Cinetica dei processi fotofisici
Si studia la velocità con cui le molecole allo stato eccitato si interconvertono e
decadono allo stato fondamentale
M+hυ→M*
M*→M**
M**→M
Sono tutte reazioni del
I ordine del tipo
kv
A→B
La velocità di reazione per le reazioni unimolecolari del I ordine
d [A]
= − kv [A]
dt
Le unità di misura di kv sono s-1.
Caso ideale: eccitazione e diseccitazione mediante fluorescenza
d[M * ]
= −k f [ M * ]
dt
M+hυ→M* Impulso di
eccitazione
diseccitazione
M*→M
+hυ’
f
d[M * ]
= − k f dt
*
[M ]
k
| M * |(t )
t
d[ M * ]
−
= ∫ − k f dt
*
∫*
[M ] 0
| M |( t = 0 )
[ M ](t ) = [ M ]( t = 0) e
*
*
− ( k f )t
f
= [ M * ]( t = 0 ) e − t / τ 0
F1
*
|M |(t=0)
*
|M |
τ 0f =
1
kf
Tempo di vita naturale
della fluorescenza
*
|M |(t=0)/e
τ0
f
time
Nota sulla terminologia:
Un f ad apice indica un processo radiativo
Un f al pedice indica processi radiativi e non
radiativi che possono essere misurati mediante
fluorescenza.
Lo 0 al pedice indica processo fondamentale.
Relazione fra tempo di vita naturale e momento di dipolo di transizione
Coeff A (emissione spontanea) di Einstein
k f = A0−1
3
⎛υ ⎞
A0 −1 = 8πh⎜ ⎟ B0 −1
⎝c⎠
La probabilità di assorbimento (coeff B di Einstein)
dipende da | µif |2
A0 −1 ∝ B0 −1 ∝| µ0 −1 |2
k = A0 −1 = 2.881 ⋅ 10 υ0 −1 ⋅ n ⋅ IAC0 −1
f
9
2
n è l’indice di rifrazione medio
del solvente nell’intervallo della
banda di assorbimento
Considerando le relazioni precedenti e l’area effettiva delle bande di assorbimento, si può trovare
un buon accordo tra il reciproco della costante di velocità della fluorescenza (calcolata dalla IAC)
e il tempo di vita naturale misurato.
τf calc (ns)
τf expc (ns)
Benzene
407
414
Alcol benzilico
237
362
toluene
174
200
Etilbenzene
185
172
p-xilene
92.5
75
Fluorobenzene
33.8
61.5
Tetracene
27.1
30.5
Fenolo
29
26
9,10-diclorobenzene
10.4
15.5
Antracene
12.9
13.8
9-metilantracene
13.6
13.1
9,10-difenilantracene
8.4
9.35
perilene
4.7
6.8
εmax ~ 5 104 l / mol cm
Larghezza banda 3000 cm –1
ūmax 35000 cm –1 (290 nm)
n~1
εmax ~ 10 l / mol cm
(transizioni proibite per simmetria)
εmax ~ 0.01 l / mol cm
(transizioni proibite per spin)
τ calf =
1
= 1.2 ns
f
kcal
τ calf =
1
= 6 µs
f
kcal
ph
τ cal
=
1
= 6 ms
ph
kcal
Condizioni stazionarie
d[M * ]
= − k0f [ M * ] + I 0 = 0
dt
I0 lo considero come moli fotoni/s
I
[ M * ] = 0f
k0
Mi posso calcolare la resa
di fluorescenza? Si.
Φf =
k0f [ M * ]
Φf =
=
I0
If
I abs
I0
k0f
k0f
If = k |M |
f
0
*
=
I0
= 1
In presenza di un rilassamento non radiativo
E
k0f
k0
d[M * ]
= −(k0f + k0 )[ M * ] + I 0 = 0
dt
I
[M * ] = f 0
k0 + k0
k0f [ M * ]
Φf =
=
I0
k0f
=
I0
k0f
k0f + k0
= f
I0
k0 + k0
Misura di tempi di vita con tecniche risolte nel tempo
Flash photolysis
Il campione è sottoposto ad un impulso
(corto rispetto ai processi di decadimento).
Si segue l’andamento nel tempo del
segnale di assorbimento/luminescenza
d[M * ]
= −(k0f + k0 )[ M * ]
dt
[ M * ] = [ M * ]t = 0 e
*
|M |(t=0)
*
|M |
τ=1/k0
f
τ=1/(k0 +k0)
time
f
− ( k 0f + k 0 ) t
Notare il posizionamento
del campione
La luce di emissione deve
attraversare il campione,
ma la luce di scattering
dell’eccitazione non
arriva al rivelatore. Va
bene per campioni solidi
(film, strati sottili, polveri
disperse,…)
Time-correlated
Single photon counting
Continuo
Fotone singolo
Principio
Il principio su cui si basa il Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) è paradossalmente contrario a quello
che viene sfruttato gran parte delle misure di fluorescenza: si cercano di ottimizzare le condizioni in modo da avere il
maggior numero di fotoni emessi che raggiungono il detector; ciò aumenta la sensibilità della misura.
Nel TCSPC,invece, si opera a bassa intensità di eccitazione. Vengono mandati degli impulsi di luce e si rivelano i
fotoni emessi. La probabilità che un fotone arrivi al rivelatore diminuisce al diminuire dell'intensità, e al diminuire
della lunghezza dell'impulso. In condizioni estreme, si avrà che ad ogni impulso si potrà rilevare l'emissione di 0, 1 o
2 fotoni. I tempi di attesa della rivelazione del primo fotone avranno una distribuzione (temporale) uguale al segnale
di decadimento della fluorescenza.
Si deve lavorare a basso flusso di
fotoni emessi, quindi grande
sensibilità dell’apparecchiatura.
Alta frequenza di ripetizione (kHz
o MHz)
per ridurre il tempo di
acquisizione di un numero
sufficiente di fotoni
Eseguendo l'esperimento un alto numero di volte, si può fare una statistica
dei tempi di attesa dell'arrivo del primo fotone.
Se fra due esperimenti non si nota l'arrivo di alcun fotone, l'esperimento
viene scartato.
Rispetto ad altre tecniche (gating) non c'e' nessuna perdita di segnale.
Detection tramite time-to-amplitude converter (TAC)
Laser,
lampada
The events are collected in memory by adding
a ‘1’ in a memory location with an address
proportional to the detection time. After many
photons the histogram of the detection times,
i.e. the waveform of the optical pulse, builds
up in the memory. Although this principle
looks complicated at the first glimpse, it is
very efficient and accurate for the following
reasons: The accuracy of the time
measurement is not limited by the width of the
detector pulse. Thus, the time resolution is
much better then with the same detector used
in front of an oscilloscope or another linear
signal acquisition device. Furthermore, all
detected photons contribute to the result of the
measurement.
Nel multicananale ad ogni casella corrisponde un
certo delay dallo start.
La risoluzione temporale migliora in quanto la
risposta dello strumento non dipende dalla forma
del segnale del singolo fotone.
Si raggiunge una risoluzione della decina di ps.
A: forma dell’impulso di eccitazione
B: profilo di decadimento sperimentale
C: fitting monoesponenziale
D: residui (B-C)
Acido 2-toluinidil naftalensolfonico
Il fitting è stato eseguito con una funzione
F (t ) = F(t = 0 ) ⋅ e
−t / τ
f
La funzione di autocorrelazione rende conto delle fluttuazioni della fluorescenza nel
tempo rispetto al valore medio.
La Fluorescence Correlation Spectroscopy viene usata soprattutto per misure ‘single
molecule’
Il fitting monoesponenziale
non va bene.
Il fitting richiede una analisi
multiesponenziale
F (t ) = ∑ α i ⋅ e
− t / τ if
i
F (t ) =
(miscela 1:1)
= α ant ⋅ e
f
− t / τ ant
+ α 9 cant ⋅ e
− t / τ 9fcant
α ant = α 9 cant = 0.5
f
τ ant
= 4.2 µs
τ 9fcant = 11.8 µs
Possibili cause del decadimento multiesponenziale:
A) Più specie che emettono
B)
Cinetica di interconversione fra specie nello stato eccitato:
equilibrio acido/base, complessazione, isomerizzazione,…
Detector ultraveloci
Le massime risoluzioni temporali si ottengono con le STREAK CAMERA.
In tali dispositivi i fotoelettroni emessi in tempi leggermente diversi subiscono una diversa
deflessione nel loro viaggio al catodo in quanto passano attraverso un campo elettrico che
viene rapidamente variato.
Gli elettroni vengono rivelati quindi ad
uno screen.
Svantaggi:
Bassa sensibilità
Rumore
e-
fotocatodo
Sweep
voltage
t
Rivelazione con fosfori e CCD
(segnale video)
La quantità k0f = 1/ τ0f non è
facilmente misurabile.
Misura del tempo di vita naturale
S0
S1
IC
ISC
k IC
T1
k0
M* → M +hυ
k ISC
k0
f
f
M*
M*
d[M * ]
= −(k0f + k IC + k ISC )[ M * ]
dt
k IC
→ M’
k ISC
→ M**
K f = k0f + k IC + k ISC
Più in generale
S1
k1
k2
k3
…..
τf=
1
1
=
∑kj K f
j
Tempo di vita
1 einstein=1 mol fotoni
I0
I0 è la densità di fotoni al campione.
Tali fotoni (espressi in mol/l) li indico con [hν].
Nel processo di assorbimento parte di questi fotoni verranno assorbiti.
La velocità di assorbimento è proporzionale alla densità di radiazione
elettromagnetica (fotoni), la esprimo come
d [ hν ]
= − kabs [ M ] ⋅ [hν ] ∝ I abs
dt
hν’ fotoni emessi per fluorescenza
hν” fotoni emessi per fosforescenza
Φf =
If
I abs
d [ hν ' ]
= k0f [ M * ]
dt
d [ hν ' ]
k0f [ M * ]
dt
=
=
d [hν ] kabs [ M ] ⋅ [hν ]
−
dt
Possiamo utilizzare una delle espressioni precedenti per ricavare la conc delle molecole M*
[M * ] =
kabs [ M ] ⋅ [hν ]
k0f + ∑ k0,i
i
k0f [ M * ]
Φf =
=
kabs [ M ] ⋅ [hν ]
poiché
k0f
kabs [ M ] ⋅ [hν ]
kabs [ M ] ⋅ [hν ] k0f + ∑ k0,i
=
f
0
i
k
k0f + ∑ k0,i
i
τf=
1
1
=
∑kj K f
j
1
τ 0f = f
k0
Φf =
τf
τ 0f
Φf ≤1
Il tempo di vita naturale può quindi essere ottenuto da una misura di tempo di vita e una
misura di resa quantica di fluorescenza
Resa quantica
di fosforescenza
k ISC
T1
k
Φ ph
d | hν |
= − kabs | M | ⋅ | hν |
dt
ph
0
d [ hν " ]
=
dt
=
d [ hν ]
− =
dt
d [hν " ]
= k0ph | M ** |
dt
k1....
d [ M ** ]
=
dt
⎞
⎛
− ⎜⎜ k 0ph + ∑ k j ⎟⎟[ M ** ] + k ISC [ M * ]
j
⎠
⎝
= N.o mol.fosfor. p. u. v. t
N.o fot. ass. p. u. v. t.
Stato stazionario
Φ ph
k0ph [ M ** ]
=
kabs [ M ][hν ]
Φ ph
k0ph k ISC
=
K ph K f
ϑ ph ϑISC
Resa di tripletto
k ISC [ M * ]
k ISC [ M * ]
[ M ] = ph
=
k0 + ∑ k j
K ph
**
j
[M * ] =
k | [ M ] ⋅ [hν ]
= abs
Kf
ϑISC
ϑ ph
Probabilità che una molecola fotoeccitata M* una volta formata sia sottoposta ad
ISC al tripletto
Probabilità che una molecola fotoeccitata M** una volta formata emetta
fosforescenza
Resa di tripletto
ϑISC = ΦT =
ΦT = ϑISC
no di molecole di tripletto formato nell' unità di tempo e volume
no di molecole di fotoni assorbiti nell' unità di tempo e volume
k ISC
=
Kf
Misure di τ0ph implicano misure di
τ ph
Φ ph = ΦT ph
τ0
Φ ph ,ΦT ,τ ph
Come si può avere una fluorescenza con vita lunga
v
impulso
S1
Fluorescenza ritardata di tipo E
T
K f , ph = k0f , ph + ∑ k j
ISC’
Kf
ISC
j
Kph
Dopo pochi τf non ci sono più
molecole S1 ottenute per
eccitazione diretta di S0.
Applico lo stato stazionario
all’intermedio S1 in T→S1→ S0
(OK se considero intervalli non troppo lunghi)
j=IC,ISC,0,….
Da che parametri dipende
la fluorescenza ritardata?
ISC’
Kf
ISC
Kph
M*d: molecole S1 eccitate per ISC’ che danno fluor.
ritardata
M**vib: molecole T1 che possono dare ISC’.
M**: molecole T1 rilassate a v=0 che possono dare ph.
Per avere la velocità di fluorescenza
ritardata devo conoscere [M*d]
d [ M d* ]
**
= −(k0f + K f )[ M d* ] − k ISC '[ M vib
]
dt
**
Applico lo stato
k ISC '[ M vib
]
*
[
M
]
=
d
stazionario a M*d:
(k0f + K f )
(vale dopo pochi τf )
da cui
**
]
k0f k ISC '[ M vib
**
k
[
M
]
I d . f . ∝ k [M ] =
=
Φ
'
f
ISC
vib
f
k0 + K f
f
0
*
d
Prevedo di avere un
tempo di decadimento
comparabile con quello
di un tripletto. Devo
trovare [M**vib]
ISC’
S1
T1
∆ES −T =
= ∆Ev = vib − ∆Ev = 0
⎡ ∆E ⎤
I d . f . ∝= Φ f k ISC '[ M ** ] exp ⎢ S −T ⎥
⎣ RT ⎦
Poiché
I ph ∝ k0ph [ M ** ]
Id. f .
I ph
k ISC ' −
= Φ f ph e
k0
∆E S −T
RT
Misure di resa quantica di tripletto vengono
fatte mediante misure di quenching
Supponiamo esista
un eq. termico
**
[ M vib
]
⎡ ∆E S − T ⎤
=
−
exp
**
⎢
[M ]
⎣ RT ⎥⎦
⎡ ∆E S − T ⎤
**
[ M vib
] = [ M ** ] exp ⎢−
⎣ RT ⎥⎦
Fluorescenze in sistemi con equilibrio a-b
b
a
DMABN
kba
b
LE
k0,bf
kab
Kb
a
TICT
Ka
⎧ d [a]
⎪⎪ dt = −( K a + kab )[a ] + kba [b]
⎨
⎪ d [b] = I − ( K + k )[b] + k [a ]
0
b
ba
ab
⎪⎩ dt
f
k0,a
F (t ) = F(t = 0) ⋅ e
−t / τ
f
DMABN/diossano
La soluzione dà funzioni multiesponenziali
kba
kba
⎧ [a]
− λ1t
=
⋅
−
⋅ e − λ1t
e
⎪ b(t = 0) λ − λ
λ2 − λ1
⎪
2
1
⎨
⎪ [b] = ( K a + k ab ) − λ1 ⋅ e − λ1t − ( K a + kab ) − λ2 ⋅ e − λ 2 t
⎪⎩ b(t = 0)
λ2 − λ1
λ2 − λ1
λ1, 2 =
{
1
( K a + k ab + K b + kba ) m ( K a + k ab − K b − kba ) 2 + 4kab kba
2
}
K a = 5 ⋅ 108 s −1
A
K b = 1 ⋅ 109 s −1
1.0
−1
kba = 100 ⋅ 10 s
9
{
0.8
−1
}
1
λ1, 2 ≈ (121.5 ⋅ 109 s −1 ) m (80 ⋅ 109 s −1 ) 2 + 8000 ⋅ 109 s − 2
2
120 ⋅ 109 s −1 => τ 1 = 0.008ns
9 −1
9 −1
= (121.5 ⋅ 10 s m 120.3 ⋅ 10 s ) / 2 =
0.6 ⋅ 109 s −1 => τ 2 = 1.7 ns
Parametri di DMABN/t-butil cloruro
Ka
0.5
Kb
1
kab
20
kba
100
0.6
Int
k ab = 20 ⋅ 10 s
9
Kka
20.5
KKb
101
Kka+KKb
121.5
rad
14480.25
lambda1
0.583044784
b1
b2
0.16551407
a1
a2
1
-1
0.4
lambda2
120.9169552
0.83448593
0.2
0.0
0.0
0.1
0.2
time
0.3