Sistema LightScanner
Rilevazione delle mutazioni e
genotipizzazione ad alta resa
Distributore per l’Italia
®
Sistema LightScanner
• La caratteristica che contraddistingue il sistema
LightScanner è la tecnica High Resolution Melting (Hi-Res
Melting™).
– Hi-Res Melting è una tecnica post PCR per la rilevazione e lo
scanning delle mutazioni omogenee.
 VELOCE – risultati in meno di 5 minuti.
 SEMPLICE – nessun procedimento post PCR.
 ECONOMICO – costi nettamente inferiori rispetto alla
concorrenza
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Scanning con Hi-Res Melting
• Tubo-chiuso
– dye dsDNA prima della PCR
– Nessun processamento, aggiunte o separazioni
– Nessuna esposizione esterna
• Rapido
– 5-10 min per 96/384 campioni
• Non distruttivo
– Se necessario, è possibile eseguire procedimenti
downstream (ex: sequenziamento)
• Manutenzione minima
– Smaltimento dei rifiuti non dispendioso
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Componenti essenziali
della Hi-Res Melting
• Dye specifico per DNA a doppio filamento
• LCGreen Plus™, specifico per la rilevazione degli eteroduplex
che si formano durante la PCR, è prodotto esclusivamente da
Idaho Technology.
• Strumentazione ad alta risoluzione
• Lo strumento LightScanner è progettato specificatamente per
le applicazioni Hi-Res melting
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Dye LCGreen® Plus
• LCGreen Plus rileva gli eteroduplex, a differenza dei dye usati
tradizionalmente per la real-time PCR (ex: SYBR Green I)
50
50
45
45
LCGreen Plus
-dF/dT
40
SYBR® Green I
40
35
35
30
30
Heteroduplexes
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
72
74
76
78
80
82
Temperature (°C)
84
86
72
74
76
78
wild type
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80
82
84
heterozygote
86
LC Green – un dye “di saturazione”
Dye non saturante
Dye saturante
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Strumento LightScanner
• Disponibile per piastre
da 96 o da 384 pozzetti
• Uniformità sulla piastra
+/- 0.15°C
• 100 punti di rilevamento
raccolti per °C a
0.10 °C/sec
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Tecnica Hi-Res Melting
1.
Amplificazione dei campioni con il dye LCGreen
•
2.
2 ore inclusa la preparazione della PCR
Melting dei campioni
•
3.
5-10 minuti
Analisi dei dati
•
4.
5-10 minuti
Recupero dei campioni per il sequenziamento (se
necessario)
•
30-60 minuti
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Melting Curves
Heterozygote Amplification
Observed Combination
of 4 Duplexes
Two
Heteroduplexes
Two
Homoduplexes
T
A
C
A
C
G
T
G
Temperature
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Analisi di melting
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Analisi di melting
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Analisi di melting
SNP 1
homozygote
SNP 1 + 2
SNP 1
SNP 2
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Analisi di melting
SNP 1 + 2
SNP 1
SNP 2
SNP 1
homozygote
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Prodotto di 100 bp
C/C Omozigote
C/G Eterozigote
C/T Eterozigote
C/A Eterozigote
• Gli omozogoti vengono
facilmente distinti dagli
eterozigoti
• Eterozigoti diversi tra
loro tracciano profili di
melting unici
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Rilevazione delle varianti
omozogotiche
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“Blinded Samples” di tumore
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Dosaggio del target
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Utilizzo di un “toolbox” DNA come sistema
modello per l’individuazione delle mutazioni
• Highsmith et al., Electrophoresis (1999)
• Plasmidi costruiti con un contenuto in GC di 40%, 50%, e 60% e
con A, C, G, o T in posizione uno
• Primers di PCR spaziati di 50 bp su ogni filamento
     
X
     
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Reed and Wittwer
Clin. Chem. 2004,
50(10): 1748-54
Sensibilità e specificità
Sensibilità e specificità in
funzione della lunghezza del
prodotto
•N=1248, ogni strumento
•Tre target differenti
•Tutti gli SNPs e i WTs
possibili
Clin Chem. 2004;50:1748-54.
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Benefici del sistema
Hi-Res Melting
• Hi-Res Melting utilizzando strumenti per real-time PCR
– Gli strumenti per real-time PCR in commercio non permettono il controllo
preciso della temperatura, l’acquisizione della totalità dei dati e non sono
dotati di un software di analisi che garantisca un corretto sviluppo del
metodo.
Caratterisica
LightScanner
Piattaforme
Real-time
Alta
Bassa
Software di analisi specifico
per la Hi-Res Melting
Sì
No
Compatibilità con la
fluorescenza
Sì
Non tutti sono
compatibili con il dye
LCGreen
5 minuti
>30 minuti
Risoluzione
Risultato in
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Benefici del sistema
Hi-Res Melting
• La capacità dell’analisi di melting dipende direttamente dalla
risoluzione dello strumento utilizzato
• La precisione delle curve di melting permette l’identificazione di
campioni genotipicamente diversi tra loro
HR-1 Instrument
Commercial Real-Time
PCR Instrument
Curve melting normalizzate di un amplicone di 110-bp in presenza del dye LCGreen Plus. I dati
mostrano i vantaggi del sistema Hi-Res Melting. I profili reali di Hi-Res Melting permettono la
distinzione tra campioni wild type (AA) in verde, mutanti eterozigoti (AT) in blu e mutanti
omozigoti (TT) in rosso.
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Processamento del campione
Tempo necessario per processare 96 campioni
Presupposti:
DHPLC a 2 temperature
Sequenziamento in una direzione con utilizzo del sequenziatore a 48 capillari e del software per la rilevazione
Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK
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Costi
Costi per DHPLC, FSSCP e sequenziamento basati sui costi reali per campioni
processati nel biennio 2002-2003. Costi per la Hi-Res Melting basati sul costo reale e
stimato dei consumabili
Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK
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È possibile eliminare il 99%
dei sequenziamenti?
~ 90%
Normale
Scanning dei frammenti
di PCR per le varianti
Wild type
~10% Anomalo
Genotipizzazione con
sonda non marcata
delle varianti note
~ 9%
Identificato
~1% Non identificato
Sequenziamento
del DNA
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Variante
genotipizzata
Conclusioni
• Nel sistema LightScanner sono già incluse tutte le
componenti necessarie al successo nelle applicazioni Hi-Res
Melting
– Dye LCGreen Plus
– Master Mix per LightScanner
– Strumento LightScanner
• Software disponibile per la progettazione di test, la rilevazione delle
mutazioni e la genotipizzazione
– Protocolli on-line
• Risparmio di tempo e denaro
• Alta resa nella rilevazione delle mutazioni e nello scanning
dei geni
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Per maggiori informazioni sul sistema LightScanner
Vi preghiamo di contattare:
Labogen S.r.l. (distributore per l’Italia)
Tel.: 02.9390.7515 – Fax: 02.9390.9417
[email protected]
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