Applicazioni della LC-MS e tecniche correlate
nello sviluppo analitico e di processo
di un farmaco
Antonio Triolo
Menarini Ricerche Spa Firenze
Università di Pisa, Facoltà di Farmacia – 10 dicembre 2015
Sommario
• Ricerca farmaceutica: aspetti generali e impiego della MS
• MS: generalità, principali tecniche di ionizzazione e di
analisi. MS/MS.
• Applicazioni quantitative della LC-MS
– Selected Ion Monitoring
– Selected reaction monitoring
• Applicazioni qualitative della LC-MS
– Caratterizzazione di principi attivi
– Identificazione di impurezze / prodotti di degradazione
– Esempi
La discussione tratterà le applicazioni alle “small molecules” di
origine sintetica
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
2
La Ricerca Farmaceutica
• È una corsa contro il tempo: un brevetto
dura al massimo 25 anni e occorrono
12-15 anni per sviluppare un farmaco
• Una molecola su 100000 arriva alla
sperimentazione clinica. Di queste, una
su 10 diventa farmaco
• 2 farmaci su 3 non recuperano gli
investimenti in R&D
• I costi di R&D crescono del 7.4% ogni
anno
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
3
Quanto ai costi ….
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
4
I 10 farmaci più venduti nel 2014
http://www.pharmastar.it/index.html?cat=1&id=14540
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
5
Nuovi farmaci approvati da FDA
Center for Drug Evaluation and Research
• 41 in totale
• 17 “First-in-class”
• 17 farmaci “orfani”
• 19 biomolecole
(CDER’s 2014 Novel New Drugs, Jan 2015)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
6
Vocabolario della Ricerca
RICERCA E SVILUPPO (R&D)
Dall’idea all’identificazione
di nuove molecole con proprietà
farmacologiche (Lead candidati)
da sperimentare sull’uomo
RICERCA
(Discovery)
SVILUPPO
(Development)
Sviluppo preclinico
Dal Lead candidato al Farmaco,
(sperimentazione clinica,
produzione, registrazione...)
Sviluppo clinico
(fase I, II, III...)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
7
Le fasi della R&D
N. Composti
100000-1000000
Discovery (2-8 anni)
100
Sviluppo preclinico
Laboratory and animal testing
Fase I 20-80 volontari sani.
Determinazione di sicurezza e dosaggi
40
Fase II 100-300 pazienti
volontari. Valutazione di
Efficacia, effetti collaterali
Fase III 1000-3000 pazienti
14
volontari. Monitoraggio efficacia e
reazioni avverse
0
2
4
Revisione FDA
/approvazione
6
8
10
Anni
30
9
12
14
16
Dato l’ingente impiego di risorse, è importante sviluppare precocemente
conoscenze sui potenziali punti critici di un progetto di ricerca (“fail fast,
fail cheap”). Di qui, il crescente uso di tecnologie ad alto contenuto di
informazione, tra cui quelle basate sulla
MS (LC-MS, GC-MS, ICP-MS).
Fonte: Pharmaceutical Researchers & Manufacturers of America
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
8
Some applications of MS during a drug’s lifetime
Substance
characterization
Discovery
PK and
Metabolism
Process
optimization
Preclinical
Clinical
Developm.
Developm.
Stability studies
Registration
Problem solving
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Regulatory
Documentation
Manufacturing
Marketing
Patent protection
Defense against
counterfeit drugs
9
MS: generalità
10
Characteristics of MS
Universality
Application to a wide array of chemicals,
from gases to small organic molecules to
biopolymers
Informativity
High information content
•Molecular mass, formula, structure
•Quantitation
Sensitivity
Very high: up to zeptomole
Low sample consumption
Selectivity
Very high: info of the desired analyte
even in complex mixtures
Interfacement with
LC (GC, CE...)
“Real world” complex samples
Minimum sample preparation
Other on-line info (UV spectra, ...)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
11
MS: tecniche di ionizzazione per “small molecules”
Tecnica
Applicazioni
Modi di
introduzione
EI
Bassi PM,
termostabili
GC
CI
Bassi PM,
termostabili
GC
APCI
PM < 2000,
media-alta
polarità, non
termolabili
LC, …
ESI
Composti
ionici/ionizzabili,
anche
termolabili. e di
alto PM
LC, …
APPI
PM < 2000,
media-bassa
polarità, non
termolabili
LC, …
DESI
v. ESI
ambiente
DART
PM < 1000
ambiente
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Maggiormente
di interesse
farmaceutico
12
Mass analyzers
Quad
Sector
TOF
Ion
Trap
Orbitrap
FTICR
Resolution
103
102–105
103-104
103-104
105
104-106
Mass
Accuracy
(ppm)
Mass range
100
1-5
1-5
50-100
1-2
<1-2
103
104
> 105
<104
< 104
> 104
Efficiency
L (scan)
H (SIM)
1-20
L (scan)
H (SIM)
0.1-20
H
H
H
H
101-104
1-30
1-10
0.001-10
Pulsed and
continuous
M-H
Pulsed and
continuous
L-M
Pulsed and
continuous
M-H
Pulsed and
continuous
H
Speed (Hz)
Ionizer
Continuous
compatibility
Cost
L
Continuous
H
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
13
MS: alcune tecniche di analisi
Tecnica
Informazioni
MS
In EI: PM (da M+.), struttura (da m/z ioni
frammento).
In ESI, APCI, ecc.: PM (da [M+H]+, [M-H]-)
MS/MS
Struttura, da m/z ioni frammento di un precursore
“mass-selected”
MSn
Struttura, da m/z ioni frammento di esperimenti
MS/MS sequenziali
Accurate Mass
(MS - MS/MS)
Formula molecolare di [M+H]+, [M-H]-, ioni
frammento
(Qq)TOF, FTICR,
(QqQ), LTQ-Orbitrap
N. idrogeni scambiabili
On-line e off-line
Scambio H/D
Derivatizzazione
Particolari sostituenti/gruppi funzionali
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Note
QqQ, QqTOF, Ion
Trap, FTICR…
Ion Trap, FTICR, LTQOrbitrap
Principalmente off-line
14
Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)
A COSA SERVE:
• Ulteriori informazioni sulla struttura di uno ione
• Analisi di miscele
COME SI OTTIENE:
• Mettendo in serie due (o più) analizzatori (tandem MS in space)
• Con un analizzatore a intrappolamento di ioni (IT, FTICR),
impostando in sequenza isolamento- eccitazione-analisi dei frammenti
(tandem MS in time)
Pisa, 25/5/05
L’esperimento MS/MS più tipico: Product Ion scan
Sorgente
SPETTRO MS
62
35
115
{
gas di
collisione
150
Analizzatore 1
Cella di collisione
SPETTRO MS/MS
62
{
Pisa, 25/5/05
115
Analizzatore 2
Spettri MS e MS/MS Product Ion del Captopril: [M+H]+ =
m/z 218
172
S#: 115-123 RT: 1.27-1.38 AV: 5 SB: 43 0.55-1.06 NL: 1.23E6
F: + c Full ms [ 100.00 - 1000.00]
10070
218.1
+H
80
O
CH3
C
CH
60
N
40
CH2
SH
20
127.8 131.5
0 COOH
120
130
156.2 163.4
143.3
+ 2H
140
150
160
172.0
194.0 200.0 202.2 217.1
184.3
170
180
190
200
S#: 114-128 RT: 1.25-1.45 AV: 8 NL: 4.32E4
F: + c d Full116
ms2 218.05 [ 50.00 - 230.00]
210
240.1
229.6
220
230
246.8 252.6
240
250
262.1 265.3
260
270
Spettro MS/MS picco m/z=218.1
116
100
200
m/z
219.1
80
60
172
70
40
200
20
115 117
75
0
50
60
Pisa, 25/5/05
70
80
90
100
110
120
171 173
130
140
m/z
150
160
170
198
180
190
200
210
220
230
Studio stabilità di una formulazione orale
RT: 0.00 - 14.49
Relative Abundance
Principio attivo
80
3.33
60
Total Ion Chromatogram
40
1.49
3.15
4.94
6.87
5.25
0.85
20
7.27 7.61
8.51
0
100
Relative Abundance
NL: 8.46E8
TIC F: + c ESI Full ms
[300.00-2000.00] MS
Ora_solution_#NEP110
6031 lces+2
10.92
100
11.88 12.12
NL: 3.99E6
m/z= 950.50-951.50 F:
+ c ESI Full ms
[300.00-2000.00] MS
Ora_solution_#NEP110
6031 lces+2
7.13
5.99
5.87
80
Prod. degradazione
10.92
60
3.15
3.27
40
M/z 951 estratto
11.09
5.19
5.00
1.55
20
10.74
3.39
4.58
8.76 10.39
0.85
12.61
12.96
0
0
2
4
6
8
Time (min)
10
12
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
14
18
Spettri MS del prod. di degradazione,
7.2 min, [M+H]+ m/z 951
Ora_solution_#NEP1106031 lces+2 # 331-335 RT: 7.06-7.13
F: + c ESI Full ms [300.00-2000.00]
951.1
1008.7
Relative Abundance
100
80
MS
60
40
AV: 2 NL: 3.85E6
476.2
20
0
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
m/z
Ora_solution_#NEP1106031 lces+2 # 253-376 RT: 7.09-7.22
F:
+ c d Full ms2 [email protected] [250.00-965.00]
AV: 3 NL: 2.42E6
731.1
Relative Abundance
100
80
60
MS/MS di m/z 951
40
732.1
20
601.2
0
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
m/z
Ora_solution_#NEP1106031 lces+2 # 209-406 RT: 7.11-7.24 AV: 3 NL: 1.65E5
F:
+ c d Full ms3 [email protected] [email protected] [150.00-745.00]
703.2
Relative Abundance
100
MS3 di 951951-731
80
60
40
573.0601.2
685.6
618.0
638.1
713.1
497.1
20
0
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
m/z
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
19
Other MS/MS scanning modes (with a triple quad)
Inlet
Q1
Sorgente
Pr+
MS/MS
experiment
Q1
Q3
Cella
Collis.
(Q2)
P+ + N
Q3
Information
Product ion
Fixed
Scanning
Masses of product ions P+
Precursor ion
Scanning
Fixed
Masses of the precursor Pr+ of a given
product ion
Constant neutral
loss
Scanning
Scanning
Masses of the precursors losing a given
Selected reaction
monitoring (SRM)
Fixed
neutral
Fixed
N
Abundance of a given product ion
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
20
Precursor scan of a 324-component library
FULL SCAN MS
X-AA1-Y-AA2-Z
PRECURSOR MS/MS, m/z 455
455
X-Arg-Y-AA2-Z
Antonio Triolo, Maria Altamura, Franco Cardinali, Alessandro Sisto and Carlo Alberto Maggi J. Mass Spectrom.
2001; 36: 1249–1259
21
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Instruments for MS/MS
Instrument
Precursor
resol.
Product
resol
Scan type
Cost
QIT
Medium
Medium
Product ion
$$
LIT
Medium
Medium
Product ion
$$
FT/ICR
Very high
Very high
Product ion
$$$$
Q-q-Q
Low
Low
All
$$$
Q-q-LIT
Low
Medium
All
$$$
Q-q-TOF
Low
High
Product ion
$$$
LIT-FT/ICR
Medium
Very high
Product ion
$$$$$
TOF-TOF
Low
High
Product ion
$$$$
LIT-Orbitrap
Medium
High
Product ion
$$$
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
22
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
23
MS: applicazioni quantitative
24
Applicazioni quantitative della (LC-)MS nella ricerca farmaceutica
• Discovery
– Quantità (assoluta o relativa) di proteine (o peptidi, metaboliti...) in linee
cellulari
– Stabilità metabolica in vitro di nuove entità chimiche (NCE)
– Farmacocinetica in vivo
• Sviluppo
– supporto alla sintesi su larga scala
• Quantificazione di impurezze potenzialmente genotossiche
– supporto a studi clinici
• Quantificazione di farmaci e metaboliti
• Produzione
– problem solving (controllo presenza microinquinanti , etc )
Differenza fondamentale tra MS quantitativa e qualitativa:
Qualitativa: si acquisisce l’intero spettro in un intervallo m/z per
massimizzare il contenuto di informazione, spesso a spese della sensibilità)
Quantitativa: si rivela uno solo o pochi ioni (o transizioni in MS/MS), a spese
del contenuto di informazione
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
25
Es. : Determinazione di un farmaco nei fluidi biologici
HPLC con rivelazione UV o
fluorimetrica
•
•
•
HPLC-MS (e ancora di più HPLCMS/MS)
Sensibilità non sempre adeguata
•
Interferenze: preparazione del
campione elaborata, tempi di analisi •
lunghi…
Tempo di sviluppo di un metodo: > 2
settimane
•
Sensibilità adeguata anche per
composti senza cromoforo-fluoroforo
Poche o nessuna interferenza:
preparazione del campione semplice e
tempi di analisi brevi (pochi min.).
Tempo di sviluppo di un metodo:
poche ore
Strumentazione per analisi quantitativa:
HPLC-MS: Q (Tof, Orbitrap, IT)
HPLC-MS/MS: QqQ, QqIT (IT, q-Tof, q-Orbitrap, IT-Orbitrap)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
26
Analyte signal
UV
Co-eluting
compound
MS
Co-eluting
compound
Analyte ion
Interference
MS
nm
Analyte ion
Co-eluting
compound
MS/MS
Co-eluting
compound
m/z
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
m/z
Analyte
product ion
m/z
27
Selected Ion Monitoring (SIM)
Trasmette solo lo
Ione dell’analita
Inlet
Q1
Sorgente
È il modo più comune di effettuare analisi quantitative in massa singola.
Il quadrupolo viene impostato per trasmettere solo lo ione che corrisponde
alla sostanza da analizzare. Si perdono le informazioni sullo spettro, ma
aumenta molto (100-1000 volte) l’efficienza di trasmissione, e quindi la
sensibilità. Aumenta anche il numero di punti campionati / picco cromatografico
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
28
Selected Reaction Monitoring (SRM)
Pr+
P+ + N
Trasmette
solo Pr+
Frammenta
Pr+
Trasmette
Solo P+
Inlet
Q1
Sorgente
Alta selettività
Riduzione background
Cella
Collis.
(Q2)
Q3
No interferenze
Aumento sensibilità (S/N)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
29
LC-MS Vs. LC-MS/MS
1 pmol by LC-MS
1 pmol by LC-MS/MS
Atenolol
Atenolol
Phenylalanine
Phenylalanine
Propranolol
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Propranolol
30
Conseguenze dell’aumento di selettività di un metodo
analitico
SULL’ANALISI:
• La separazione cromatografica da altri picchi non è un fattore critico.
Sono possibili analisi di pochi minuti, e tempi di sviluppo del metodo
molto ridotti.
• Sono possibili analisi simultanee (anche decine di analiti con un’unica
corsa). Applicazioni: dosaggi farmaco-metaboliti, esperimenti N-inone…
SULLA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE:
• Viene molto semplificata (SPE, deproteinizzazione, “dilute and
shoot”). Questo la rende veloce e facilmente automatizzabile.
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
31
Alcune limitazioni della LC-MS(-MS) quantitativa
EFFETTO MATRICE:
• Influenza dei costituenti endogeni coeluenti con l’analita sulla sua
efficienza di ionizzazione
• Può essere positivo o negativo
• Rimedi: uso di uno standard interno (meglio se è un isotopomero), uso
di standard di calibrazione in matrice, miglioramento del metodo di
preparazione del campione / separazione cromatografica
INTERFERENZE SUL SEGNALE:
• Da parte di isomeri, metaboliti e prodotti di degradazione (ad es. dello
std interno)
BASSO INTERVALLO DINAMICO LINEARE:
• Max 3-4 ordini di grandezza (con QqQ o QqIT)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
32
Cassette Dosing (N-in-one)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
33
MS: applicazioni qualitative
34
Applicazioni qualitative della (LC-)MS nella ricerca farmaceutica
•
Discovery
–
–
–
studio della espressione di proteine (o peptidi, metaboliti...) in linee cellulari (gli “omics”)
interazioni farmaco-recettore
supporto alla sintesi chimica
•
•
–
•
profilo metabolico
Sviluppo
–
supporto alla sintesi su larga scala
•
•
•
•
–
–
identificazione di impurezze / degradanti nel principio attivo
caratterizzazione degli intermedi di sintesi e identificazione dei sottoprodotti di reazione
supporto all’ottimizzazione di processo / valutazione di vie sintetiche alternative
problem solving
supporto a studi di formulazione
•
•
•
•
monitoraggio reazioni (di solito open access)
caratterizzazione di prodotti
studi di stabilità: identificazione di degradanti
studi di preformulazione: identificazione di prodotti di interazione con eccipienti
identificazione di prodotti rilasciati dai contenitori / sistemi di chiusura (leachables / extractables)
identificazione e caratterizzazione dei metaboliti
Produzione
–
–
–
problem solving
protezione brevettuale di un processo sintetico o di una formulazione
difesa contro la contraffazione
Una parte significativa di queste attività riguarda l’identificazione di
prodotti incogniti, spesso in tracce (impurezze, contaminanti, metaboliti)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
35
Caratterizzazione strutturale di un principio attivo
• Verifica la consistenza della struttura presunta del principio attivo con
le sue caratteristiche spettroscopiche.
• Utilizza più tecniche spettroscopiche (UV, IR, NMR, MS, ...).
• Non è solitamente soggetta a limitazioni dovute alla quantità di
campione.
• È importante per:
– conoscenza del principio attivo
– documentazione regolatoria
– punto di partenza per l’identificazione di incogniti strutturalmente
correlati
• Informazioni fornite dalla MS:
–
–
–
–
massa molecolare
formula molecolare
caratteristiche strutturali (gruppi funzionali, connettività ...)
...
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
36
Sabarubicin
O
OH
COCH2 OH
OH
O
OH
H3 C
H3 C
O
O
O
Aglycone
Fucose
HO
O
OH
Daunosamine
NH2
C32H37NO13
Exact Mass: 643.2
Mol. Wt.: 643.6
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
37
+
H+
260
MS/MS
+
367
+
+
515
130
644
514 ?!
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
38
+
644
In-source CID
514
MS/MS
130
+
367
Inlet
Q1
Sorgente
Cella
Collis.
(Q2)
Q3
+
+
514 =
M/z
Sabarubicin =
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
39
Sabarubicin: D-exchange
O
H3C
O
O
H3 C
H3 C
HO
1- MeOD, 24h t.a.
2- ESI MS/MS
O
OH
O
OD
ND2
C 6H9D 3NO 2+
Exact Mass:
133.1
NH2
O
H3 C
O
O
H3C
O
HO
NH2
H3 C
1- MeOD, 24h t.a.
2- ESI MS/MS
O
OH
OH
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
ND2
C 6H10D 2NO2+
Exact Mass:
132.1
40
133: + 3 D: terminal daunosamine
522 (- 131): loss of
Mono-deuterated internal fucose ?
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
41
Sabarubicin: Peracetylation
O
H3C
O
O
H3C
H3 C
HO
1- Peracetylation
2- ESI MS/MS
O
OH
O
OAc
NHAc
C10H16NO4 +
Exact Mass:
214.11
NH2
O
H3 C
O
O
H3C
O
HO
OH
NH2
H3C
1- Peracetylation
2- ESI MS/MS
O
OH
NHAc
C8H14NO 3+
Exact Mass: 172.10
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
42
766 (- 172): loss of monoacetylated
Internal fucose
214: di-acetylated daunosamine
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
43
H
COCH2OH
OH
H
COCH2OH
OH
O
H 3C
O
O
HO
H 3C
O
H 3C
m/z 514
H2N
OH
O
H2N
OH
O
m/z 644
O
H 3C
O
HO
B. M. Warrack, M. E. Hail, A. Triolo, F. Animati,R. Seraglia,
P. Traldi, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9 (1998), 710
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
44
Multiple stage MS: MSn of Zofenopril; [M+H]+ m/z 430
loss of benzoic acid ?
MS2 430
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
45
Further MS steps: MS3 to MS5
- CO
MS3 430-308
MS4 430-308-280
HS
C
O
MS5 430-308-280-178
- NH3
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
46
Elimination of benzoic acid from protonated zofenopril
Antonella Cartoni, Maria Altamura, Fabio Animati, Giuseppe Balacco, Riccardo Cosi, Alessandro Ettorre,
Andrea Madami and Antonio Triolo J. Mass Spectrom. 2002; 37: 1258–1265
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
47
Identificazione di impurezze / prodotti di degradazione
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
48
Impurezze
Qualità
Sicurezza
•Requisito fondamentale: le impurezze/prodotti di degradazione non
devono contribuire al profilo farmacotossicologico del principio attivo
•Le impurezze presenti in un principio attivo devono essere classificate,
identificate e qualificate (ICH Q3A)
•La natura e quantità delle impurezze nei materiali di partenza e
intermedi di sintesi influenza significativamente il profilo delle impurezze
del farmaco e il costo totale del processo produttivo
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
49
ICH: International Conference on Harmonization
• Riunisce agenzie regolatorie e associazioni farmaceutiche di EU, USA,
Giappone
• Emette linee guida su qualità (Q), sicurezza (S), efficacia (E),
multidisciplinari (M), per la documentazione da presentare nei dossier
registrativi di nuovi farmaci nei Paesi aderenti
• Linee guida su impurezze/prodotti di degradazione:
– Q3A(R2): Impurities in new drug substances
– Q3B(R2): Impurities in new drug products
– Q3C(R3): Guidelines for residual solvents
– Q1A(R2): Stability testing for new drug substances and
products
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
50
From Guideline ICH, Q3B(R2)
• Impurity: Any component of the new drug product that is
not the drug substance or an excipient in the drug product.
• Degradation Product: An impurity resulting from a
chemical change in the drug substance brought about
during manufacture and/or storage of the new drug product
by the effect of, for example, light, temperature, pH, water,
or by reaction with an excipient and/or the immediate
container closure system.
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
51
Identificazione delle impurezze: perchè?
• Documentazione regolatoria
• Ottimizzazione del processo di sintesi
• Risoluzione di problemi nel manufacturing
• Protezione brevettuale
• Difesa dalle contraffazioni
• ...
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
52
Impurezze: classificazione
Principi attivi
• Organiche
– Materiali di partenza
– Sottoprodotti
– Intermedi
– Prodotti di degradazione
– Reagenti, ligandi, catalizzatori
– Contaminanti esterni
• Inorganiche
• Solventi residui
Prodotti finiti
• Tutte quelle del principio attivo. In più:
– Prodotti di degradazione/reazione con gli eccipienti
– Leachables/extractables
– Impurezze degli eccipienti
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
53
Impurezze: le quantità in gioco
• Guidelines ICH: “identification thresholds” secondo la dose totale
giornaliera
Daily dose
Identification threshold
Impurity in New Drug
=2g
0.10% or 1.0 mg per day intake
Substances,
>2g
0.05%
< 1 mg
1.0% or 5 µg TDI, whichever is
ICH Q3A(R)
lower
Degradation products in New
1 mg – 10 mg
0.5% or 20 µg TDI, whichever
is lower
Drug Product,
ICH Q3B(R)
> 10 mg – 2 g
0.2 % or 2 mg TDI, whichever
is lower
>2g
0.10%
Per problemi particolari, questi valori possono anche essere più bassi
(ad es: sospetta tossicità, protezione brevettuale... )
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
54
Impurezze: alcuni aspetti del problema
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Grande diversità strutturale: impurezze drug-related, process-related, organiche,
inorganiche...
Presenti a livelli di tracce (anche < 0.05%)
Compresenza di un grande eccesso di principio attivo/p.a. + eccipienti
Frequentemente, campioni “mass-limited”
Sempre...poco tempo a disposizione!
Il livello di identificazione (formula mol., struttura, stereochimica...) varia con
lo scopo (problem solving < documentazione regolatoria)
Necessità di basarsi quasi sempre su dati parziali (diversamente dal principio
attivo)
Una sola tecnica non dà quasi mai tutte le informazioni: occorre l’uso integrato
e strategico di più tecniche complementari
La LC-MS, spesso con rivelazione parallela UV/diode array, è la tecnica di
prima scelta, almeno nella fase iniziale.
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
55
Una possibile strategia
LC (UV DAD)DAD)-MS
(datadata-dependent
MS/MS, MSn)
Documentazione studi effettuati
No
Identificata ?
Sì
Azioni correttive
Sintesi e caratt.
Standard
Tox
Sì
Identificata ?
No
Sì
Isolamento
(< 1µg)
Nanospray--MS
Nanospray
H/D exch.
Derivatizzazione...
No
Identificata ?
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Isolamento
prep.
NMR (1D, 2D),
Altre tecniche
...
56
MS ed NMR: due tecniche complementari
MS
NMR
++
++
Interfacciabilità
+++
+
Sensibilità
+++
+
Selettività
+++
+
Massa molecolare
+++
-
Formula molecolare
+++
-
Struttura molecolare
++
+++
Regiochimica
+
+++
Stereochimica
-
+++
Universalità rivelaz.
Informatività:
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
57
Es. di massa accurata: impurezza di un intermedio di sintesi
[M+H]+ = 362
R
NH
C20H32N3O3+
Exact Mass: 362.2444
VF 370-125 lces + 3
4.75
1: TOF MS ES+
TIC
1.84e3
Impurezza, [M+H]+ = 390
%
9.13
5.01
2.01
2.11
2.72 2.96 3.16 3.21
3.52 3.89
5.40
4.05 4.354.39 4.59
5.81 6.01 6.28 6.33
6.76
7.09
7.48
7.98 8.12 8.29
8.80 8.95
9.56 9.68
10
Time
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
6.50
7.00
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
7.50
8.00
8.50
9.00
9.50
58
Impurezza [M+H]+ 390: due possibilità
1.
R
N
CHO
2.
C21H32N3O4+
Exact Mass: 390.2393
C22H36N3O3+
R
N
CH3
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
Exact Mass: 390.2757
59
Massa Accurata Intermedio [M+H]+ 362
Elemental Composition Report
Single Mass Analysis
Tolerance = 10.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0
Element prediction: Off
Number of isotope peaks used for i-FIT = 3
n. di insaturazioni
Monoisotopic Mass, Even Electron Ions
451 formula(e) evaluated with 3 results within limits (all results (up to 1000) for each mass)
Elements Used:
C: 0-50 H: 0-50 N: 0-10 O: 0-10
Minimum:
-1.5
Maximum:
5.0
10.0
50.0
Mass
Calc. Mass
mDa
PPM
DBE
i-FIT
362.2445
362.2444
0.1
0.3
6.5
0.8
Formula
C20 H32 N3 O3
Rif. 13648 CE5_CV15
CV15CE5
VF 370-125 lces + 2 653 (4.836) AM (Cen,5, 80.00, Ar,5000.0,490.89,0.40,LS 10); Sm (SG, 2x3.00); Cm (653:656)
362.2445
100
08-Nov-2007 08:50:06
1: TOF MS ES+
7.60e+003
363.2484
%
0
pattern isotopico
306.1842
310.0
317.2083
320.0
362.0090
335.0011
330.0
340.0
350.0
360.0
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
374.2502
370.0
384.2280 392.2533
m/z
380.0
390.0
60
Massa Accurata dell’impurezza [M+H]+ 390
Elemental Composition Report
Single Mass Analysis
Tolerance = 15.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0
Element prediction: Off
Number of isotope peaks used for i-FIT = 3
R
CH3
N
Monoisotopic Mass, Even Electron Ions
482 formula(e) evaluated with 5 results within limits (all results (up to 1000) for each mass)
Elements Used:
C: 0-50 H: 0-50 N: 0-10 O: 0-10
Minimum:
-1.5
Maximum:
5.0
15.0
50.0
Mass
Calc. Mass
mDa
PPM
DBE
i-FIT
390.2755
390.2757
-0.2
-0.5
6.5
0.3
Formula
C22 H36 N3 O3
Rif. 13648 CE5_CV15
CV15CE5
VF 370-125 lces + 2 669 (5.022) AM (Cen,5, 80.00, Ar,5000.0,490.89,0.40,LS 10); Sm (SG, 2x3.00); Cm (668:672)
390.2755
100
%
378.2165
08-Nov-2007 08:50:06
1: TOF MS ES+
2.20e+002
391.2783
412.2142
384.2007
0
380.0
385.0
390.0
395.0
400.0
405.0
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
410.0
415.0
420.1849
m/z
420.0
61
Problem solving: uso combinato di più tecniche (LC-UV, MSn,
massa esatta) - Purificazione di una materia prima
(Sabarubicina)
RT: 0.00 - 55.98
100000
90000
80000
UV 254 nm
70000
uAU
60000
?
50000
40000
RT: 44.17
30000
49.45
2.25
20000
10000
15.85
3.15
27.87
11.18
30.57
39.42
0
100
Relative Abundance
90
80
44.09
MS, m/z 792
70
60
50
40
43.78
30
20
10
4.35
15.95
19.19
9.70 13.01
26.44
32.83
52.08
51.70
43.32
0
0
5
10
15
20
25
30
Time (min)
35
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
40
45
50
55
62
Spettri UV
100
NL: 2.21E4
MEN_10755_200801_fr3_lces+
2#6567-6651 RT:
43.78-44.34 AV: 85
SB: 78 40.90-41.42
254.0
90
Relative Absorbance
80
Impurity
70
60
50
40
30
286.0
482.0
20
10
0
100
334.0
NL: 1.69E6
MEN_10755_200801_fr3_lces+
2#2626-2788 RT:
17.50-18.58 AV: 163
254.0
90
80
70
Sabarubicin
60
50
40
482.0
290.0
30
20
10
0
250
300
350
400
450
wavelength (nm)
500
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
550
600
63
Sabarubicina: MS/MS
Sabarubicina in TFA/H2O/MeCN 0.1:50:50
CV32CE15
19-Jul-2007 17:45:55
SABA_TUNEMSMS_1 76 (1.408) Cm (70:83)
1: TOF MSMS 644.20ES+
3.03e3
130.1
100
130
367
367.1
%
260
260.1
644
514
644.2
368.1
645.2
349.1
131.1
261.2
148.1
224.1
113.1
0
50
75
100
125
150
175
200
225
514.2
385.1
242.1
250
275
300
325
350
375
400
515.2
425
450
475
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
500
525
550
575
600
625
650
675
m/z
700
64
Impurezza, spettri MS e MSn
MEN_10755_2008-01_fr3_lces+2
c.s. th 3e5, q 0.25 IW 6 dd 792
04/02/2008 15.51.26
Ref. 13842
circa 0.6 mg/mL
LCQ
MEN_10755_2008-01_fr3_lces+2 #2005-2038 RT: 43.74-44.50 AV: 20 SB: 48 42.13-43.19 NL: 3.82E5
F: + c ESI Full ms [300.00-1400.00]
792
100
Relative Abundance
[M+H]+
80
MS
60
793
40
20
814
791
0
600
650
700
750
800
m/z
Relative Abundance
MEN_10755_2008-01_fr3_lces+3 #1871-1911 RT: 43.49-44.42 AV: 21 NL: 5.88E4
F: + c ESI Full ms2 [email protected] [215.00-800.00]
278
100
900
950
1000
1050
MS2, m/z 792
[M+H]+ - 148
80
60
130+148
40
20
242 260
0
279
250
296
327 337
300
260+148
408
426
427 445
381 390
350
400
774
644
471
450
494 511 529 546
500
m/z
MEN_10755_2008-01_fr3_lces+3 #1878-1909 RT: 43.65-44.35 AV: 16 NL: 1.61E4
F: + c ESI Full ms3 [email protected] [email protected] [75.00-350.00]
166
100
Relative Abundance
850
598
550
630
600
662
650
775
688 706 719
700
747 773
750
790
800
MS3, m/z 792-278
80
60
260
40
149
20
113
95
130
148 152
165
190
167
80
100
120
140
160
242
207
0
180
m/z
200
220
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
240
261
260
280
65
Massa accurata, [M+H]+
Elemental Composition Report
Single Mass Analysis
Tolerance = 10.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0
Element prediction: Off
Number of isotope peaks used for i-FIT = 3
Monoisotopic Mass, Even Electron Ions
105 formula(e) evaluated with 1 results within limits (all results (up to 1000) for each mass)
Elements Used:
C: 0-50 H: 0-50 N: 0-1 O: 0-20
Minimum:
-1.5
Maximum:
5.0
10.0
50.0
Mass
Calc. Mass
mDa
PPM
DBE
i-FIT
792.2533
792.2504
2.9
3.7
20.5
1.5
Formula
C40 H42 N O16
Rif. 13842 MS/MS 792 CE 27
06-Feb-2008 12:03:02
CV25CE5
4.28e+003
Sabarubicin_#2008-01fr3_lces+3 1147 (38.556) AM (Cen,5, 80.00, Ar,5000.0,490.89,0.40,LS 10); Sm (SG, 2x3.00); Cm (1144:1154)
792.2533
100
%
0
785.8556
786.0
789.0439
788.0
790.2209
790.0
791.8051
792.0
793.2587
794.2592
794.0
795.2601
796.0
798.8146
798.0
799.7689
800.0
C40H42NO16 – C32H38NO13 = C8H4O3 ; DBE = 7
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
66
m/z
Impurezza: struttura proposta
O
OH
COCH2OH
OH
+ 2H
O
OH
O
426
H3C
113 (9.7 ppm)
- NH3
O
H3C
408
HO
NH
O
278 (-0.7 ppm)
NH2
O
149
O
HO
260
HO
O
H3C
- H2O
O
130
644
+ 2H
HO
166 (- 1.8 ppm)
O
m/z 278
HO
+
O H42NO16
C40
Exact Mass:
792.2504
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
67
Uso combinato di più tecniche: un esempio
Nicardipina
Impurezza
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
68
Nicardipina: spettri MS e MS/MS
315
std inap+ #10-37 RT: 0.12-0.46 AV: 28 NL: 3.16E7
T: + p Full ms [ 150.00-650.00]
480.1
Relative Abundance
100
80
60
H
N
H3C
CH3
O
MS (APCI +)
359
O
H3C
N
O
O
40
+2H
20
NO2
148
H
CH3
166
0
350
400
450
500
m/z
550
600
650
std inap+ #161-176 RT: 2.46-2.71 AV: 16 NL: 9.39E6
T: + p Full ms2 [email protected] [ 105.00-650.00]
315
Relative Abundance
100
80
166
60
MS/MS
359
40
20
148
0
150
200
250
300
m/z
350
400
450
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
500
69
Impurezza a 6.7 min
Metodo HPLC Nicard_grad0-3
13648
Nicardipina_#1507 lcap+1 #280-290 RT: 5.79-5.95 AV: 5 SB: 41 5.29-5.70, 6.01-7.23 NL: 1.32E5
F: + c APCI Full ms [ 100.00-1000.00]
390.0
H 3C
100
Relative Abundance
[MH]+
80
60
315
H
N
O
MS (APCI +)
H
CH3
O
H 3C
NH
- MeOH
O
O
CH 3
40
359
391.7
20
- NH2CH3
358
NO2
0
360
370
380
390
m/z
400
410
420
Nicardipina_#1507 lcap+2 #289-306 RT: 5.94-6.29 AV: 18 NL: 2.79E5
T: + c APCI Full ms2 [email protected] [ 105.00-400.00]
x30
315.1
Relative Abundance
100
80
60
MS/MS
40
20
131.0
149.4
0
150
177.9
158.9
201.4 206.4
200
257.2
250
m/z
277.6
314.4 332.9 345.6 359.1
300
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
350
391.0
400
70
Spettri UV di Nicardipina e impurezza
Impurezza
Nicardipina
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
71
Riassumendo...
•
•
Lo spettro UV del picco a 6.7 min non è compatibile con
quello atteso per l’impurezza (che ha lo stesso cromoforo
della nicardipina)
Ipotesi: presenza di un’altra impurezza preponderante,
rivelabile all’UV ma non all’ APCI +
Campione
GC--MS (EI)
GC
Library Search
Raccolta frazione
(~1 µg)
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
72
GC-MS del campione
Acetone (solv. di
cristallizzazione)
Impurezza
Acetonitrile
Aria
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
73
Spettro EIEI-MS dell’impurezza
O
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
74
Ricerca dell’ossido di mesitile nell’acetone (usato per la
cristallizzazione)
?
Ossido di mesitile
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
75
Picco a 18.9 min: spettro EI MS
OH
O
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
76
Formazione dell’ossido di mesitile
O
O
H3C
CH3
H3C
OH
O
- H2O
O
CH3
4-idrossi-4-metil-2-pentanone
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
ossido di mesitile
77
Protezione brevettuale
78
Profilo impurezze di un principio attivo
in due processi di sintesi
Brivudin_pos_ms4
1: TOF MS ES+
TIC
2.98e4
10.81
100
%
Processo “old”
Marker 1 (0.02%)
18.07
2.29
6.02
15.14
14.41
9.24
1.62
21.66
26.35
0
2.00
Brivudin_pos_ms3
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
10.88
100
28.00
30.00
1: TOF MS ES+
TIC
3.05e4
%
Processo “new” (brevettato)
18.01
2.34
6.00
12.25
14.55
1.65
26.47
0
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
79
16.00
18.00
20.00
22.00
24.00
26.00
28.00
Time
30.00
Principal Component Analysis: Scores plot
80
PCA: Loadings plot
Dimer minus VDU
deoxyribose
Br,Cl analog
Dipyrimidine
dimer 1
Dipyrimidine
dimer 3
α-E-isomer
*
BVU
Plus 98
Dibromo 1
Cyclobutane
dimer 2
Acetyl
Plus 30-1
Dibromo 2
Ethinyl
Plus 30-2
Dimers minus Br
Cyclobutane
dimer 1
81
β-Z-isomer
Markers “Process-indicating”
82
Per saperne di più …
American Society for Mass Spectrometry :
www.asms.org
Divisione Spettrometria di Massa della Soc. Chimica Italiana :
www.soc.chim.it/it/divisioni/sdmassa/home
IMaSS, Italian Mass Spectrometry Society :
www.imass.it
Portale Spectroscopynow :
www.spectroscopynow.com/ms
A. Triolo, Univ. di Pisa 10 dic 2015
83