Cinetica dei processi fotofisici Si studia la velocità con cui le molecole allo stato eccitato si interconvertono e decadono allo stato fondamentale M+hυ→M* M*→M** M**→M Sono tutte reazioni del I ordine del tipo kv A→B La velocità di reazione per le reazioni unimolecolari del I ordine d [A] = − kv [A] dt Le unità di misura di kv sono s-1. Caso ideale: eccitazione e diseccitazione mediante fluorescenza d[M * ] = −k f [ M * ] dt M+hυ→M* Impulso di eccitazione diseccitazione M*→M +hυ’ f d[M * ] = − k f dt * [M ] k | M * |(t ) t d[ M * ] − = ∫ − k f dt * ∫* [M ] 0 | M |( t = 0 ) [ M ](t ) = [ M ]( t = 0) e * * − ( k f )t f = [ M * ]( t = 0 ) e − t / τ 0 F1 * |M |(t=0) * |M | τ 0f = 1 kf Tempo di vita naturale della fluorescenza * |M |(t=0)/e τ0 f time Nota sulla terminologia: Un f ad apice indica un processo radiativo Un f al pedice indica processi radiativi e non radiativi che possono essere misurati mediante fluorescenza. Lo 0 al pedice indica processo fondamentale. Relazione fra tempo di vita naturale e momento di dipolo di transizione Coeff A (emissione spontanea) di Einstein k f = A0−1 3 ⎛υ ⎞ A0 −1 = 8πh⎜ ⎟ B0 −1 ⎝c⎠ La probabilità di assorbimento (coeff B di Einstein) dipende da | µif |2 A0 −1 ∝ B0 −1 ∝| µ0 −1 |2 k = A0 −1 = 2.881 ⋅ 10 υ0 −1 ⋅ n ⋅ IAC0 −1 f 9 2 n è l’indice di rifrazione medio del solvente nell’intervallo della banda di assorbimento Considerando le relazioni precedenti e l’area effettiva delle bande di assorbimento, si può trovare un buon accordo tra il reciproco della costante di velocità della fluorescenza (calcolata dalla IAC) e il tempo di vita naturale misurato. τf calc (ns) τf expc (ns) Benzene 407 414 Alcol benzilico 237 362 toluene 174 200 Etilbenzene 185 172 p-xilene 92.5 75 Fluorobenzene 33.8 61.5 Tetracene 27.1 30.5 Fenolo 29 26 9,10-diclorobenzene 10.4 15.5 Antracene 12.9 13.8 9-metilantracene 13.6 13.1 9,10-difenilantracene 8.4 9.35 perilene 4.7 6.8 εmax ~ 5 104 l / mol cm Larghezza banda 3000 cm –1 ūmax 35000 cm –1 (290 nm) n~1 εmax ~ 10 l / mol cm (transizioni proibite per simmetria) εmax ~ 0.01 l / mol cm (transizioni proibite per spin) τ calf = 1 = 1.2 ns f kcal τ calf = 1 = 6 µs f kcal ph τ cal = 1 = 6 ms ph kcal Condizioni stazionarie d[M * ] = − k0f [ M * ] + I 0 = 0 dt I0 lo considero come moli fotoni/s I [ M * ] = 0f k0 Mi posso calcolare la resa di fluorescenza? Si. Φf = k0f [ M * ] Φf = = I0 If I abs I0 k0f k0f If = k |M | f 0 * = I0 = 1 In presenza di un rilassamento non radiativo E k0f k0 d[M * ] = −(k0f + k0 )[ M * ] + I 0 = 0 dt I [M * ] = f 0 k0 + k0 k0f [ M * ] Φf = = I0 k0f = I0 k0f k0f + k0 = f I0 k0 + k0 Misura di tempi di vita con tecniche risolte nel tempo Flash photolysis Il campione è sottoposto ad un impulso (corto rispetto ai processi di decadimento). Si segue l’andamento nel tempo del segnale di assorbimento/luminescenza d[M * ] = −(k0f + k0 )[ M * ] dt [ M * ] = [ M * ]t = 0 e * |M |(t=0) * |M | τ=1/k0 f τ=1/(k0 +k0) time f − ( k 0f + k 0 ) t Notare il posizionamento del campione La luce di emissione deve attraversare il campione, ma la luce di scattering dell’eccitazione non arriva al rivelatore. Va bene per campioni solidi (film, strati sottili, polveri disperse,…) Time-correlated Single photon counting Continuo Fotone singolo Principio Il principio su cui si basa il Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) è paradossalmente contrario a quello che viene sfruttato gran parte delle misure di fluorescenza: si cercano di ottimizzare le condizioni in modo da avere il maggior numero di fotoni emessi che raggiungono il detector; ciò aumenta la sensibilità della misura. Nel TCSPC,invece, si opera a bassa intensità di eccitazione. Vengono mandati degli impulsi di luce e si rivelano i fotoni emessi. La probabilità che un fotone arrivi al rivelatore diminuisce al diminuire dell'intensità, e al diminuire della lunghezza dell'impulso. In condizioni estreme, si avrà che ad ogni impulso si potrà rilevare l'emissione di 0, 1 o 2 fotoni. I tempi di attesa della rivelazione del primo fotone avranno una distribuzione (temporale) uguale al segnale di decadimento della fluorescenza. Si deve lavorare a basso flusso di fotoni emessi, quindi grande sensibilità dell’apparecchiatura. Alta frequenza di ripetizione (kHz o MHz) per ridurre il tempo di acquisizione di un numero sufficiente di fotoni Eseguendo l'esperimento un alto numero di volte, si può fare una statistica dei tempi di attesa dell'arrivo del primo fotone. Se fra due esperimenti non si nota l'arrivo di alcun fotone, l'esperimento viene scartato. Rispetto ad altre tecniche (gating) non c'e' nessuna perdita di segnale. Detection tramite time-to-amplitude converter (TAC) Laser, lampada The events are collected in memory by adding a ‘1’ in a memory location with an address proportional to the detection time. After many photons the histogram of the detection times, i.e. the waveform of the optical pulse, builds up in the memory. Although this principle looks complicated at the first glimpse, it is very efficient and accurate for the following reasons: The accuracy of the time measurement is not limited by the width of the detector pulse. Thus, the time resolution is much better then with the same detector used in front of an oscilloscope or another linear signal acquisition device. Furthermore, all detected photons contribute to the result of the measurement. Nel multicananale ad ogni casella corrisponde un certo delay dallo start. La risoluzione temporale migliora in quanto la risposta dello strumento non dipende dalla forma del segnale del singolo fotone. Si raggiunge una risoluzione della decina di ps. A: forma dell’impulso di eccitazione B: profilo di decadimento sperimentale C: fitting monoesponenziale D: residui (B-C) Acido 2-toluinidil naftalensolfonico Il fitting è stato eseguito con una funzione F (t ) = F(t = 0 ) ⋅ e −t / τ f La funzione di autocorrelazione rende conto delle fluttuazioni della fluorescenza nel tempo rispetto al valore medio. La Fluorescence Correlation Spectroscopy viene usata soprattutto per misure ‘single molecule’ Il fitting monoesponenziale non va bene. Il fitting richiede una analisi multiesponenziale F (t ) = ∑ α i ⋅ e − t / τ if i F (t ) = (miscela 1:1) = α ant ⋅ e f − t / τ ant + α 9 cant ⋅ e − t / τ 9fcant α ant = α 9 cant = 0.5 f τ ant = 4.2 µs τ 9fcant = 11.8 µs Possibili cause del decadimento multiesponenziale: A) Più specie che emettono B) Cinetica di interconversione fra specie nello stato eccitato: equilibrio acido/base, complessazione, isomerizzazione,… Detector ultraveloci Le massime risoluzioni temporali si ottengono con le STREAK CAMERA. In tali dispositivi i fotoelettroni emessi in tempi leggermente diversi subiscono una diversa deflessione nel loro viaggio al catodo in quanto passano attraverso un campo elettrico che viene rapidamente variato. Gli elettroni vengono rivelati quindi ad uno screen. Svantaggi: Bassa sensibilità Rumore e- fotocatodo Sweep voltage t Rivelazione con fosfori e CCD (segnale video) La quantità k0f = 1/ τ0f non è facilmente misurabile. Misura del tempo di vita naturale S0 S1 IC ISC k IC T1 k0 M* → M +hυ k ISC k0 f f M* M* d[M * ] = −(k0f + k IC + k ISC )[ M * ] dt k IC → M’ k ISC → M** K f = k0f + k IC + k ISC Più in generale S1 k1 k2 k3 ….. τf= 1 1 = ∑kj K f j Tempo di vita 1 einstein=1 mol fotoni I0 I0 è la densità di fotoni al campione. Tali fotoni (espressi in mol/l) li indico con [hν]. Nel processo di assorbimento parte di questi fotoni verranno assorbiti. La velocità di assorbimento è proporzionale alla densità di radiazione elettromagnetica (fotoni), la esprimo come d [ hν ] = − kabs [ M ] ⋅ [hν ] ∝ I abs dt hν’ fotoni emessi per fluorescenza hν” fotoni emessi per fosforescenza Φf = If I abs d [ hν ' ] = k0f [ M * ] dt d [ hν ' ] k0f [ M * ] dt = = d [hν ] kabs [ M ] ⋅ [hν ] − dt Possiamo utilizzare una delle espressioni precedenti per ricavare la conc delle molecole M* [M * ] = kabs [ M ] ⋅ [hν ] k0f + ∑ k0,i i k0f [ M * ] Φf = = kabs [ M ] ⋅ [hν ] poiché k0f kabs [ M ] ⋅ [hν ] kabs [ M ] ⋅ [hν ] k0f + ∑ k0,i = f 0 i k k0f + ∑ k0,i i τf= 1 1 = ∑kj K f j 1 τ 0f = f k0 Φf = τf τ 0f Φf ≤1 Il tempo di vita naturale può quindi essere ottenuto da una misura di tempo di vita e una misura di resa quantica di fluorescenza Resa quantica di fosforescenza k ISC T1 k Φ ph d | hν | = − kabs | M | ⋅ | hν | dt ph 0 d [ hν " ] = dt = d [ hν ] − = dt d [hν " ] = k0ph | M ** | dt k1.... d [ M ** ] = dt ⎞ ⎛ − ⎜⎜ k 0ph + ∑ k j ⎟⎟[ M ** ] + k ISC [ M * ] j ⎠ ⎝ = N.o mol.fosfor. p. u. v. t N.o fot. ass. p. u. v. t. Stato stazionario Φ ph k0ph [ M ** ] = kabs [ M ][hν ] Φ ph k0ph k ISC = K ph K f ϑ ph ϑISC Resa di tripletto k ISC [ M * ] k ISC [ M * ] [ M ] = ph = k0 + ∑ k j K ph ** j [M * ] = k | [ M ] ⋅ [hν ] = abs Kf ϑISC ϑ ph Probabilità che una molecola fotoeccitata M* una volta formata sia sottoposta ad ISC al tripletto Probabilità che una molecola fotoeccitata M** una volta formata emetta fosforescenza Resa di tripletto ϑISC = ΦT = ΦT = ϑISC no di molecole di tripletto formato nell' unità di tempo e volume no di molecole di fotoni assorbiti nell' unità di tempo e volume k ISC = Kf Misure di τ0ph implicano misure di τ ph Φ ph = ΦT ph τ0 Φ ph ,ΦT ,τ ph Come si può avere una fluorescenza con vita lunga v impulso S1 Fluorescenza ritardata di tipo E T K f , ph = k0f , ph + ∑ k j ISC’ Kf ISC j Kph Dopo pochi τf non ci sono più molecole S1 ottenute per eccitazione diretta di S0. Applico lo stato stazionario all’intermedio S1 in T→S1→ S0 (OK se considero intervalli non troppo lunghi) j=IC,ISC,0,…. Da che parametri dipende la fluorescenza ritardata? ISC’ Kf ISC Kph M*d: molecole S1 eccitate per ISC’ che danno fluor. ritardata M**vib: molecole T1 che possono dare ISC’. M**: molecole T1 rilassate a v=0 che possono dare ph. Per avere la velocità di fluorescenza ritardata devo conoscere [M*d] d [ M d* ] ** = −(k0f + K f )[ M d* ] − k ISC '[ M vib ] dt ** Applico lo stato k ISC '[ M vib ] * [ M ] = d stazionario a M*d: (k0f + K f ) (vale dopo pochi τf ) da cui ** ] k0f k ISC '[ M vib ** k [ M ] I d . f . ∝ k [M ] = = Φ ' f ISC vib f k0 + K f f 0 * d Prevedo di avere un tempo di decadimento comparabile con quello di un tripletto. Devo trovare [M**vib] ISC’ S1 T1 ∆ES −T = = ∆Ev = vib − ∆Ev = 0 ⎡ ∆E ⎤ I d . f . ∝= Φ f k ISC '[ M ** ] exp ⎢ S −T ⎥ ⎣ RT ⎦ Poiché I ph ∝ k0ph [ M ** ] Id. f . I ph k ISC ' − = Φ f ph e k0 ∆E S −T RT Misure di resa quantica di tripletto vengono fatte mediante misure di quenching Supponiamo esista un eq. termico ** [ M vib ] ⎡ ∆E S − T ⎤ = − exp ** ⎢ [M ] ⎣ RT ⎥⎦ ⎡ ∆E S − T ⎤ ** [ M vib ] = [ M ** ] exp ⎢− ⎣ RT ⎥⎦ Fluorescenze in sistemi con equilibrio a-b b a DMABN kba b LE k0,bf kab Kb a TICT Ka ⎧ d [a] ⎪⎪ dt = −( K a + kab )[a ] + kba [b] ⎨ ⎪ d [b] = I − ( K + k )[b] + k [a ] 0 b ba ab ⎪⎩ dt f k0,a F (t ) = F(t = 0) ⋅ e −t / τ f DMABN/diossano La soluzione dà funzioni multiesponenziali kba kba ⎧ [a] − λ1t = ⋅ − ⋅ e − λ1t e ⎪ b(t = 0) λ − λ λ2 − λ1 ⎪ 2 1 ⎨ ⎪ [b] = ( K a + k ab ) − λ1 ⋅ e − λ1t − ( K a + kab ) − λ2 ⋅ e − λ 2 t ⎪⎩ b(t = 0) λ2 − λ1 λ2 − λ1 λ1, 2 = { 1 ( K a + k ab + K b + kba ) m ( K a + k ab − K b − kba ) 2 + 4kab kba 2 } K a = 5 ⋅ 108 s −1 A K b = 1 ⋅ 109 s −1 1.0 −1 kba = 100 ⋅ 10 s 9 { 0.8 −1 } 1 λ1, 2 ≈ (121.5 ⋅ 109 s −1 ) m (80 ⋅ 109 s −1 ) 2 + 8000 ⋅ 109 s − 2 2 120 ⋅ 109 s −1 => τ 1 = 0.008ns 9 −1 9 −1 = (121.5 ⋅ 10 s m 120.3 ⋅ 10 s ) / 2 = 0.6 ⋅ 109 s −1 => τ 2 = 1.7 ns Parametri di DMABN/t-butil cloruro Ka 0.5 Kb 1 kab 20 kba 100 0.6 Int k ab = 20 ⋅ 10 s 9 Kka 20.5 KKb 101 Kka+KKb 121.5 rad 14480.25 lambda1 0.583044784 b1 b2 0.16551407 a1 a2 1 -1 0.4 lambda2 120.9169552 0.83448593 0.2 0.0 0.0 0.1 0.2 time 0.3