trasporto e inviarlo al laboratorio. Il campione può essere conservato ad una temperatura di 2-8°C per 24 ore al massimo. Per una
maggiore durata di conservazione, congelare a -70°C fino al
momento dell'inoculazione.
2. Campioni cervicali
NOTA: Le cellule epiteliali cilindriche della mucosa cervicale sono
le più sensibili all'infezione da Clamidia (13). Dette cellule cilindriche si trovano appena oltre l'orifizio del collo dell'utero.
In certi casi lo stato della zona di transizione, dove termina l'epitelio stratificato e comincia l'epitelio cilindrico, può variare. Il ris-
54
petto della seguente procedura garantirà che i campioni siano
sufficienti e adeguati.
rR
Fo
a. Eliminare l’eccesso di muco e di essudato dalla zona esocervicale
servendosi di un tampone di formato grande. Eliminare il tampone.
b. Inserire un tampone sterile nel canale endocervicale ad una profondità di circa 1 - 1,5 cm finché la maggior parte del tampone abbia
superato l'orifizio del collo dell'utero.
c. Imprimere una rotazione al tampone per 5 - 10 secondi esercitando
una pressione sufficiente a raccogliere delle cellule provenienti da
tutte le pareti del canale endocervicale.
d. Estrarre il tampone evitando qualunque contatto con le mucose
vaginali. Metterlo immediatamente nel mezzo di trasporto e inviarlo
al laboratorio. Il campione può essere conservato ad una temperatura di 2-8°C per 24 ore al massimo. Per una maggiore durata di
conservazione, congelare il campione a -70°C fino all'inoculazione
nella coltura cellulare.
efe
Trattamento dei campioni destinati alla coltura cellulare
Materiale necessario
1. Linea di cellule
ren
Utilizzare una linea di cellule sensibile alla Clamidia, ad esempio le
cellule McCoy.
2. Colture cellulari di controllo
Controllo negativo - coltura cellulare inoculata con il solo mezzo di
trasporto.
Controllo positivo - coltura cellulare inoculata con un campione
positivo per la Clamidia.
eO
•
Us
•
ce
NOTA: La scelta e lo stato della linea di cellule di coltura possono
influire sulla sensibilità della tecnica di rivelazione della Clamidia
mediante coltura di conferma.
3. Materiale e apparecchiature aggiuntive per la coltura di cellule
nly
•
Terreno di coltura, flaconi, piastre per microtitolazione, centrifuga,
incubatore ad atmosfera di CO2 controllata, ecc.
Procedura di esecuzione della coltura
1. Inoculare il campione su di una coltura monostrato seguendo un
metodo stabilito.
2. Incubare il monostrato cellulare per 48 ore.
3. Se si desidera, incubare per altre 48 ore.
55
PROCEDURA DI ANALISI
Materiale fornito
1. Anticorpo monoclonale anti-Clamidia.
Materiale necessario, ma non fornito
1. Fissativo: metanolo di qualità istologica o grado analitico.
2. Acqua deionizata.
3. Mezzo montante Pathfinder® – N. di catalogo Bio-Rad: 30693.
4. Piastra di microtitolazione per microscopia con vetrini adatti (diametro
5 mm) o vetrini da microscopio e pinzette (secondo la tecnica di coltura adottata).
5. Pipette sterili.
Fo
6. Camera di umidificazione.
efe
rR
7. Microscopio in fluorescenza - Per visualizzare i campioni colorati con
isotiocianato di fluoresceina, utilizzare un sistema di filtri che consenta
una lunghezza d'onda di eccitazione pari a 480-490 nm e una lunghezza d'onda di emissione uguale o superiore a 510 nm. Il tipo e lo
stato dei filtri, così come la fonte luminosa, possono influenzare l'intensità della reazione fluorescente.
ce
ren
Procedura di colorazione della coltura cellulare mediante fluorescenza
A. Tecnica di coltura su piastra di microtitolazione
1. Fissazione dello strato di cellule
a. Aspirare con cautela il mezzo di coltura da ciascun pozzetto.
Us
b. Aggiungere metanolo a sufficienza per coprire il monostrato cellulare in ciascun pozzetto. Fissare per 10 minuti a temperatura
ambiente (23°C ± 3°C).
eO
c. Aspirare il liquido da ciascun pozzetto con una pipetta o rovesciare la piastra e tamponare con carta assorbente al fine di eliminare il metanolo. Colorare immediatamente.
2. Colorazione del monostrato cellulare
nly
Se la colorazione non viene effettuata nell'immediato, conservare le piastre a -70°C.
NOTA: Se le cellule risultano asciutte, prima di procedere alla
colorazione umettare con acqua deionizzata. (Rovesciare la
piastra e assorbire il liquido in eccesso).
a. Dispensare 1 goccia (circa 30 µL) di anticorpo monoclonale antiClamidia in ciascun pozzetto. La soluzione di anticorpo deve
ricoprire tutto il monostrato cellulare.
b. Coprire la piastra e incubare a temperatura ambiente
(23°C ± 3°C) per 30 minuti. Durante l'incubazione, tenere la
piastra al riparo dalla luce intensa.
56
c. Scoprire la piastra ed eliminare l’anticorpo monoclonale dai
pozzetti aspirando il liquido con la pipetta o rovesciando la piastra su carta assorbente. Sciacquare con acqua deionizzata per
eliminare gli anticorpi residui. Rovesciare la piastra e blottare su
carta assorbente per eliminare l’eccesso di acqua.
d. Dispensare 1 goccia di mezzo montante in ciascun pozzetto e
ricoprire con un vetrino.
NOTA: Utilizzare esclusivamente il mezzo montante Pathfinder®, N. di catalogo Bio-Rad 30693
Fo
3. Rivoltare la piastra per microtitolazione ed esaminare i pozzetti al
microscopio in fluorescenza utilizzando un obiettivo a lente focale
lunga. Esaminare tutto il monostrato cellulare con un ingrandimento
di almeno 100 X. Se la presenza di corpi di inclusione è dubbia,
confermarla ingrandendo ulteriormente.
efe
rR
Se necessario, le piastre per microtitolazione possono essere conservate al riparo dalla luce ad una temperatura di 4°C, ma devono
essere esaminate entro le 24 ore successive.
B. Tecnica di coltura in flacone
1. Fissazione del monostrato cellulare
ren
a. Aspirare con precauzione il terreno di coltura in ciascun flacone.
ce
b. Aggiungere una quantità di metanolo sufficiente a coprire lo
strato di cellule in ciascun flacone. Fissare per 10 minuti a temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
c. Eliminare il metanolo mediante aspirazione con la pipetta.
Us
Se la colorazione non viene effettuata nell'immediato, conservare i flaconi a -70°C.
eO
2. Colorazione del monostrato cellulare
nly
a. Servendosi di una pinzetta, estrarre con cautela dal flacone il
vetrino con il monostrato di cellule e posarlo su un vetrino pulito,
adeguatamente etichettato, tenendo la faccia contenente le cellule rivolte verso l'alto. Colorare immediatamente.
NOTA: Se le cellule risultano asciutte, umettare con acqua
deionizzata. (Successivamente eliminare il liquido in
eccesso).
b. Dispensare 1 goccia (circa 30 µL) della soluzione di anticorpo
monoclonale Pathfinder® sullo strato di cellule. La soluzione di
anticorpo deve ricoprire completamente lo strato di cellule.
c. Incubare in una camera di umidificazione a temperatura ambiente (23°C ± 3°C) per 30 minuti. Durante l'incubazione, tenere i
vetrini al riparo da fonti di luce intensa.
57
d. Sciacquare il vetrino con acqua deionizzata per eliminare gli
anticorpi non legati. (Assorbire l’eccesso di acqua).
e. Dispensare una goccia di mezzo montante su un vetrino pulito,
adeguatamente etichettato. Deporvi con cautela il vetrino con lo
strato di cellule rivolto verso il basso, evitando di formare bolle
d’aria.
3. Esaminare tutto il monostrato cellulare con un ingrandimento di
almeno 100 X. Se la presenza di corpi di inclusione è dubbia, confermarla ingrandendo ulteriormente.
Fo
Se necessario, i vetrini possono essere conservati al riparo dalla
luce ad una temperatura di 4°C, ma devono essere esaminati al
massimo entro le 24 ore successive.
NOTA: Utilizzare esclusivamente il mezzo montante Pathfinder® di Bio-Rad N. di Catalogo 30693
rR
CONTROLLO DI QUALITÀ
efe
In ciascuna serie di colture di campioni pazienti includere una coltura di
controllo negativa ed una positiva. al fine di verificare le prestazioni del
sistema di coltura, della tecnica mediante fluorescenza e del microscopio.
ren
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
ce
Esaminare prima di tutto i campioni di controllo. Le colture cellulari di controllo favoriscono l’interpretazione dei risultati evidenziando le reazioni
positiva e negativa sulla linea di cellule utilizzate per i campioni paziente.
Se la reattività dei controlli è conforme all’atteso, passare all'interpretazione dei campioni paziente. In caso di reazione inadeguata dei controlli,
ripetere il test. Di seguito sono descritte in modo dettagliato le reazioni
positiva e negativa.
eO
Us
nly
Risultati positivI
Un controllo o un campione paziente positivi presenteranno inclusioni citoplasmatiche fluorescenti caratteristiche visibili con un ingrandimento di
100 X. L'inclusione appare come una massa fluorescente ben definita, di
colore verde mela, all'interno del citoplasma della cellula infettata, in prossimità del nucleo. La presenza di una o più inclusioni in una coltura determina un risultato positivo. Il colorante di contrasto colora di rosso le cellule
non infettate e il fondo delle cellule infettate. La colorazione non specifica
si distingue per una tinta gialla, bianca o verde spento piuttosto che verde
mela.
Risultati negativi
Un campione negativo non presenterà alcuna fluorescenza color verde
mela specifica. Tutte le cellule verranno colorate di rosso dal colorante di
contrasto. La colorazione non specifica è minima.
58
LIMITAZIONI
1. La visualizzazione delle inclusioni può risultare difficile se l'anticorpo si
essicca sul monostrato cellulare.
2. Non sono note le prestazioni di questo test su campioni prelevati da
pazienti sottoposti a trattamento antimicrobico.
3. Per individuare la Clamidia, il prelievo dei campioni deve essere eseguito rigorosamente nel rispetto delle regole. Il personale incaricato
della raccolta dei campioni deve essere pienamente qualificato al fine
di ridurre al minimo il rischio di prelevare campioni insufficienti o inadeguati.
RISULTATI ATTESI
rR
Fo
4. Si sconsiglia l'uso dell'anticorpo monoclonale anti-Clamidia destinato
all'analisi delle colture di conferma su campioni clinici diretti. (Bio-Rad
propone un kit appositamente concepito per la rivelazione della Clamidia nei campioni diretti - N. di catalogo 30704).
ce
ren
efe
I risultati attesi possono variare secondo la popolazione di pazienti sottoposti a test. Bio-Rad ha sottoposto ai test di conferma mediante coltura
Pathfinder® e MicroTrak™ 402 campioni prelevati da pazienti provenienti
da una popolazione ad alto e basso rischio. Le discordanze presenti dopo
un passaggio sono state eliminate mediante il test della Clamidia su coltura cellulare Ortho Diagnostics. La concordanza globale tra i due test è
risultata pari al 99,5% per le colture primarie e al 100,0% per le colture
secondarie. Solo 1 campione, risultato negativo per la coltura primaria, è
risultato positivo dopo un passaggio. In confronto con i test concorrenti, la
sensibilità e la specificità del test Pathfinder® risultavano entrambe pari al
100,0% per le colture primarie e secondarie. (Fare riferimento alla sezione
Caratteristiche specifiche delle prestazioni per maggiori informazioni).
eO
Us
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PRESTAZIONI
nly
Tre laboratori indipendenti hanno valutato la capacità del reagente Pathfinder® di individuare la Clamidia nelle colture cellulari. I tre siti di studio
indipendenti si trovavano uno nell’Est, uno nel Sud e il terzo nell’Ovest
degli Stati uniti. Il test di conferma su coltura MicroTrak™ di Syva è stato
utilizzato come metodo di riferimento e il kit commercializzato da Ortho
Diagnostics è stato utile per risolvere le eventuali discordanze tra i risultati
dopo un passaggio.
I ricercatori hanno raccolto uno striscio endocervicale o uno striscio uretrale da ciascun paziente e posto il tampone nel mezzo di trasporto in
vista dell'inoculo in una coltura cellulare. Due ricercatori hanno inoculato 5
colture monostrato di cellule McCoy per ciascun paziente. Dopo 48 ore di
incubazione, due delle colture sono state colorate, una con il reagente
Pathfinder®, l'altra con il reagente MicroTrak™. Per le colture che davano
esiti negativi o discordanti per le colture primarie, le altre 3 colture sono
state frazionate e trasferite in altre 3 colture monostrato. Dopo ulteriori 48
59
ore di incubazione, i ricercatori hanno proceduto nuovamente alla colorazione di 2 delle colture monostrato, una con il reagente Pathfinder®,
l'altra con il reagente MicroTrak™. Laddove necessario, la restante coltura
secondaria è stata testata con il reagente di Ortho Diagnostics al fine di
risolvere le eventuali discordanze. Il terzo ricercatore ha inoculato 3
monostrati per paziente e proceduto come sopra, ad eccezione per il fatto
che, se necessario, il monostrato cellulare iniziale rimanente veniva frazionato in tre nuovi monostrati. i.
Le colture che comportano almeno 1 inclusione dopo l'incubazione primaria o dopo il frazionamento e il primo passaggio erano considerate positive.
ren
efe
rR
Fo
I campioni provenivano da due diverse popolazioni di pazienti, una ad alto
rischio e una a basso rischio. La popolazione ad alto rischio era composta
da uomini e donne che si erano rivolti a cliniche specializzate in malattie
sessualmente trasmissibili e presentavano sintomi a livello urogenitale,
oppure uomini e donne asintomatici che avevano avuto contatti con pazienti portatori di una malattia sessualmente trasmissibile. La prevalenza
globale della Clamidia in questa popolazione è risultata pari al 23,5%. La
popolazione a basso rischio era composta di donne in consulenza per
esami ostetrici o ginecologici di routine, oppure che rispondevano ai seguenti criteri:
ce
1) età superiore ai 25 anni; 2) nessun segno di perdite cervicali purulente,
di ectopia cervicale o di fragilità della cervice uterina; e 3) nessun contatto
con un paziente portatore di una sindrome o di un agente patogeno associato ad una malattia sessualmente trasmissibile. La prevalenza globale
della Clamidia in questa popolazione è risultata pari al 10,0%.
nly
eO
Us
60
Le caratteristiche delle prestazioni del Test di Conferma su coltura Pathfinder® dopo una coltura primaria e secondaria sono indicate in dettaglio
nella Tabella 1, per confronto con il test concorrente.
Tabella 1 - Confronto tra il Test di Conferma su coltura Pathfinder® e il test
concorrente, in seguito a coltura primaria e secondaria.
Popolazione ad
alto rischio
n
Popolazione a
basso rischio
302
100
Totale
(Popolazione
ad alto rischio e
a basso rischio)
402
VP
VP + FN
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Specificità
VN
VN + FP
100,0%
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
Valore
predittivo
positivo
VP
VP + FP
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Valore
predittivo
negativo
VN
VN + FN
100,0%
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
efe
rR
Fo
Sensibilità
ren
NOTA: VP = vero positivo, FP = falso positivo, FN = falso negativo, VN = vero negativo
La Tabella 2 riepiloga i dati confrontando il Reagente Pathfinder® e il
Reagente MicroTrak™ soltanto su colture primarie
ce
Tabella 2 - Confronto tra il Reagente Pathfinder® e il Reagente MicroTrak™ soltanto
su colture primarie
302
Popolazione a
basso rischio
eO
n
Us
Popolazione ad
alto rischio
100
Sensibilità
VP
VP + FN
100,0%
69
69
100,0%
Specificità
VN
VN + FP
99,6%
232*
233
98,9%
Valore
predittivo
positivo
VP
VP + FP
98,6%
69*
70
Valore
predittivo
negativo
VN
VN + FN
100,0%
232
232
Totale
(Popolazione ad
alto rischio e a
basso rischio)
402
100,0%
78
78
90*
91
99,4%
322*
324
90,0%
9*
10
97,5%
78*
80
100,0%
90
90
100,0%
322
322
nly
9
9
*Due campioni positivi secondo il test Pathfinder® e negativi secondo il test MicroTrak™
in seguito a coltura primaria hanno dato risultati positivi dopo il primo passaggio sia con il
test MicroTrak™ sia con il metodo Ortho Diagnostics. Considerando che detti campioni
sono veri positivi, la specificità e il valore predittivo positivo del test Pathfinder® raggiungono il 100% per le popolazioni ad alto rischio, a basso rischio e per l’insieme delle due
popolazioni.
61
Le caratteristiche delle prestazioni sono risultate comparabili per gli
uomini e le donne della popolazione ad alto rischio. La Tabella 3 espone in
dettaglio il numero dei risultati positivi ottenuti in seguito a colture primarie
e secondarie. Il reagente Pathfinder® ha permesso di rivelare il 2,5% in più
di risultati positivi rispetto al reagente MicroTrak™ tra le colture primarie.
L'impiego del test Pathfinder® su colture secondarie ha prodotto l’1,2% in
più di risultati positivi rispetto alle colture primarie.
Tabella 3 - Rivelazione della Clamidia in colture primarie e secondarie
Coltura
primaria
Coltura
secondaria
Positivi con Pathfinder®
80
81
Positivi con MicroTrak™
78
80
rR
Fo
REATTIVITÀ CROCIATA
efe
Bio-Rad ha testato con il reagente Pathfinder® la reattività crociata degli
organismi indicati nella Tabella 4. Gli organismi citati sono stati testati su
vetrini con substrato fissato e non hanno evidenziato alcuna reattività crociata rispetto all'anticorpo monoclonale Pathfinder®.
ren
Tabella 4 - Studi della reattività crociata di potenziali
contaminanti delle colture cellulari rispetto all'anticorpo
Herpes virus
Reattività crociata con
l'anticorpo monoclonale
anti-Clamidia
ce
Organismo
Us
Cytomégalovirus
Negativo
Herpes simplex Type I
Negativo
eO
Herpes simplex Type II
Negativo
Varicella zoster Virus
Negativo
nly
Acholeplasma laidlawii
Negativo
Mycoplasma arginini
Negativo
Mycoplasma hominis
Negativo
Mycoplasma hyorhinis
Negativo
Mycoplasma orale
Negativo
Mycoplasma salivarium
Negativo
62
Pathfinder® Chlamydia Sistema de
Confirmação em Cultura
30701
Para identificação de Chlamydia em culturas celulares
por fluorescência directa.
Fo
rR
DOMÍNIO DE APLICAÇÃO
efe
O sistema de confirmação em cultura Pathfinder® Chlamydia é um teste
de identificação da Chlamydia em culturas celulares por fluorescência
directa.
ren
RESUMO E EXPLICAÇÃO
ce
A Chlamydia é um organismo que pode considerar-se suspeito de ser o
agente causal de uma vasta série de problemas de saúde. Duas espécies
de Chlamydia foram identificadas: Chlamydia trachomatis e Chlamydia
psittaci. Esta última espécie de Chlamydia infecta principalmente as aves.
No entanto, os seres humanos podem desenvolver doenças, tais como
pneumonia ou uma infecção generalizada, no seguimento de uma
exposição a uma espécie de aviário infectada. A Chlamydia trachomatis
afecta geralmente apenas o ser humano. Os síndromas clínicos mais frequentemente associados a uma infecção por Chlamydia trachomatis compreendem a conjuntivite de inclusão; tracoma; uretrite; cervicite e outros
distúrbios das vias urogenitais; e linfogranuloma venéreo (LGV) (1). A
Chlamydia trachomatis pode transmitir-se por contacto sexual com uma
pessoa infectada, por transmissão ao feto durante o parto ou, no caso do
tracoma nos países em desenvolvimento, principalmente por contacto
não sexual entre duas pessoas (2).
nly
eO
Us
Chlamydia trachomatis é actualmente reconhecida como a primeira causa
de doença sexualmente transmissível. Infelizmente, muitos indivíduos
infectados permanecem assintomáticos, o que permite que este organismo passe despercebido (3). Na mulher, as infecções genitais não diagnosticadas podem comprometer, de forma definitiva, as capacidades
reprodutoras devido a complicações como a salpingite ou a pelviperitonite (4,5). Chlamydia trachomatis é igualmente o agente causal do tracoma, a primeira causa de cegueira no mundo, um tipo de cegueira que é
possível prevenir (6). O diagnóstico precoce destas infecções a Chlamydia
63
pode permitir tratar a doença a tempo, o que reduz o risco de complicações e de transmissão futura.
Os primeiros métodos de isolamento da Chlamydia assentavam na cultura, em vesículas vitelinas, de embriões de ratinho ou de galinha. Com o
desenvolvimento dos métodos de cultura tecidular, estes últimos vieram
substituir as técnicas anteriores, menos cómodas (7,8). A utilização da
tecnologia de imunofluorescência e dos anticorpos monoclonais na
detecção dos organismos nas culturas de tecido viria ainda melhorar a
sensibilidade dos testes de Chlamydia e reduzir a necessidade de realizar
uma passagem em todas as amostras (9).
rR
Fo
O Sistema Pathfinder® recorre a um anticorpo monoclonal conjugado por
fluoresceína para identificar as inclusões de Chlamydia em células em cultura inoculadas com amostras potencialmente infectadas. Este teste alia a
especificidade e a reprodutibilidade dos anticorpos monoclonais à rapidez e à simplicidade de um teste por fluorescência directa. Para a
detecção da Chlamydia em culturas de células, este teste oferece uma
alternativa simples e sensível a outros métodos de coloração.
efe
PRINCÍPIOS DO MÉTODO
ce
ren
Este teste utiliza um anticorpo monoclonal conjugado com fluoresceína,
com o objectivo de identificar a Chlamydia em culturas celulares. O anticorpo reage com o fragmento lipopolissacarídico dos corpos de inclusão
e dos corpos reticulados que estejam presentes nas inclusões. Este teste
permite detectar todos os serovares conhecidos de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci e Chlamydia pneumoniae. Não distingue entre
espécies e serovares.
nly
eO
Us
Se for o caso, o anticorpo monoclonal reage com os antigénios de
Chlamydia que estão presentes na cultura celular. Uma fase de enxaguamento permite eliminar o anticorpo não ligado. Observadas ao microscópio de fluorescência, as amostras de cultura celular infectadas pela
Chlamydia apresentam uma fluorescência verde maçã, característica das
inclusões, sobre fundo contra-colorido de vermelho.
DISPOSITIVO DE REAGENTES
•
Para Utilização No Diagnóstico In Vitro
•
Conservar o anticorpo entre 2°C e 8°C.
•
Anticorpo Monoclonal se mantêm estáveis até ao termo do prazo de
validade indicado na etiqueta, quando armazenados nas condições
recomendadas.
•
Uma vez abertos, Anticorpo Monoclonal se mantêm estáveis até ao
termo do prazo de validade indicado na etiqueta, quando armazenados nas condições recomendadas.
64
1. Anticorpo Monoclonal para confirmação da presença de Chlamydia em culturas celulares.
O frasco contém 4,2 mL de uma solução de anticorpo monoclonal de
murino anti-Chlamydia (específica da espécie), conjugada com fluoresceína. A solução contém ainda um agente de estabilização das proteínas, um contra-corante Azul de Evans e 0.1% de azida de sódio. A
solução de anticorpo é apresentada pronta a utilizar. Qualquer diluição
suplementar irá reduzir a sensibilidade do teste.
Os sinais de deterioração possível do produto são os seguintes:
•
•
Intensificação do fundo verde das amostras de controlo.
Alteração da reactividade nominal dos controlos positivos e negativos.
Fo
ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
Exclusivamente reservado a utilização profissional
ce
Xn. Nocivo
ren
efe
rR
Reagentes contendo azida de sódio.
O reagente contém 0,1% de azida de sódio. A azida de sódio é susceptível de reagir com o chumbo e o cobre das canalizações e, deste modo,
formar azidas metálicas altamente explosivas. Na eliminação de tais líquidos, lavar a canalização com água abundante para evitar a acumulação
de azidas. Para informações mais pormenorizadas é favor consultar o
Manual editado pelos CDC (Centers for Disease Control = Centros de
Controlo da Doença) (10).
eO
Us
R: 21/22
Nocivo em contacto com a pele e por ingestão.
S: 24/25-28-36/37/39
Evitar o contacto com a pele e os olhos. Após contacto com
a pele, lavar imediata e abundantemente com água. Usar
vestuário de protecção, luvas e equipamento protector para
os olhos/face adequados.
nly
Amostras dos doentes
Na recolha e tratamento das amostras dos doentes, estes produtos
devem ser considerados como potencialmente infecciosos, de acordo
com as precauções universais e as boas práticas clínicas e laboratoriais,
independentemente da sua origem, tratamento ou certificação prévia. Utilizar um desinfectante apropriado para descontaminação. Guardar e eliminar estes materiais e respectivos recipientes em conformidade com as
normas e directivas vigentes a nível local.
RECOLHA E PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS
A recolha das amostras constitui uma etapa fundamental para a detecção
da Chlamydia (11). O pessoal técnico que procederá à recolha das amostras deve ser plenamente qualificado para o efeito, por forma a minimizar
o risco de recolher amostras insuficientes ou inadequadas. Um procedi65
mento recomendado para a colheita das amostras do colo uterino e da
uretra, no homem, é descrito a seguir.
ATENÇÃO: Seguir as normas de segurança biológica habituais para
recolha e tratamento de amostras destinadas à detecção de Chlamydia.
Considerar as amostras e todos os materiais em contacto com elas como
potencialmente infecciosos, e proceder à sua eliminação segundo os procedimentos estabelecidos. Evitar a produção de aerossóis. Consultar a
referência 12 para informações mais pormenorizadas sobre a prevenção
de infecções no laboratório.
Fo
Recolha das amostras (amostras do colo uterino e da uretra masculina)
Materiais necessários
1. Tampão de grande dimensão, destinado a limpar a zona exocervical,
antes da recolha de uma amostra endocervical.
2. Tampões estéreis
efe
3. Meio de cultura
rR
Utilizar tampões que não inibam a proliferação de Chlamydia ou das
células em cultura.
Utilizar um meio de cultura que não iniba a proliferação de Chlamydia
ou das células em cultura.
ren
Recolha das amostras: procedimento
1. Amostras uretrais
ce
eO
Us
NOTA: Para um diagnóstico preciso, a amostra deve conter células epiteliais provenientes da mucosa da uretra. Estas células são
as mais sensíveis à infecção por Chlamydia. (O exsudado não
constitui uma amostra apropriada para o teste de Chlamydia em
laboratório.) (13)
Dar instruções ao doente para se abster de urinar durante a hora
que antecede a colheita.
nly
a. Inserir um pequeno tampão no interior da uretra, a uma profundidade de 2 a 4 cm. (A inserção será facilitada se se imprimir um
ligeiro movimento de rotação ao tampão.)
b. Imprimir um movimento de rotação ao tampão, exercendo a
pressão suficiente para obter células epiteliais.
c. Deixar o tampão no lugar durante 1 a 2 segundos.
d. Retirar então o tampão e colocá-lo imediatamente no meio de
transporte e enviá-lo ao laboratório. A amostra pode ser conservada a 2-8°C durante um máximo de 24 horas. Para uma conservação mais prolongada, congelar a –70°C até à inoculação.
66
2. Amostras cervicais
NOTA: As células epiteliais cilíndricas da mucosa cervical são as
mais sensíveis à infecção por Chlamydia (13). Estas células cilíndricas situam-se precisamente no interior do orifício do colo.
A situação da zona de transição, onde termina o epitélio estratificado e começa o epitélio cilíndrico, pode variar em certos casos
(14). O cumprimento do procedimento seguinte garantirá que as
amostras são suficientes e apropriadas.
ren
efe
rR
Fo
a. Por meio de um tampão de grandes dimensões, eliminar o excesso
de muco e o exsudado do exocolo. Deitar fora o tampão.
b. Inserir um tampão estéril no canal endocervical, a uma profundidade aproximada de 1 a 1,5 cm, até que a maior parte do tampão
tenha entrado no orifício do colo.
c. Imprimir uma rotação ao tampão durante 5 a 10 segundos, exercendo pressão suficiente para obter células provenientes de todas
as faces do canal endocervical.
d. Retirar o tampão, evitando qualquer contacto com as mucosas
vaginais. Colocar imediatamente em meio de transporte e enviar ao
laboratório. A amostra pode ser conservada a 2-8°C durante um
máximo de 24 horas. Para uma conservação mais prolongada,
congelar a amostra a –70°C até à sua inoculação na cultura celular.
ce
Tratamento das amostras para cultura celular
Materiais necessários
1. Linhagem de células
Us
Utilizar uma linhagem de células sensível a Chlamydia – por exemplo,
células McCoy.
eO
NOTA: A escolha e o estado das células de cultura podem influenciar a sensibilidade da técnica de detecção da Chlamydia por cultura de confirmação.
2. Culturas celulares de controlo
•
nly
•
Controlo negativo – células inoculadas apenas com o meio de
transporte.
Controlo positivo – células inoculadas com uma amostra positiva
para a Chlamydia.
3. Outros materiais e equipamentos de cultura celular
•
Meio de cultura, placas de microtitulação, centrifugada, incubadora
de atmosfera controlada em CO2, etc.
Procedimento de colocação em cultura
1. Segundo o método estabelecido, inocular a amostra sobre uma
camada de células confluentes.
2. Incubar a camada monocelular durante 48 horas.
3. Se desejar, realizar uma passagem e incubar durante mais 48 horas.
67
PROCEDIMENTO DE TESTE
Materiais fornecidos
1. Anticorpo monoclonal anti-Chlamydia
Materiais necessários mas não fornecidos
1. Fixador: metanol de qualidade histológica ou analítica.
2. Água desionizada.
3. Meio de fixação Pathfinder® – N° de referência Bio-Rad: 30693.
4. Placa de microtitulação para microscopia com lamelas adaptadas
(diâmetro 5 mm), ou lâminas de microscópio em vidro e pinças (conforme a técnica utilizada).
5. Pipetas esterilizadas.
Fo
6. Câmara de humidificação.
efe
rR
7. Microscópio de fluorescência – Para visualizar as amostras coradas a
isotiocianato de fluoresceína, utilizar um sistema de filtros que fornece
um comprimento de onda de excitação de 480-490 nm e um comprimento de onda de emissão igual ou superior a 510 nm. O tipo e o
estado dos filtros da fonte luminosa podem afectar a intensidade da
reacção de fluorescência.
ce
ren
Procedimento de coloração fluorescente da cultura celular
A. Técnica de cultura em placa de microtitulação
1. Fixação da camada de células
a. Aspirar cuidadosamente o meio de cada poço.
Us
b. Adicionar a quantidade de metanol suficiente para cobrir a
camada monocelular em cada poço. Fixar durante 10 minutos à
temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
eO
c. Aspirar o líquido de cada poço por meio de uma pipeta ou
inverter a placa e deixá-la escorrer sobre papel absorvente, a
fim de eliminar o metanol. Colorir imediatamente.
2. Coloração da camada monocelular
nly
Se a coloração não for realizada imediatamente, conservar as
placas a –70°C.
NOTA: Se as células estiverem secas, humedecer por meio de
água desionizada, antes da coloração. (Inverter a placa e
escorrer para eliminar o excesso de líquido.)
a. Depositar uma gota (cerca de 30 µL) de anticorpo monoclonal
anti-Chlamydia em cada poço. A solução de anticorpo deve
cobrir, na totalidade, a camada monocelular.
b. Cobrir a placa e incubar à temperatura ambiente (23°C ± 3°C)
durante 30 minutos. Proteger a placa da luz intensa durante a
incubação.
68
c. Destapar a placa e eliminar o anticorpo monoclonal dos poços,
aspirando o líquido por meio da pipeta ou invertendo a placa e
deixando escorrer sobre papel absorvente. Enxaguar com água
desionizada para eliminar os anticorpos residuais. Inverter a
placa e escorrer sobre papel absorvente para eliminar o
excesso de água.
d. Depositar uma gota de meio de fixação em cada poço e cobrir
com uma lamela.
NOTA: Utilizar unicamente o meio de fixação Pathfinder®, N°
de referência Bio-Rad 30693
Fo
3. Inverter a placa de microtitulação e examinar os poços ao
microscópio de fluorescência, por meio de uma objectiva de longa
focal. Examinar a totalidade da camada monocelular, com uma
ampliação mínima de 100 X. Se a presença de corpos de inclusão
for suspeita, confirmar com uma ampliação maior.
efe
rR
Se necessário, as placas de microtitulação podem ser conservadas
no escuro a 4°C. Devem, no entanto, ser examinadas dentro das 24
horas seguintes.
ren
B. Técnica de cultura em frasco
1. Fixação da camada monocelular
a. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura em cada frasco.
ce
b. Adicionar, em cada frasco, uma quantidade suficiente de metanol para cobrir a camada de células. Fixar durante 10 minutos
à temperatura ambiente (23°C ± 3°C).
Us
c. Eliminar o metanol por aspiração com pipeta.
2. Coloração da camada monocelular
eO
Se a coloração for realizada imediatamente, conservar os frascos a –70°C.
nly
a. Por meio de pinça, retirar cuidadosamente a lamela contendo a
camada de células confluentes do frasco e depositá-la sobre
uma lâmina de vidro limpa, convenientemente etiquetada, com
as células dirigidas para cima. Colorir imediatamente.
NOTA: Se as células estiverem secas, humedecer com água
desionizada. (Eliminar, em seguida, o excesso de líquido.)
b. Depositar uma gota (cerca de 30 µL) da solução de anticorpos
monoclonais Pathfinder® sobre a camada de células. A solução
de anticorpos deve cobrir completamente a camada de células.
c. Incubar numa câmara de humidificação, à temperatura ambiente (23°C ± 3°C) durante 30 minutos. Proteger as lamelas de
fontes de luz intensas durante a incubação.
69
d. Enxaguar a lamela com água desionizada para eliminar dela os
anticorpos não ligados (Escorrer o excesso de água.)
e. Colocar uma gota de meio de fixação sobre uma lâmina de
vidro limpa, convenientemente etiquetada. Depositar aí a lamela
com precaução, evitando a formação de bolhas de ar, com a
camada de células dirigida para baixo.
3. Examinar a totalidade da camada monocelular com uma ampliação
mínima de 100 X. Se a presença de corpos de inclusão for suspeita, confirmar com uma ampliação maior.
Fo
Se necessário, as placas de microtitulação podem ser conservadas
no escuro a 4°C. Devem, no entanto, ser examinadas no prazo
máximo de 24 horas.
NOTA: Utilizar exclusivamente o meio de fixação Pathfinder®
de Bio-Rad N° de referência 30693
rR
CONTROLO DE QUALIDADE
efe
Um controlo positivo e um controlo negativo deverão ser adicionados a
cada lote de culturas de doentes, a fim de verificar o desempenho do
sistema de cultura, da técnica de fluorescência e do microscópio.
ren
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
ce
Examinar, em primeiro lugar, as amostras de controlo. As culturas celulares de controlo facilitam a interpretação dos resultados, ilustrando as
reacções positiva e negativa da linhagem de células utilizada para as
amostras de doentes. Se a reactividade dos controlos estiver conforme,
passar à interpretação das amostras dos doentes. Em caso de reacção
inadequada dos controlos, repetir o teste. As reacções positiva e negativa
são seguidamente descritas de forma detalhada.
eO
Us
nly
Resultados positivos
Um controlo ou uma amostra de doente positiva deverá apresentar
inclusões citoplásmicas fluorescentes características, as quais deverão
ser visíveis com uma ampliação de 100 X. A inclusão surge sob a forma
de uma massa fluorescente bem definida, de cor verde maçã, no citoplasma da célula infectada, nas proximidades do núcleo. A presença de
uma ou mais inclusões numa cultura determina um resultado positivo. As
células não infectadas e o fundo das células infectadas são coradas de
vermelho pelo contra-corante. A coloração não específica distingue-se
por uma tonalidade amarela, branca ou verde clara, em vez de verde
maçã.
Resultados negativos
Uma amostra negativa não deverá apresentar qualquer fluorescência
verde maçã específica. Todas as células ficarão coradas de vermelho pelo
contra-corante. A coloração não específica é mínima.
70
RESTRIÇÕES
1. A visualização das inclusões pode revelar-se difícil de concretizar se o
anticorpo secar sobre a camada monocelular.
2. Desconhece-se o desempenho deste teste em amostras recolhidas de
doentes sob tratamento antimicrobiano.
3. Para detectar a Chlamydia é imperativo que a recolha das amostras se
processe segundo as normas. O pessoal técnico encarregado de
recolher as amostras deve ser perfeitamente qualificado para o efeito,
por forma a minimizar o risco de obtenção de amostras insuficientes
ou incorrectas.
rR
Fo
4. É desaconselhada a utilização de anticorpo monoclonal anti-Chlamydia destinado a testar as culturas de confirmação em amostras clínicas
directas. (Bio-Rad propõe um dispositivo especificamente concebido
para detecção de Chlamydia em amostras directas– N° de referência
30704.)
VALORES PREVISTOS
ce
ren
efe
Os valores previstos podem variar consoante a população testada. A BioRad submeteu 402 amostras, recolhidas em doentes provenientes de
populações de alto e de baixo risco, a testes de confirmação por cultura
Pathfinder® e MicroTrak™. As discrepâncias subjacentes após uma passagem foram eliminadas utilizando o teste de Chlamydia em cultura celular, da Ortho Diagnostics. A concordância global entre os dois testes
situou-se em 99,5% para as culturas primárias e em 100,0% para as culturas secundárias. Apenas uma amostra que fornecera um resultado negativo para a cultura primária viria a revelar-se positiva após uma
passagem. Por comparação com os testes da concorrência, a sensibilidade e a especificidade do teste Pathfinder® foram ambas de 100,0%
para as culturas primárias e secundárias. (Para mais informações consultar a secção Características de Desempenho específicas.)
eO
Us
nly
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS
Três laboratórios independentes avaliaram a capacidade do reagente
Pathfinder® em detectar a Chlamydia em culturas celulares. Os três locais
de estudo independentes situavam-se um no Leste, o outro no Sul e o terceiro a Oeste dos Estados Unidos. O teste de confirmação em cultura
MicroTrak™ de Syva foi estudado como método de referência e o dispositivo comercializado pela Ortho Diagnostics foi utilizado para solucionar as
eventuais discordâncias entre os resultados, após uma passagem.
Os investigadores recolheram um esfregaço endocervical ou um esfregaço uretral de cada doente, colocaram o tampão no meio de transporte,
com vista à sua inoculação numa cultura celular. Dois dos investigadores
inocularam 5 camadas de células McCoy de confluência para cada
doente. Após 48 horas de incubação, duas das culturas foram coradas,
uma com o reagente Pathfinder®, a outra com o reagente MicroTrak™.
71
Para as culturas que forneceram resultados negativos ou discordantes
para as culturas primárias, as 3 culturas restantes foram fraccionadas e
transferidas em 3 outras culturas de células. Após 48 horas de incubação
suplementares, os investigadores coraram de novo duas das culturas
mono-camada, uma com o reagente Pathfinder®, a outra com o reagente
MicroTrak™. Quando necessário, a cultura secundária restante foi testada
por meio do reagente da Ortho Diagnostics a fim de resolver as eventuais
discordâncias. O terceiro investigador inoculou 3 monocamadas por
doente e procedeu como acima descrito, à excepção do facto de, quando
necessário, a camada monocelular restante ser fraccionada em três novas
camadas monocelulares.
As culturas que comportam, pelo menos, uma inclusão após a incubação
primária ou após o fraccionamento e a primeira passagem, foram consideradas como positivas.
Fo
ren
efe
rR
As amostras eram provenientes de duas populações distintas, uma população de alto risco e uma população de baixo risco. A população de alto
risco era constituída por homens e mulheres seguidos em clínicas especializadas em doenças sexualmente transmissíveis e apresentavam sintomas urogenitais, ou homens e mulheres assintomáticos em contacto com
doentes portadores de uma doença sexualmente transmissível. A prevalência global da Chlamydia nesta população foi de 23,5%. A população
de baixo risco era constituída por mulheres seguidas em exames obstétricos ou ginecológicos de rotina, ou que cumpriam os critérios seguintes:
ce
1) idade superior a 25 anos; 2) nenhum sinal de perdas cervicais purulentas, de ectopia cervical ou de friabilidade cervical; e 3) nenhum contacto
com um doente portador de um síndroma ou de um patogene associado
a uma doença sexualmente transmissível. Nesta população, a prevalência
global da Chlamydia foi de 10,0%.
nly
eO
Us
72
As características de desempenho do teste de Confirmação em Cultura
Pathfinder® após cultura primária e secundária são apresentadas, em pormenor, no Quadro 1, por comparação com o teste da concorrência.
Quadro 1 - Comparação do Teste de Confirmação em Cultura Pathfinder® e do
teste concorrente, após cultura primária e secundária
População de
alto risco
n
População de
baixo risco
302
VP
VP + FN
Especificidade
VN
VN + FP
Valor previsto
positivo
VP
VP + FP
Valor previsto
negativo
VN
VN + FN
100
100,0%
71
71
100,0%
231
231
100,0%
71
71
231
231
rR
Fo
Sensibilidade
100,0%
Total (População
de alto e de baixo
risco)
402
100,0%
10
10
100,0%
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
100,0%
10
10
100,0%
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
efe
NOTA: VP = verdadeiro positivo, FP = falso positivo, FN = falso negativo, VN = verdadeiro
negativo.
ren
O Quadro 2 resume os dados comparativos do Reagente Pathfinder® e do
reagente MicroTrak™ apenas em culturas primárias
Quadro 2 - Comparação entre o Reagente Pathfinder® e o Reagente MicroTrak™
apenas em culturas primárias
ce
n
302
População de
baixo risco
Us
População de
alto risco
Total (População
de alto e de baixo
risco)
100
Sensibilidade
VP
VP + FN
100,0%
69
69
Especificidade
VN
VN + FP
99,6%
232*
233
Valor previsto
positivo
VP
VP + FP
98,6%
69*
70
90,0%
Valor previsto
negativo
VN
VN + FN
100,0%
232
232
100,0%
402
9
9
100,0%
78
78
98,9%
90*
91
99,4%
322*
324
9*
10
97,5%
78*
80
90
90
100,0%
322
322
nly
eO
100,0%
®
* Duas amostras positivas, de acordo com o teste Pathfinder , e negativas de acordo
com o teste MicroTrak™, após a cultura primária, deram resultados positivos após a
primeira passagem, tanto com o teste MicroTrak™ como pelo método Ortho Diagnostics.
Tendo em conta que estas amostras são positivos verdadeiros, a especificidade e o valor
previsto positivo do teste Pathfinder® atingiram 100% para as populações de alto risco,
de baixo risco e total.
As características de desempenho eram comparáveis para homens e mulheres da população de alto risco.
73
O Quadro 3 apresenta, em pormenor, o número de resultados positivos
obtidos após as culturas primárias e secundárias. O reagente Pathfinder®
permitiu detectar mais 2,5% de resultados positivos do que o reagente
MicroTrak™, entre as culturas primárias. A utilização do teste Pathfinder®
nas culturas secundárias deu mais 1,2% de resultados positivos que nas
culturas primárias.
Quadro 3 -Detecção de Chlamydia em culturas primárias e secundárias
Cultura primária
Cultura secundária
Pathfinder®
80
81
Positivos com MicroTrak™
78
80
Positivos com
Fo
REACTIVIDADE CRUZADA
efe
rR
A Bio-Rad testou a reactividade cruzada dos organismos descritos no
Quadro 4 com o reagente Pathfinder®. Os organismos citados foram testados em lâminas de substracto fixado e não manifestaram qualquer reactividade cruzada em relação ao anticorpo monoclonal Pathfinder®.
Quadro 4 - Estudos de reactividade cruzada de potenciais contaminantes
das culturas celulares em relação ao anticorpo
Herpes virus
Herpes simplex Type I
ce
Cytomégalovirus
Reactividade cruzada com o
anticorpo monoclonal anti-Chlamydia
ren
Organismo
Negativo
Negativo
Us
Herpes simplex Type II
Negativo
Varicella zoster Virus
Negativo
eO
Acholeplasma laidlawii
Negativo
Mycoplasma arginini
Negativo
Negativo
nly
Mycoplasma hominis
Mycoplasma hyorhinis
Negativo
Mycoplasma orale
Negativo
Mycoplasma salivarium
Negativo
74
Pathfinder® Chlamydia Culture
Confirmation System
30701
Til identifikation af chlamydia i cellekultur ved hjælp af
direkte fluorescens.
rR
Fo
FORMÅL
Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System er en direkte fluorescensprocedure til identifikation af chlamydia i cellekulturer.
efe
OVERSIGT OG FORKLARING
ce
ren
Chlamydiaorganismer mistænkes for at være medvirkende årsag til en
lang række forskellige helbredsmæssige problemer. Der er identificeret to
arter af chlamydia: chlamydia trachomatis og chlamydia psittaci. Chlamydia psittaci inficerer hovedsagligt fugle, men mennesker kan også udvikle
sygdomme som f.eks. lungebetændelse eller generelle systemiske infektioner, når de eksponeres for inficerede arter. Chlamydia trachomatis
inficerer generelt kun mennesker. De kliniske syndromer, der oftest forbindes med chlamydia trachomatis, omfatter inclusion conjunctivitis, trachoma, urethritis, cervicitis og andre urogenitale forstyrrelser og venerisk
lymfegranulomatose (LGV) (1). Overførsel af chlamydia trachomatis kan
foregå via seksuel kontakt med en inficeret person, et fosters passage
gennem en inficeret fødselskanal, eller som i tilfældet med trachoma
primært gennem ikke-seksuel personlig kontakt i udviklingslandene (2).
nly
eO
Us
Chlamydia trachomatis betragtes i dag som den dominerende årsag til
seksuelt overførte sygdomme. Uheldigvis forbliver mange inficerede personer asymptomatiske, hvorfor organismen ikke bliver konstateret (3). Hos
kvinder kan genitale infektioner, der ikke bliver diagnosticeret, medføre
permanent nedsættelse af forplantningsevnen på grund af komplikationer
som f.eks. salpingitis eller bækkenbundsbetændelse (4,5). Chlamydia trachomatis er også årsag til trachoma, verdens hyppigste årsag til blindhed,
der kunne forhindres (6). En tidlig diagnose af disse chlamydiainfektioner
kan føre til rettidig behandling af sygdommen og dermed begrænse
risikoen for komplikationer og videreførsel af smitten.
De tidlige metoder til isolation af chlamydia omfattede vækst på mus og i
æggeblommer fra kyllingefostre. Efterhånden som vævskulturmetoderne
75
blev bedre, erstattede de disse mere omstændige teknikker (7, 8). Brugen
af immunofluorescens og monoklonal antistofteknologi til at påvise organismer i vævskultur har øget chlamydiakulturens sensitivitet yderligere og
mindsket behovet for at udføre passage på alle prøver (9).
Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System bruger et fluoresceinkonjugeret monoklonalt antistof til at identificere chlamydiainklusioner i
inokulerede cellekulturer. Analysen kombinerer monoklonale antistoffers
specificitet og reproducerbarhed med en direkte fluorescenstests
hastighed og enkelhed. Med henblik på påvisning af chlamydiaorganismer
i kultur, udgør denne test et enkelt, sensitivt alternativ til andre kulturstammer.
PROCEDURENS PRINCIPPER
ren
efe
rR
Fo
Testen bruger et fluoresceinkonjugeret, monoklonalt antistof til at identificere chlamydia i kultur. Antistofferet reagerer med den lipopolysaccharide
del af de elementære og retikulære former af chlamydiaorganismen i inklusionen. Denne analyse konstaterer alle kendte serovarer af Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci og Chlamydia pneumoniae. Analysen skelner
ikke mellem arter eller serovarer. Det monoklonale antistof reagerer med
chlamydiantigener, hvis de findes i cellekulturen. En vaskeprocedure
fjerner ubundet antistof. Når cellekulturprøver, der indeholder chlamydia,
bliver betragtet under fluorescensmikroskop, viser inklusionerne en karakteristisk æblegrøn fluorescens i forhold til den røde baggrundsfarve.
ce
KIT MED REAGENS
Til In Vitro-Diagnosticering
•
Opbevar antistoffet ved 2 – 8°C.
•
Monoklonalt antistof: holdbare indtil udløbsdatoen på etiketten, når de
opbevares ifølge anbefalingerne.
•
Når reagenserne er åbnet, monoklonalt antistof: holdbare indtil udløbsdatoen på etiketten, når de opbevares ifølge anbefalingerne.
nly
eO
Us
•
1. Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System monoklonalt
antistof:
Flasken indeholder 4,2 mL fluoresceinkonjugeret, murint, monoklonalt
antistof mod chlamydia (slægtsspecifik) med en proteinstabilisator,
Evans' blå baggrundsfarve og 0,1% natriumazid. Det flydende antistof
er i brugsklar opløsning, yderligere fortynding af antistoffet mindsker
testens sensitivitet.
Tegn på mulig nedbrydning er:
•
•
Øget grøn baggrund på kontroller.
Ændringer i den forventede reaktivitet over for positive og negative
kontroller.
76
ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER
Kun til professionel brug
Reagenser, der indeholder natriumazid
Reagensen indeholder 0,1% natriumazid. Natriumazid kan reagere med
bly- og kobberrør og dermed danne højeksplosive metalazider. Ved
bortskaffelse af væsker skal der skylles med store mængder vand for at
forhindre dannelse af azider. Yderligere oplysninger finder du i Manual
Guide, der er udgivet af Centers for Disease Control (10).
Fo
Xn. Sundhedsskadelig
R: 21/22
Farlig ved hudkontakt og ved indtagelse.
S: 24/25-28-36/37/39
Undgå kontakt med huden og øjnene. Kommer stof på huden
vaskes straks med store mængder vand. Brug særligt arbejdstøj, egnede beskyttelseshandsker og -briller/ansigtsskærm.
ce
ren
efe
rR
Patientprøver
Følg de faste procedurer til forebyggelse af biologiske farer, ved indsamling og behandling af prøver til chlamydiatest. Disse produkter skal dog
behandles som potentielt smitsomme ifølge almengyldige forholdsregler
og regler for god, klinisk laboratoriepraksis, uafhængigt af deres oprindelse, behandling eller forudgående certificering. Benyt et relevant desinfektionsmiddel til desinficeringen. Opbevar og bortskaf disse materialer og
deres beholdere i overensstemmelse med lokale regulativer og retningslinjer.
PRØVETAGNING OG KLARGØRING
eO
Us
Prøvetagning er et afgørende trin i påvisning af chlamydia (11). Det personale, der indsamler chlamydiaprøver, skal være veluddannet for at minimere forekomsten af utilstrækkeligt prøvemateriale. Nedenfor findes den
anbefalede procedure for indsamling af prøver fra livmoderhalsen hos
kvinder og urinrøret hos mænd.
nly
ADVARSEL! Følg de faste procedurer til forebyggelse af biologiske farer,
ved indsamling og behandling af prøver til chlamydiatest. Betragt alle
prøver og alt materiale, som de kommer i berøring med, som potentielt
inficerede, og bortskaf prøverne på korrekt vis. Undgå at pipettere med
munden. Forebyg dannelse af aerosoler. Se reference 12 for flere oplysninger om forebyggelse af laboratorieinfektioner.
Prøvetagning (prøver fra livmoderhals hos kvinder og urinrør hos
mænd)
Nødvendigt materiale
1. Stor vatpind til at rengøre exocervix hos kvinder forud for den endocervikale prøvetagning.
2. Sterile vatpinde
Brug vatpinde, der ikke hæmmer væksten af chlamydia eller celler i
kulturen.
77
3. Transportmedium
Brug et transportmedium, der ikke hæmmer væksten af chlamydia eller
celler i kulturen.
Procedure for prøvetagning
1. Urethrale prøver
BEMÆRK! Med henblik på at opnå en nøjagtig diagnose, skal
prøven indeholde epithelceller fra kanten af urinrøret. Disse celler
er de mest modtagelige for chlamydiainfektion. (Exsudatet er ikke
tilstrækkeligt prøvemateriale til laboratorietest af chlamydia). (13)
Anvis patienten i ikke at lade vandet i en time forud for prøvetagningen.
2. Cervikale prøver
ren
efe
rR
Fo
a. Før en lille vatpind ca. 2 – 4 cm ind i urinrøret. (Drej vatpinden en
smule, så den er lettere at indføre).
b. Drej vatpinden forsigtigt, men med tilstrækkeligt tryk til at opfange
epithelceller.
c. Lad vatpinden være indført i 1 – 2 sekunder.
d. Træk vatpinden ud, og placer den straks i transportmediet og send
den til laboratoriet. Opbevar prøven ved 2 – 8°C i op til 24 timer.
Hvis prøven skal opbevares i længere tid, skal den nedfryses til 70°C, indtil kulturen skal podes.
ce
BEMÆRK! De kolumnare epithelceller fra livmoderhalsens slimhinde er mest modtagelig for for chlamydiainfektion (13). Disse
kolumnare epithelceller er placeret lige inden for livmoderhalsåbningen.
Us
eO
I nogle tilfælde varierer placeringen af overgangsområdet, hvor det
stratificerede epithel slutter og det kolumnare epithel begynder (14).
Ved at følge nedenstående procedure, sikres at prøvematerialet er
tilstrækkeligt og korrekt.
nly
a. Brug en stor vatpind til at fjerne overskydende slim og exsudat fra
exocervix. Bortskaf vatpinden.
b. Før den sterile vatpind 1 – 1½ cm ind den endocervikale kanal,
indtil størstedelen af spidsen er placeret i livmoderhalsåbningen.
c. Drej vatpinden i 5 – 10 sekunder med tilstrækkeligt tryk til at
opfange celler fra alle overflader i den endocervikale kanal.
d. Træk vatpinden ud igen, og undgå kontakt med skedevæggen.
Placer straks vatpinden i transportmediet, og send den til laboratoriet. Opbevar prøven ved 2 – 8°C i op til 24 timer. Hvis prøven skal
opbevares i længere tid, skal den nedfryses til -70°C, indtil cellekulturen skal podes.
78
Behandling af cellekulturprøver
Nødvendigt materiale
1. Cellekulturlinje
Brug en cellekulturlinje, der er modtagelig for chlamydia, f.eks.:
McCoy-celler.
BEMÆRK! Valg af cellekulturlinje og cellekulturlinjens tilstand kan
påvirke sensitiviteten, ved identificering af chlamydia med Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System.
2. Cellekultur kontroller
•
•
Fo
Negativ kontrol – cellekultur, der er inokuleret med transportmedium.
Positiv kontrol - cellekultur, der er inokuleret med en prøve, der er
kendt positiv for chlamydia.
3. Andet tilbehør og udstyr til cellekulturer
efe
rR
• kulturmedier, kulturflasker eller mikrotiterplader, centrifuge, CO2varmeskab osv.
Cellekulturprocedure
1. Følg en etableret metode, og inokuler prøven på et passende cellemonolag.
ren
2. Inkuber monolaget i 48 timer.
3. Hvis det ønskes, foretages en passage af monolaget med inkuation i
yderligere 48 timer.
ce
ANALYSEPROCEDURE
eO
Us
Medfølgende materialer
1. Monoklonalt antistof til Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation
System.
Nødvendige materialer, der ikke medfølger
1. Methanolfiksativ –til histologi eller ACS.
nly
2. Deioniseret vand.
3. Pathfinder®-monteringsmedium – Bio-Rad kat.nr. 30693.
4. Afdækning og dækglas til mikrotiterplade (5 mm, rund) eller rene mikroskopobjektglas og pincet (afhængigt af kulturteknikken).
5. Sterile pipetter.
6. Fugtekammer.
7. Fluorescensmikroskop – til visualisering af prøver, der er farvet med fluoresceinisothiocyanat, bruges en eksitationsbølgelængde på 480 –
490 nm og en emissionsbølgelængde på 510 nm eller mere. Mikroskopfiltrenes og lyskildens type og tilstand kan påvirke den fluorescerende
reaktions intensitet.
79
Procedure for fluorescensfarvning af cellekultur
A. Mikrotiterpladeteknik
1. Fiksering af cellemonolaget
a. Sug kulturmediet forsigtigt op af hver brønd.
b. Tilsæt tilstrækkeligt methanol til at dække monolaget i hver
brønd. Lad det fiksere i 10 minutter ved stuetemperatur
(23 ± 3°C).
c. Sug væsken op fra hver brønd med en pipette, eller vend pladen
og dup med sugende papir for at fjerne methanolet. Udfør
farvningen med det samme.
Hvis du ikke udfører farvningen med det samme, skal du opbevare objektglasene ved -70°C.
Fo
2. Farvning af cellemonolaget
rR
BEMÆRK! Hvis cellerne er tørre, skal du fugte dem med deioniseret vand før farvningen. (Vend pladen og dup med sugende
papir for at fjerne den overskydende væske).
ren
efe
a. Tilsæt 1 dråbe (ca. 30 µL) af det monoklonale antistof fra Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System til hver brønd.
Antistoffet skal dække monolaget helt.
b. Tildæk pladen, og inkuber ved stuetemperatur (23 ± 3°C) i 30
minutter. Beskyt pladen mod kraftigt lys under inkubationen.
ce
c. Fjern afdækningen fra pladen, og fjern det monoklonale antistof
fra Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System ved at
suge væsken op fra hver brønd med en pipette eller ved at
vende pladen om og dup med sugende papir. Skyl med deioniseret vand for at fjerne rester af antistof. Vend og dup pladen
med sugende papir for at fjerne overskydende vand.
eO
Us
d. Tilsæt 1 dråbe monteringsmedium til hver brønd, og læg dækglas på.
nly
BEMÆRK! Brug kun Pathfinder®-monteringsmedium med
Bio-Rads kat.nr. 30693
3. Vend mikrotiterpladen og undersøg brøndene i et fluorescensmikroskop med et objektiv med stor fokal længde. Undersøg hele
monolaget ved en forstørrelse på mindst 100X. Hvis inklusionen
virker uklar, skal du indstille mikroskopet til højere forstørrelse.
Hvis det er nødvendigt, kan mikrotiterpladerne opbevares i mørke
ved 4°C og aflæses inden for 24 timer.
B. Shell vial teknik
1. Fiksering af cellemonolaget
a. Sug kulturmediet forsigtigt op af hver Shell vial.
80
b. Tilsæt tilstrækkeligt methanol til at dække monolaget i hver Shell
vial. Fikser i 10 minutter ved stuetemperatur (23 ± 3°C).
c. Fjern methanolet ved at suge det op med en pipette.
Hvis farvningen ikke udføres med det samme, opbevares Shell
vialerne ved -70°C.
2. Farvning af cellemonolaget
a. Brug en pincet til at fjerne dækglasset med monolaget fra Shell
vialen, og placer den med cellerne opad på et korrekt mærket
og rent objektglas. Udfør farvningen med det samme.
BEMÆRK! Hvis cellerne er tørre, fugtes de med deioniseret
vand. (Fjern overskydende væske).
rR
Fo
b. Tilsæt 1 dråbe (ca. 30 µL) af det monoklonale antistof fra Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System til hver brønd.
Antistoffet skal dække monolaget helt.
efe
c. Inkuber i et fugtekammer ved stuetemperatur (23 ± 3°C) i 30
minutter. Beskyt dækglassene mod kraftigt lys under inkubationen.
ren
d. Skyl dækglasset med deioniseret vand for at fjerne rester af
antistof. (Dup det overskydende vand af med sugende papir).
ce
e. Placer en dråbe monteringsmedium på et nyt rent objektglas,
der er korrekt mærket. Læg dækglasset omhyggeligt på for at
undgå indkapsling af luftbobler. Monolaget med cellerne skal
vende nedad.
eO
Us
3. Undersøg objektglassene gennem et fluorescensmikroskop.
Undersøg hele monoloaget ved en forstørrelse på mindst 100X.
Hvis inklusionen virker uklar, indstilles mikroskopet til en højere
forstørrelse.
nly
Hvis det er nødvendigt, kan objektglasene opbevares i mørke ved
4°C og aflæses inden for 24 timer.
BEMÆRK! Brug kun Pathfinder®-monteringsmedium med BioRads kat. nr. 30693.
KVALITETSKONTROL
Ønskes en kontrol af ydeevnen for kultursystemet, fluorescensproceduren
og mikroskopet, skal positive og negative cellekulturkontroller medtages i
hver serie af patientkulturer.
FORTOLKNING AF RESULTATER
Aflæs først kontrollerne. Cellekulturkontroller bidrager til fortolkningen af
resultaterne ved at vise positive og negative reaktioner på den cellelinje,
der er brugt til patientprøverne. Hvis kontrollerne viser den rette reaktivitet,
81
kan patientprøverne fortolkes. Gentag testen, hvis kontrollerne ikke reagerer korrekt. Nedenfor beskrives de positive og negative resultater.
Positive resultater
En positiv kontrol eller patientprøve viser en karakteristisk fluorescens i de
cytoplasmiske inklusioner, som kan ses ved forstørrelse på 100X. Inklusionen fremstår som en veldefineret, æblegrøn, fluorescerende masse i
cytoplasmaet, tæt ved cellekernen i den inficerede celle. Forekomsten af
en eller flere inklusioner pr. kultur betragtes som et positivt resultat. Uinficerede celler og baggrunden for de inficerede celler er rød på grund af
baggrundsfarvningen. Ikke-specifik farvning kan registreres som en gul,
hvid eller mat, grønlig farve i modsætning til den forventede æblegrønne
farve.
rR
Fo
Negative resultater
En negativ prøve viser ingen specifik æblegrøn fluorescens. Alle celler
bliver røde på grund af baggrundsfarvningen. Den uspecifikke farvning er
minimal.
PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER
efe
1. Hvis antistoffet tørrer ud på monolaget, kan det være svært at observere inklusionen.
ren
2. Denne tests ydeevne for patientprøver, der er indsamlet under antimikrobiel behandling, er ukendt.
ce
3. En korrekt prøvetagningsteknik er afgørende for konstateringen af
chlamydia. Det personale, der indsamler prøverne, skal være veluddannet for at minimere forekomsten af utilstrækkeligt prøvemateriale.
eO
Us
4. Det anbefales ikke at bruge det monoklonale antistof fra Pathfinder®
Chlamydia Culture Confirmation System på direkte kliniske prøver.
(Bio-Rad tilbyder et kit til direkte chlamydiaprøver – kat.nr. 30704).
FORVENTEDE VÆRDIER
nly
De forventede værdier kan variere, afhængigt af den testede befolkningsgruppe. Bio-Rad har evalueret 402 prøver fra patienter i høj- og
lavrisikobefolkning ved hjælp af Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System og MicroTrak™- Culture Confirmation testen. Alle uoverensstemmelser efter passage blev løst ved hjælp af Ortho Diagnostics'
chlamydiacellekulturanalyse. Den generelle overensstemmelse mellem
testene var 99,5 % for den oprindelige kultur og 100 % efter passage. Kun
1 prøve blev konstateret negativ for den oprindelige kultur og blev konstateret positiv efter passage. Når testen blev sammenlignet med konkurrerende tests var både sensitiviteten og specificiteten 100 % for
primærkulturen og passagekulturen. (Se afsnittet Specifikationer for særlig
ydeevne efter nærmere oplysninger).
82
KARAKTERISERING AF SPECIFIK YDEEVNE
Tre uafhængige laboratorier evaluerede Pathfinder®-reagensernes evne til
at påvise chlamydia i cellekulturer. De uafhængige undersøgelsessteder
omfattede laboratorier i det østlige, sydlige og vestlige USA. Syvas
MicroTrak™- Culture Confirmation test blev anvendt som referencemetode og Ortho Diagnostics' kit blev anvendt til at klarlægge eventuelle uoverensstemmelser efter passage.
ren
efe
rR
Fo
Forskerne indsamlede endocervikale eller urethrale prøver med vatpind fra
hver patient og placerede den i transportmediet til inokulation af kultur. To
af forskerne inokulerede fem McCoy-cellemonolag for hver patient. Efter
inkubation af kulturerne i 48 timer, blev to af monolagene farvet, en med
Pathfinder®-reagens og en med MicroTalk™-reagens. For de kulturer, hvor
resultaterne var negative eller ikke stemte overens for primærkulturen, blev
de resterende tre kulturer afbrudt og passeret til tre nye monolag. Efter
yderligere 48 timers inkubation, farvede forskerne igen to af monolagene,
en med Pathfinder®-reagens og en anden med MicroTrak™-reagens. Når
det var nødvendigt, blev de resterende passagekulturer testet med Orthos
reagens for at klarlægge uoverensstemmelser. Den tredje forsker inokulerede tre monolag pr. patient og fortsatte som nævnt ovenfor med den
undtagelse, at det resterende oprindelige monolag blev afbrudt og
passeret til tre nye monolag, når det var nødvendigt.
Kulturer med en eller flere inklusioner efter den primære inkubation eller
efter afbrydelse og passage, blev betragtet som positive.
ce
Forskerne indsamlede prøver fra to befolkningsgrupper - højrisiko- og
lavrisikogrupper. Højrisikogruppen omfattede mænd og kvinder, som
havde henvendt sig til klinikker for kønssygdomme. Personerne havde
enten urogenitale symptomer eller var asymptomatiske, men havde været
i kontakt med en person, der var smittet med en kønssygdom. Den
generelle udbredelse af chlamydia i denne befolkningsgruppe var 23,5 %.
Lavrisikogruppen omfattede kvinder, der havde henvendt sig til klinikker
for at få foretaget en rutinemæssig obstetrisk eller gynækologisk undersøgelse eller som opfyldte følgende kriterier:
nly
eO
Us
1) over 25 år gamle, 2) ingen tegn på materiefyldt cervikalt udflåd, cervikal
ektopi eller cervikal skørhed, og 3) ingen kontakt med personer med seksuelt overført sygdomme eller anden kontakt med smitsomt materiale.
Den generelle udbredelse af chlamydia i denne befolkningsgruppe var
10,0 %.
83
Specifikationerne for Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System
ydeevne blev sammenlignet med konkurrerende analyser for primær- og
passagekulturerne, som er beskrevet nærmere i Tabel 1.
Tabel 1 – Sammenligning af Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System
med konkurrerende analyser af primær- og passagekulturer
Højrisikogruppe
n
Lavrisikogruppe
302
Samlet (Høj- og
lavrisikogruppe)
100
402
SP
SP + FN
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Specificitet
SN
SN + FP
100,0%
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
Positiv
forventet værdi
SP
SP + FP
100,0%
71
71
100,0%
10
10
100,0%
81
81
Negativ
forventet værdi
SN
SN + FN
100,0%
231
231
100,0%
90
90
100,0%
321
321
rR
Fo
Sensitivitet
BEMÆRKNING: SP = sand positiv, FP = falsk positiv, FN = falsk negativ, SN = sand negativ.
ren
efe
Tabel 2 opsummerer data, hvor Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System sammenlignes med MicroTrak™ Culture Confirmation testen
kun for primærkulturen
Tabel 2 – Sammenligning af Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System og
MicroTrak™- Culture Confirmation testen kun for primærkulturen
Lavrisikogruppe
ce
Højrisikogruppe
302
Us
n
Sensitivitet
SP
SP + FN
100,0%
69
69
Specificitet
SN
SN + FP
99,6%
232*
233
Positiv
forventet
værdi
SP
SP + FP
98,6%
Negativ
forventet
værdi
SN
SN + FN
100,0%
Samlet (Høj- og
lavrisikogruppe)
100
402
9
9
100,0%
78
78
98,9%
90*
91
99,4%
322*
324
69*
70
90,0%
9*
10
97,5%
78*
80
232
232
100,0%
90
90
100,0%
100,0%
nly
eO
322
322
®
* To prøver, der var positive ved analyse af primærkulturen med Pathfinder -testen og
negative med MicroTrak™-testen, viste sig positive ved brug af enten MicroTrak™- eller
Ortho-metoden passagekulturen. Når disse prøver betragtes som reelt positive, er specificiteten og den positive forventede værdi 100 % for højrisikogruppen, lavrisikogruppen
og den samlede befolkningsgruppe.
Specifikationerne for testens ydeevne
højrisikogruppen var sammenlignelige.
84
for
mænd
og
kvinder
i
Tabel 3 viser antallet af positive resultater af analysen af primærkulturen og
primærkulturen efter passage. Pathfinder®-reagensen påviste 2,5 % flere
positive resultater for primærkulturen end MicroTrak™-reagensen. Brug af
Pathfinder®-analysen på en passagekultur resulterede i 1,2 % flere positive resultater end for primærkulturen alene.
Tabel 3 – Chlamydiakonstatering for primærkultur og efter
analyse af primærkultur og passagekultur
Primærkultur Passagekultur
Positive med Pathfinder®
80
81
Positive med MicroTrak™
78
80
Fo
KRYDSREAKTIVITET
efe
rR
Bio-Rad testede organismerne i Tabel 4 for eventuel krydsreaktivitet i
Pathfinder® Chlamydia Culture Confirmation System. De anførte organismer blev testet på fast substrat objektglas og viste ingen krydsreaktivitet
med Pathfinder®s monoklonale antistof.
Tabel 4 – Krydsreaktivitetsundersøgelser med potentielle cellekulturkontaminanter
Herpes vira
Herpes simplex Type I
Negativ
ce
Cytomegalovirus
Reaktivitet med Pathfinder® Chlamydia
Culture Confirmation System antistof
ren
Organisme
Negativ
Us
Herpes simplex Type I
Varicella Zoster-virus
Negativ
Negativ
eO
Acholeplasma laidlawii
Negativ
Mycoplasma arginini
Negativ
Mycoplasma hominis
Negativ
nly
Mycoplasma hyorhinis
Negativ
Mycoplasma orale
Negativ
Mycoplasma salivarium
Negativ
85
Pathfinder® Konfirmations-system
för Chlamydia-odling
30701
För identifiering av Chlamydia i cellodling genom direkt
fluorescens.
rR
Fo
AVSEDD ANVÄNDNING
Pathfinder® konfirmerande test för Chlamydia-odling använder en direkt
fluorescensteknik för identifiering av Chlamydia i cellodling.
efe
ÖVERSIKT
ce
ren
Chlamydia-organismer misstänks vara orsakande agens för en rad hälsoproblem. Två arter av Chlamydia har identifierats: Chlamydia trachomatis
och Chlamydia psittaci. Chlamydia psittaci infekterar i huvudsak fåglar.
Människan kan dock utveckla sjukdomar, såsom lunginflammation eller allmän systemisk infektion, på grund av exponering för infekterade arter.
Chlamydia trachomatis infekterar normalt endast människor. De kliniska
syndrom som oftast förknippas med Chlamydia trachomatis omfattar inklusionskonjunktivit, trachom, uretrit, cervicit och andra urogenitala störningar
samt lymphogranuloma venereum (LGV) (1). Överföring av Chlamydia trachomatis kan ske via sexuell kontakt med en infekterad person, då ett foster
passerar genom en infekterad förlossningskanal, eller när det gäller trachom
i utvecklingsländer, i huvudsak genom icke-sexuell direkt personkontakt (2).
nly
eO
Us
Chlamydia trachomatis anses för närvarande som den främsta orsaken till
sexuellt överförda sjukdomar. Tyvärr saknar många infekterade individer
symtom vilket gör att organismen inte upptäcks (3). Hos kvinnor kan odiagnosticerade genitala infektioner leda till permanenta reproduktionsskador på grund av komplikationer såsom salpingit eller inflammationssjukdomar i bäckenet (4,5). Chlamydia trachomatis orsakar även trachom, den främsta orsaken till blindhet i världen som skulle kunna förhindras (6). Tidig diagnos av dessa Chlamydia-infektioner kan leda till
adekvat behandling av sjukdomen och därmed minska risken för komplikationer och vidare överföring.
Tidigare metoder använda för Chlamydia-isolering omfattade odling i mus
eller i gulesäcken för kycklingembryon.
86
Då metoderna för vävnadsodling förbättrades, ersatte dessa de mer
svårhanterliga teknikerna (7,8). Användningen av immunofluorescens och
metoder med monoklonal antikropp för att detektera organismer i vävnadsodlingar har ytterligare ökat känsligheten för Chlamydia-odling och minskat behovet att utföra passage på alla prover (9).
I Pathfinder® konfirmerande system för Chlamydia-odling används en fluoresceinkonjugerad monoklonal antikropp för identifikation av Chlamydiainklusioner i inokulerade cellodlingar. Detta test kombinerar specificiteten
och reproducerbarheten hos monoklonala antikroppar med snabbheten
och enkelheten hos ett direkt fluorescenstest.
Testet erbjuder ett enkelt, känsligt alternativ till andra färgningsmetoder för
detektion av Chlamydia-organismer i odlingar.
Fo
METODENS PRINCIPER
efe
rR
Denna test använder en fluoresceinkonjugerad monoklonal antikropp för
att identifiera Chlamydia i odlingar. Antikroppen reagerar med lipopolysackariddelen hos elementarkropparna och de retikulära kropparna inom
inklusionen. Denna analys detekterar alla kända serologiska varianter av
Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci och Chlamydia pneumoniae.
Den differentierar dock inte mellan arter eller serologiska varianter.
ce
ren
Den monoklonala antikroppen reagerar med Chlamydia-antigen i cellodlingen, om sådana finns närvarande. Obunden antikropp avlägsnas i ett
tvättsteg. Cellodlingsprover som är infekterade med Chlamydia visar vid
granskning under fluorescensmikroskop en specifik äppelgrön fluorescens
av inklusionerna mot en röd motfärgad bakgrund.
Us
TESTREAGENS ENDAST
För In Vitro-Diagnostiskt
•
Förvara antikroppen vid +2–8°C.
•
Monoklonal antikropp: stabila till det sista förbrukningsdatum som är
angivet på etiketten, vid förvaring enligt rekommendationerna.
•
Efter öppnande, monoklonal antikropp: stabila till det sista förbrukningsdatum som är angivet på etiketten, vid förvaring enligt rekommendationerna.
nly
eO
•
1. Monoklonal antikropp för konfirmering av Chlamydia-odling
Flaskan innehåller 4,2 mL fluoresceinkonjugerad murin monoklonal
antikropp mot Chlamydia (genusspecifik) med en proteinstabilisator,
Evans' blue motfärgning och 0,1 % natriumazid. Den flytande antikroppen är utspädd till arbetskoncentration. Spädning av antikroppen
minskar testets känslighet.
Tecken på eventuell försämring:
• Ökad grön bakgrund för kontrollproverna.
• Förändring av förväntad reaktivitet med positiva och negativa kontroller.
87
VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
Endast för professionellt bruk
Reagens innehållande natriumazid
Reagenset innehåller 0,1 % natriumazid. Natriumazid kan reagera med
bly- och kopparrör och bilda högexplosiva metallazider. Spola med stora
mängder vatten så att aziduppbyggnad förhindras när vätska hälls ut.
Ytterligare information finns i den handbok som ges ut av Centers for Disease Control (10).
Fo
Xn. Hälsovådligt
R: 21/22
Farligt vid hudkontakt och förtäring.
S: 24/25-28-36/37/39
Undvik kontakt med huden och ögonen. Vid kontakt med
huden tvätta genast med mycket vatten. Använd lämpliga skyddskläder, skyddshandskar samt skyddsglasögon eller
ansiktsskydd.
ren
efe
rR
Patientprover
Följ vedertagna säkerhetsrutiner för biologiskt riskmaterial vid insamling
och bearbetning av Chlamydia-prov. Men dessa produkter bör handhavas
som potentiellt smittsamma enligt normala försiktighetsåtgärder och god
laboratoriepraxis, oavsett ursprung, behandling eller tidigare certifiering.
Använd lämpligt desinfektionsmedel för sanering. Förvara och kasta material och använda behållare i enlighet med lokala föreskrifter och riktlinjer.
PROVTAGNING OCH FÖRBEREDELSER
ce
Us
Provtagningen har mycket stor betydelse för detektionen av Chlamydia
(11). Personal som tar Chlamydia-prover ska vara välutbildad så att risken
för bristfälliga prover minimeras. Nedan följer en rekommenderad metod
för provtagning av cervixprover och uretraprover hos män.
nly
eO
VARNING! Följ vedertagna säkerhetsrutiner för biologiskt riskmaterial vid
insamling och bearbetning av Chlamydia-prov. Behandla prover och allt
material som kommit i kontakt med proverna som potentiellt smittsamt och
omhänderta det på lämpligt sätt. Munpipettera ej! Undvik aerosolbildning.
Mer information om hur laboratorieinfektioner förhindras finns i referens 12.
Provtagning (cervixprover och uretraprover hos män)
Nödvändigt material
1. Stor tork för att rengöra exocervix på kvinnan före endocervikal
provtagning.
2. Sterila torkar
Använd som ej hämmar tillväxt av Chlamydia eller cellkultur.
3. Transportmedium
Använd transportmedium som ej hämmar tillväxt av Chlamydia eller
cellkultur.
88
Tillvägagångssätt för provtagning
1. Uretraprover
OBS! För en korrekt diagnos måste provet innehålla epitelceller
från insidan av uretra. Dessa celler är mest känsliga för Chlamydia-infektion. (Exsudat är ej lämpligt provmaterial för laboratorieanalys av Chlamydia.) (13)
Instruera patienten att undvika att kasta vatten från och med 1
timme före provtagningen.
efe
2. Cervixprover
rR
Fo
a. För in en liten tork 2–4 cm in i uretra. (Rotera torken något för att
underlätta vid införandet.)
b. Rotera försiktigt torken och använd därvid tillräckligt tryck för att
erhålla epitelceller.
c. Låt torken sitta kvar i 1–2 sekunder.
d. Dra ut torken och placera den omedelbart i transportmediet och
skicka till laboratoriet. Förvara provet i +2–8°C i upp till 24 timmar.
Vid längre förvaring ska provet frysas i -70°C tills det inokuleras på
cellodling.
ren
OBS! Cylinderepitelcellerna i cervixslemhinnan är känsligast för
Chlamydia-infektion (13). Dessa cylinderepitelceller finns precis
innanför cervixöppningen.
ce
I vissa fall kan lokaliseringen av övergångszonen, där det flerskiktade epitelet slutar och cylinderepitelet börjar, variera (14). Genom
att göra på följande sätt säkerställs att proverna är fullgoda.
nly
eO
Us
a. Använd en stor tork för att ta bort överflödigt slem och exsudat från
exocervix. Kasta torken.
b. För in en steril tork i endocervixkanalen ungefär 1–1,5 cm tills större
delen av spetsen befinner sig på insidan av cervixöppningen.
c. Rotera torken i 5–10 sekunder och använd därvid tillräckligt tryck
för att erhålla celler från alla ytor i endocervixkanalen.
d. Dra ut torken. Undvik kontakt med ytorna i vagina. Placera omedelbart torken i transportmediet och skicka till laboratoriet. Förvara
provet i +2–8°C i upp till 24 timmar. Vid längre förvaring ska provet
frysas i –70°C tills det inokuleras på cellodling.
Bearbetning av cellodlingsprover
Nödvändigt material
1. Cellodlingslinje
Använd en cellodlingslinje som är känslig för Chlamydia, t.ex. McCoyceller.
OBS! Valet av cellodlingslinje och dess tillstånd kan påverka känsligheten för detektion av Chlamydia med odlingskonfirmeringstekniken.
89
2. Cellodlingskontroller
•
•
Negativ kontroll – cellodling som inokulerats med transportmedium.
Positiv kontroll - cellodling som inokulerats med ett prov som är
känt för att vara positivt för Chlamydia.
3. Annan materiel och utrustning för cellodling:
•
Odlingsmedier, odlingsflaskor eller mikrotiterplattor, centrifug, CO2inkubator etc.
Cellodlingsförfarande
1. Följ en vedertagen metod, inokulera provet på ett lämpligt cellmonoskikt.
2. Inkubera monoskiktet i 48 timmar.
TESTFÖRFARANDE
rR
Fo
3. Om så önskas, utför passage av monoskiktet och inkubera i ytterligare
48 timmar.
efe
Tillhandahållet material
1. Monoklonal antikropp för konfirmering av Chlamydia-odling
Nödvändig men ej bifogad material
1. Metanolfixativ - histologisk kvalitet eller ACS-kvalitet
ren
2. Avjoniserat vatten
3. Pathfinder® monteringsmedium – Bio-Rad katalognr 30693
ce
4. Skydd för mikrotiterplatta och täckglas (5 mm runda) eller rena mikroskopobjektglas av glas och pincett (beroende på odlingsteknik)
Us
5. Sterila pipetter
6. Fuktkammare
eO
nly
7. Fluorescensmikroskop – för att granska prover som färgats med fluorescein-isotiocyanat med hjälp av ett filtersystem som ger en excitationsvåglängd på 480–490 nm och en emissionsvåglängd på 510 nm
eller högre. Mikroskopfiltrens och ljuskällans typ och tillstånd kan
påverka fluorescensreaktionens intensitet.
Tillvägagångssätt för fluorescensfärgning av cellodling
A. Teknik för mikrotiterplatta
1. Fixering av cellmonoskikt
a. Aspirera försiktigt av odlingsmediet från varje brunn.
b. Tillsätt så mycket metanol att det täcker monoskiktet i varje
brunn. Låt fixera i 10 minuter i rumstemperatur (+23°C± 3°C).
c. Aspirera vätskan från varje brunn med en pipett eller vänd upp
och ned och torka plattan på ett absorberande papper för att ta
bort metanolen. Färga omedelbart.
Förvara plattorna i -70°C om färgningen inte sker omedelbart.
90
2. Färgning av cellmonoskikt
OBS! Fukta med avjoniserat vatten före färgning om cellerna är
torra. (Vänd plattan upp och ned och torka för att ta bort överskottsvätska.)
a. Tillsätt 1 droppe (ungefär 30 µL) monoklonal antikropp för konfirmering av Chlamydia-odling i varje brunn. Antikroppen måste
täcka monoskiktet helt.
b. Täck plattan och inkubera i rumstemperatur (+23°C±3°C) i 30
minuter. Skydda plattan mot kraftigt ljus under inkuberingen.
rR
Fo
c. Avlägsna skyddet från plattan och ta bort den monoklonala antikroppen för konfirmering av Chlamydia-odling från varje brunn
genom att suga upp vätskan med en pipett, eller genom att
vända plattan upp och ned och torka på ett absorberande papper. Skölj med avjoniserat vatten för att ta bort obunden antikropp. Vänd plattan upp och ned och torka på absoberande
papper för att ta bort överskottsvatten.
efe
d. Tillsätt 1 droppe monteringsmedium till varje brunn och lägg på
täckglasen.
ren
OBS! Använd endast Pathfinder® monteringsmedium – BioRad katalognr 30693
ce
3. Vänd mikrotiterplattan upp och ned och undersök brunnarna med
ett fluorescensmikroskop med ett objektiv med lång brännvidd.
Granska hela monoskiktet med en minsta förstoring på 100X.
Bekräfta vid en större förstoring om inklusionen verkar tveksam.
eO
Us
Om nödvändigt kan mikrotiterplattorna förvaras mörkt i 4°C och
avläsas inom 24 timmar.
B. Shell vial-tekniken
1. Fixering av cellmonoskikt
nly
a. Aspirera försiktigt odlingsmediet från varje vial.
b. Tillsätt så mycket metanol att det täcker monoskiktet i varje vial.
Låt fixera i 10 minuter i rumstemperatur (+23°C± 3°C).
c. Ta bort metanolen genom att aspirera med en pipett.
2. Färgning av cellmonoskikt
a. Ta försiktigt bort täckglaset med monoskiktet från vialen med
hjälp av en pincett och placera på ett korrekt märkt, rent objektglas med cellerna uppåt. Färga omedelbart.
OBS! Fukta med avjoniserat vatten om cellerna är torra. (Ta
bort överskottsvätska.)
91
b. Tillsätt 1 droppe (ungefär 30 µL) Pathfinder® monoklonal antikropp för konfirmering av Chlamydia-odling till monoskiktet. Antikroppen måste täcka monoskiktet helt.
c. Inkubera i fuktkammare i rumstemperatur (+23°C±3°C) i 30
minuter. Skydda täckglaset mot kraftigt ljus under inkuberingen.
d. Skölj täckglaset med avjoniserat vatten för att ta bort obunden
antikropp. (Torka bort överskottsvattnet.)
e. Placera 1 droppe monteringsmedium på ett annat korrekt märkt,
rent objektglas. Lägg försiktigt på täckglaset för att undvika luftbubblor, med monoskiktet av celler nedåt.
Fo
3. Undersök objektglasen med ett fluorescensmikroskop. Granska
hela monoskiktet med en minsta total förstoring på 100X. Bekräfta
vid en större förstoring om inklusionen verkar tveksam.
efe
rR
Om nödvändigt kan objektglasen förvaras mörkt i 4°C och avläsas
inom 24 timmar.
OBS! Använd endast Pathfinder® monteringsmedium – Bio-Rad
katalognr 30693
KVALITETSKONTROLL
ce
ren
Verifiera odlingssystem, fluorescensförfarande och mikroskop genom att
analysera positiva och negativa cellodlingskontroller parallellt med varje
omgång patientodlingar.
UTVÄRDERING AV RESULTAT
nly
eO
Us
Avläs kontrollproverna först. Cellodlingskontrollerna underlättar utvärdering av resultat genom att uppvisa positiva och negativa reaktioner på cellinjen som används för patientproverna. Om kontrollerna uppvisar korrekt
reaktivitet, kan patientproverna tolkas. Upprepa testet om kontrollerna inte
reagerar korrekt. Nedan följer beskrivningar för positiva och negativa
resultat.
Positiva resultat
En positiv kontroll eller ett positivt patientprov kommer att uppvisa en karakteristisk fluorescens av cytoplasmatiska inklusioner som är synliga vid
100X förstoring. Inklusionen uppträder som en väldefinierad, äppelgrön,
fluorescerande klump som befinner sig i cytoplasman hos den infekterade
cellen nära cellkärnan. Förekomsten av en eller flera inklusioner per odling
bedöms som positivt. Oinfekterade celler och bakgrunden till infekterade
celler färgas röd till följd av motfärgningen. Icke-specifik färgning kan
urskiljas som en gul, vit eller mörkgrön färg i stället för den förväntade
äppelgröna färgen.
Negativa resultat
Ett negativt prov uppvisar ingen specifik äppelgrön fluorescens. Alla celler
färgas röda till följd av motfärgningen. Icke-specifik färgning är mycket liten.
92
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
1. Om antikroppen torkar på monoskiktet kommer visualisering av inklusioner att försvåras.
2. Prestanda för detta test på patientprover som tagits under eller efter
antimikrobiell behandling är inte känd.
3. Vid detektion av Chlamydia är en korrekt provtagning kritisk. Personal
som tar prover bör vara välutbildad så att risken för bristfälliga prover
minimeras.
4. Användning av monoklonal antikropp för konfirmering av Chlamydiaodling på kliniska direktprover rekommenderas inte. (Bio-Rad har ett
direktprovstest för Chlamydia - katalognr 30704.)
Fo
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
ce
ren
efe
rR
Förväntade värden kan variera beroende på den population som testas.
Bio-Rad utvärderade 402 prover från patienter i högrisk- och lågriskpopulationer med Pathfinder® konfirmerande test för Chlamydia-odling och
MicroTrak™ konfirmerande test av odling. Varje brist på överensstämmelse som kvarstod efter passage,utreddes med Ortho Diagnostics cellodlingsanalys för Chlamydia. Den totala överensstämmelsen mellan
testerna var 99,5 % för primärodling och 100,0 % efter passage. Endast 1
prov som var negativt vid primärodling var positivt efter passage. Vid jämförelse med konkurrenternas test var både känsligheten och specificiteten
för detta test efter primärodling och passage av cellodling 100,0 %. (Mer
information finns i avsnittet Särskilda egenskaper.)
SÄRSKILDA EGENSKAPER
Us
nly
eO
Tre oberoende laboratorier utvärderade Pathfinder®-reagensernas
förmåga att detektera Chlamydia i cellodling. De oberoende studieställena
omfattade laboratorier i östra, södra och västra USA. Syvas MicroTrak™
konfirmerande test av odling användes som referensmetod och Ortho
Diagnostics test användes för att komma till klarhet med eventuell diskrepans efter passage.
Cellprov togs från endocervix eller uretra från varje patient och placerades
i transportmedium för inokulering i cellodling. Vid två av laboratorierna
inokulerades 5 McCoy-cellmonoskikt för varje patient. Efter inkubering av
odlingarna i 48 timmar färgades 2 av dessa monoskikt, ett med Pathfinder®-reagens och ett med MicroTrak™-reagens. För odlingar med negativa eller avvikande resultat för primärodlingen, avbröts de återstående 3
odlingarna och passerades till 3 nya monoskikt. Efter ytterligare 48 timmar
inkubering färgades 2 av dessa monoskikt, ett med Pathfinder®-reagens
och det andra med MicroTrak™-reagens. Då det behövdes testades den
återstående passageodlingen med Orthos reagens för att komma till klarhet med eventuell diskrepans. Det tredje laboratoriet inokulerade 3
monoskikt per patient och gick till väga enligt ovanstående, förutom i de
93
fall då det var tvunget att avbryta det återstående monoskiktet och utföra
passage till 3 nya monoskikt.
Odlingar med 1 eller flera inklusioner efter den första inkuberingen eller
efter avbrott och ny passage, bedömdes positiva.
Prover togs från 2 populationer – med hög respektive låg risk. Högriskpopulationen omfattade män och kvinnor som besökte kliniker för sexuellt
överförda sjukdomar med urogenitala symtom eller symtomfria personer i
kontakt med personer med en sexuellt överförd sjukdom. Totala prevalens
av Chlamydia i denna population var 23,5 %. Lågriskpopulationen omfattade kvinnor som besökte kliniker för rutinmässiga obstetriska eller
gynekologiska undersökningar eller som uppfyllde följande kriterier:
Fo
1) äldre än 25 år, 2) inga tecken på purulent flytning från cervix, cervikal
ektopi eller skörhet och 3) ingen kontakt med någon person med symtom
på sexuellt överförd sjukdom eller patogen. Total prevalens av Chlamydia i
denna population var 10,0 %.
efe
rR
Prestanda för Pathfinder® konfirmerande test av odling jämfört med
konkurrenternas tester efter primär- och passageodling specificeras i
tabell 1.
Tabell 1 – Jämförelse av Pathfinder® konfirmerande test av odling och
konkurrerande tester, efter primär- och passageodling
ren
Högriskpopulation
302
ce
n
Lågriskpopulation
100
Känslighet
SP
SP + FN
100,0%
71
71
Specificitet
SN
SN + FP
100,0%
231
231
Positivt
prediktivt
värde
SP
SP + FP
100,0%
71
71
100,0%
Negativt
prediktivt
värde
SN
SN + FN
100,0%
231
231
100,0%
Kumulativ
(högrisk- och
lågriskpopulation)
402
10
10
100,0%
81
81
100,0%
90
90
100,0%
321
321
10
10
100,0%
81
81
100,0%
321
321
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Us
100,0%
90
90
OBS! SP = sant positiv, FP = falskt positiv, FN = falskt negativ, SN = sant negativ.
I tabell 2 sammanfattas data för jämförelse mellan Pathfinder® odlingskonfirmerande reagens och MicroTrak™-reagens efter enbart primärodling.
94
Tabell 2 – Jämförelse mellan Pathfinder® odlingskonfirmerande reagens och
MicroTrak™-analysen efter enbart primärodling
Högriskpopulation
n
Lågriskpopulation
302
Känslighet
SP
SP + FN
Kumulativ
(högrisk- och
lågriskpopulation)
100
69
69
Specificitet
SN
SN + FP
Positivt
prediktivt
värde
SP
SP + FP
Negativt
prediktivt
värde
SN
SN + FN
402
100,0%
9
9
100,0%
99,6%
232*
233
78
78
98,9%
90*
91
99,4%
322*
324
98,6%
69*
70
90,0%
9*
10
97,5%
78*
80
100,0%
232
232
100,0%
90
90
100,0%
322
322
rR
Fo
100,0%
efe
* Två prover som var positiva vid primärodlingen med Pathfinder®-testet och negativa
med MicroTrak™-testet var positiva med antingen MicroTrak™- eller Ortho-metoden vid
passage. Om dessa prover betraktas som sant positiva blir specificiteten och det positiva
prediktiva värdet för högrisk- och lågriskpopulationer samt de kumulativa populationerna
100 %.
ren
Prestanda för de kvinnliga och manliga högriskpopulationerna var jämförbara.
ce
I tabell 3 specificeras antalet positiva resultat efter primärodling och efter
primärodling och passage. Med Pathfinder®-reagenset detekterades
2,5 % fler positiva resultat efter primärodling jämfört med MicroTrak™reagenset. Användning av Pathfinder®-testet på en passageodling resulterade i 1,2 % fler positiva resultat än vid enbart primärodling.
Us
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Tabell 3 – Chlamydia-detektion för primärodling och
efter primär- och passageodling
Primär-odling Passage-odling
80
Positiva med MicroTrak™
78
Positiva med Pathfinder
81
80
95
nly
®
KORSREAKTIVITET
Bio-Rad testade organismerna i tabell 4 med avseende på eventuell
korsreaktivitet för Pathfinder® konfirmerande test för Chlamydia-odling.
De angivna organismerna testades på objektglas med fixerade substrat
och uppvisade ingen korsreaktivitet med Pathfinder® monoklonal antikropp.
Tabell 4 – Korsreaktivitetsstudier med potentiella cellodlingsföroreningar
Reaktivitet med konfirmeringsantikroppen
för Chlamydia-odling
Organism
Herpes virus
Cytomegalovirus
Negativ
Herpes simplex typ I
Negativ
Fo
Herpes simplex typ II
Negativ
Varicella zoster-virus
Negativ
Mycoplasma arginini
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma salivarium
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
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Mycoplasma orale
Negativ
efe
Mycoplasma hominis
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Acholeplasma laidlawii
Negativ
ce
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96
REFERENCES/BIBLIOGRAPHIE/REFERENCIAS/LITERATUR/
BIBLIOGRAFIA/BIBLIOGRAFIA/REFERENCER/REFERENSER
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efe
rR
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nly
eO
Us
98
ce
ren
efe
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Fo
nly
eO
Us
Bio-Rad
Laboratories
ce
ren
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Website: www.bio-rad.com
Bio-Rad Laboratories Main Office:
4000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547
Ph. (510) 724-7000, Fx. (510) 741-5824
Also in:
Australia - Regents Park, Ph. 61-2-9914-2800,
Fx. 61-2-9914-2888
Austria - Vienna, Ph. 43-1-877-8901, Fx. 43-1-876-5629
Belgium - Nazareth, Ph. 32-9-385-5511, Fx. 32-9-385-6554
Canada - Montreal, Ph.1-514-334-4372,Fx. 1-514-334-4415
China - Beijing, Ph. 86-10-6205-1850, Fx. 86-10-6205-1876
Denmark - Copenhagen, Ph. 45-39-17-99-47,
Fx. 45-39-27-16-98
Finland - Espoo, Ph. 358-9-804-22-00, Fx. 358-9-804-11-10
France - Marnes-la-Coquette, Ph. 33-1-4795-6000
Fx. 33-1-4741-9133
Germany - Munich, Ph. 49-89-318840, Fx. 49-89-318-84100
Hong Kong - Kowloon, Ph. 852-2789-3300,
Fx. 852-2789-1257
India - New Delhi, Ph. 91-11-460-3676, Fx. 91-11-461-0765
Israel - Rishon Le Zion, Ph. 972-3-9514127,
Fx. 972-3-9514129
Italy - Milan, Ph. 39-02-216091, Fx. 39-02-21609-399
Japan - Tokyo, Ph.81-3-5811-6290, Fx. 81-3-5811-6282
Korea - Seoul, Ph. 82-2-3473-4460, Fx. 82-2-3472-7003
Florida - Miami, Ph. 305-894-5950, Fx. 305-894-5960
Mexico - Mexico D.F., Ph. 525-514-2210, Fx. 525-514-2209
The Netherlands - Veenendaal, Ph. 31-318-540666,
Fx. 31-318-542216
New Zealand - Auckland, Ph. 64-9-415-2280,
Fx. 64-9-415-2284
Russia - Moscow, Ph. 7-501-721-14-00, Fx. 7-095-979-98-56
Singapore, Ph. 65-272-9877, Fx. 65-273-4835
Spain - Madrid, Ph. 34-91-590-5200, Fx. 34-91-590-5211
Sweden - Sundbyberg, Ph. 46-8-627-50-00,
Fx. 46-8-627-54-00
Switzerland - Glattbrugg, Ph. 41-61-717-95-55,
Fx. 41-61-717-95-50
United Kingdom - Hemel Hempstead, Ph. 44-181-328-2000,
Fx. 44-181-328-2550
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Revised September 2003
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