REPORT
Interazione sinergica tra TS-polisaccaride
e acido ialuronico (Xiloial).
Uno studio di risonanza magnetica nucleare
Synergistic interactions between TS-polysaccharide
and hyaluronic acid (Xyloial):
an investigation by nuclear magnetic resonance spectroscopy*
U. Benelli1, G. Uccello-Barretta2, F. Balzano2, S. Nazzi2, M. Sansò3
Obiettivo dello studio
Obiettivo dello studio, condotto presso il Dipartimento di Chimica dell’Università di Pisa, è stata la valutazione di nuovi sostituti lacrimali basati su materiali polisaccaridici compositi stabili, dotati di elevata capacità di assorbire acqua e utilizzabili in campo oftalmico nella sindrome
dell’occhio secco.
1
Dipartimento di Neuroscienze,
Università di Pisa
2
Dipartimento di Chimica e Chimica
Industriale, Università di Pisa
3
Farmigea SpA, Pisa
Materiali e metodi
Sono stati utilizzati TS-polisaccaride (TSP, 700 kDa), xiloglucano estratto dai semi di tamarindo (Farmigea SpA, Pisa), e acido ialuronico (HA,
950 kDa).
Per le misure di risonanza magnetica nucleare (NMR) è stato utilizzato
uno spettrometro Varian Inova 600 MHz ad alta risoluzione.
La spettroscopia NMR costituisce una tecnica non invasiva di indagine a livello molecolare che, misurando l’assorbimento di radiazione
elettromagnetica in molecole immerse in un forte campo magnetico,
permette di studiare la disposizione nello spazio delle molecole (conformazione), nonché il modo in cui le molecole stesse si muovono in
soluzione (rotazione, traslazione, ecc.) e in cui interagiscono tra loro.
Lo spettro NMR che si ottiene con questa tecnica è l’“impronta” della
molecola e molecole diverse hanno spettri NMR diversi. Oltre allo spettro, un altro parametro che viene considerato è il rilascio di energia o
“rilassamento”, caratterizzato da velocità misurabili tramite NMR che
dipendono dalle caratteristiche di moto delle molecole.
Nello studio sono stati registrati gli spettri NMR ed effettuate misure
dei parametri di rilassamento longitudinale e trasversale (T1 e T2) sui
polisaccaridi puri (TS e HA) e su miscele TSP/HA a rapporto di concentrazione variabile (4:1, 3:2, 2:3 e 1:4), disciolte in acqua deuterata,
mantenendo costante la concentrazione totale (0,5% in D2O).
*
On Medicine anno IV (2010), n. 1.
3
U. Benelli, et al.
Risultati
L’analisi dei segnali NMR del polisaccaride puro TSP,
a confronto con quelli delle miscele, rivela come lo
spettro del TSP cambi significativamente in conseguenza della presenza di HA (Fig. 1).
Una tale osservazione indica che TSP e HA non si
comportano come entità indipendenti, bensì interagiscono tra di loro, formando aggregati supramolecolari.
L’analisi delle velocità di rilassamento (VdR) di selezionati protoni anomerici del polisaccaride TSP
puro non evidenzia alcuna variazione importante a
Xyl
Xylt
Gal Glc
TSP 0,5%
TSP 0,4%/HA 0,1%
TSP 0,3%/HA 0,2%
concentrazioni tra lo 0,1 e lo 0,5%, a indicare che
TSP assume una conformazione stabile all’interno di
questo range di concentrazioni.
Nelle miscele TSP/HA, invece, le VdR nelle unità di
galattosio e glucosio del TSP variano significativamente al variare del rapporto TSP/HA fino al valore
3:2; a questo rapporto tra i due polisaccaridi si forma un aggregato stabile, che non cambia più le sue
caratteristiche di moto.
Analogo comportamento è stato osservato per le
VdR dei protoni anomerici delle unità di altri nuclei
(xilosio terminali e di catena), che sono presenti sia
nel TSP che nell’HA: esse variano fino a un ben definito rapporto TSP/HA oltre il quale non si hanno più
variazioni significative per il definitivo assestamento
degli aggregati formati da TSP e HA.
Nello studio è stata inoltre valutata la capacità dei
polisaccaridi di legare acqua, una proprietà strettamente collegata alla biocompatibilità.
L’acqua non legata mostra una VdR bassa; se invece
è racchiusa tra i polisaccaridi, si muove più lentamente e quindi la VdR deve essere alta.
I dati ottenuti nello studio confermano una tale previsione (Tab. I).
TSP 0,2%/HA 0,3%
Tabella I. Velocità di rilassamento dell’acqua – Water
relaxation rates (s-1).
TSP 0,1%/HA 0,4%
5,2
5,0
4,8
4,6
4,4 ppm
Xyl: xilosio; Glc: glucosio; Gal: galattosio
Figura 1. Spettri 1H NMR di TSP puro e miscele TSP/HA
– 1H NMR spectra of pure TSP and TSP/HA mixtures.
Velocità di rilassamento (s-1)
180
,4%
%/HA 0
TSP 0,1
160
Miscele TSP/HA
TPS
140
120
A 0,3%
,2%/H
TSP 0
100
80
0,1%
,2%
,1%
%/HA 0
%/HA 0
TSP 0,3
TSP 0,4
0,2%
0,3%
0,4%
60
0
1
2
3
4
5
6
Composizione (%)
Figura 2. Velocità di rilassamento nelle unità di
galattosio e glucosio del TSP al variare del rapporto TSP/HA
– Dependence of relaxation rates (s-1) of anomeric protons
of glucose and galactose units of TSP in pure TSP and in
TSP/HA mixtures.
4
H2O pura in assenza di polisaccaride
< 0,3 s-1
H2O in presenza di HA 0,1%
0,40 s-1
H2O in presenza di HA 0,5%
0,66 s-1
H2O in presenza di TSP 0,4%
1,66 s-1
H2O in presenza di TSP 0,5%
1,99 s-1
H2O in presenza di TSP 0,4%/HA 0,1%
2,64 s-1
Il fatto più interessante è che nelle miscele TSP/HA
sono state misurate VdR assai più elevate: ciò dimostra la maggiore capacità dell’aggregato di legare
H2O rispetto ai polisaccaridi puri e quindi le sue migliori caratteristiche di biocompatibilità.
Conclusioni
I polisaccaridi TSP e HA in miscela non mantengono
le stesse proprietà dei polisaccaridi puri, ma generano aggregati supramolecolari stabili, di notevoli
potenzialità in applicazioni di tipo farmaceutico per
uso oftalmico.
L’aggregato TSP/HA (Xiloial, brevetto di Farmigea
SpA, Pisa) è caratterizzato da una maggiore capacità di legare l’acqua rispetto ai singoli polisaccaridi.
REPORT
Aims
This study examined the characteristics of new artificial
tears based on a stable mixture of polysaccharides which
has an enhanced ability to bind water and, hence, is useful for therapy of dry eye syndrome.
Materials and methods
Tamarind seed polysaccharide, MW 700 kDa (TSP, Farmigea S.p.A. Pisa, Italy) and hyaluronic acid, MW 950
kDa were employed. Nuclear magnetic resonance (NMR)
measurements were carried out on a high resolution Varian Inova 600 MHz spectrometer for solution studies.
NMR spectroscopy is a non-invasive tool based on the
interaction between molecules and electromagnetic radiation in the presence of a strong magnetic field. This
interaction causes molecules to absorb energy, which is
subsequently released during relaxation processes. The
technique allows the definition of 3-dimensional arrangements (conformation) of molecules, their motional
features (dynamics) and their supramolecular assembling
caused by reciprocal interactions occurring in solution.
The NMR spectrum constitutes a molecular fingerprint
and, thus, different molecules have different NMR spectra. Relaxation processes occur at measurable rates (relaxation rates – R, s-1) and contain information regarding
the motional features of molecules.
In this study, we compared the NMR spectra and longitudinal (R1) and transverse (R2) relaxation rates of pure
polysaccharides (TSP and HA) and their mixtures TSP/HA
at variable concentration ratios (4/1, 3/2, 2/3 and 1/4),
dissolved in deuterated water, at constant total concentration (0.5%).
Results
Analysis of NMR signals of pure TSP in comparison with
TSP/HA mixtures revealed that the NMR spectrum of TSP
is perturbed by the presence of HA (Fig. 1).
This indicates that TSP and HA do not behave as independent entities, but rather give rise to reciprocal interactions in solution, by formation of supramolecular aggregates.
Relaxation rates of selected anomeric protons of pure
TSP are not sensitive to concentration gradients between
0.1% to 0.5%, and indicate that the conformational arrangement of TSP is stable within the studied concentration range. In contrast, in TSP/HA mixtures the relaxation
rates of anomeric protons of galactose and glucose units
of TSP are strongly affected by the presence of HA and
depend on the TSP/HA ratio.
An analogous behaviour was found for the relaxation
rates of other anomeric protons, which underwent significant variations up to to a well defined TSP/HA ratio, beyond which any further variation was not observed as the
consequence of the formation of stable supramolecolar
TSP/HA aggregates.
Finally, the ability of polysaccharides to bind water was
probed, which strongly contributes to the biocompatibility of these new polysaccharide-based formulations.
Free water shows a very low relaxation rate, and increases
substantially when bound to polysaccharides. In our case,
water relaxation rates sharply increased in the presence
of TSP/HA mixtures, which showed an enhanced ability
of their aggregates to bind water with improved biocompatibility.
Conclusions
In solution, TSP and HA polysaccharides do not behave
as independent entities, but rather give rise to stable supramolecular aggregates, which have the potential for
pharmaceutical applications in the ophthalmic field.
In particular, the TSP/HA aggregate (Xiloial, Farmigea
SpA, Pisa, Italy) has an enhanced ability to bind water
with respect to either polysaccharide alone.
5
REPORT
Interazione sinergica tra TS-polisaccaride
e acido ialuronico (Xiloial). Implicazioni
nella formulazione di sostituti lacrimali
Synergistic interaction between TS-polysaccharide
and hyaluronic acid (Xiloial). Implications
for the formulation of tear substitutes*
U. Benelli1, Y. Zambito2, G. Di Colo2, S. Ottino2, M. Sansò3
Premessa e obiettivi dello studio
In un precedente lavoro il nostro gruppo ha dimostrato che polisaccaridi
di origine naturale, quali TS-polisaccaride (TSP) e acido ialuronico (HA),
mostrano proprietà mucoadesive sulla superficie oculare.
Nel presente studio si è invece voluto verificare se un’eventuale interazione interpolimerica tra TSP e HA possa dar luogo a una formulazione
di sostituti lacrimali con migliori proprietà mucoadesive rispetto ai singoli polimeri.
Materiali e metodi
A questo scopo sono state preparate gocce oftalmiche:
1. non medicate: miscele TSP/HA a rapporto variabile (4:1, 3:2, 2:3
e 1:4), marcate con fluoresceina isotiocianato, in tampone fosfato
pH 7,4 (0,0375 M) reso isotonico con NaCl alla concentrazione di
0,5% p/v;
2. medicate con ketotifene fumarato 0,7 mg/ml + miscele TSP/HA;
3. medicate con diclofenac sodico 1 mg/ml + miscele TSP/HA.
Lo studio prevedeva due test, uno in vivo e uno in vitro. Le soluzioni
TSP-HA sono state innanzitutto confrontate riguardo al tempo di residenza medio (MRT) nel fluido lacrimale dei conigli.
Dopo instillazione di una goccia di soluzione (50 μl) nel sacco congiuntivale inferiore dell’occhio del coniglio, venivano effettuati prelievi
con pipetta capillare di campioni di 1 μl di fluido lacrimale a intervalli
di tempo prestabiliti. La concentrazione dei polimeri nel fluido lacrimale veniva determinata mediante analisi fluorimetrica. Si costruivano quindi curve di eliminazione dei polimeri dal fluido lacrimale (CFL
vs. t: concentrazione dei polimeri nel fluido lacrimale vs. tempo).
Per ciascuna di queste curve si calcolava l’MRT, tempo di residenza precorneale medio. L’ordine dei valori di MRT è stato quindi confrontato
con quello dell’interattività mucina-polimeri (MPI), ottenuta in vitro
*
On Medicine anno IV (2010), n. 1.
6
1
Dipartimento di Neuroscienze,
Università di Pisa
2
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche,
Università di Pisa
3
Farmigea SpA, Pisa
REPORT
misurando l’effetto dei polimeri sulla viscosità di
dispersioni di mucina gastrica di maiale contenenti
ciascuna delle miscele polimeriche in studio.
Risultati
1. Confronto dei risultati in vitro e in vivo
Il confronto tra l’andamento del tempo di residenza medio (MRT) dei polisaccaridi nel fluido lacrimale
del coniglio e dell’interattività mucina-polimeri (MPI)
evidenzia chiaramente come i valori di entrambi i
parametri siano molto più alti per le miscele rispetto
ai polimeri da soli (Fig. 1).
Questo risultato non può essere attribuito alla viscosità del sistema; come si può osservare sempre nella
Figura 1, infatti, la viscosità della soluzione di HA da
solo è la più alta di tutte, mentre i rispettivi parametri MPI e MRT sono nettamente inferiori rispetto a
quelli delle miscele.
Sulla base di queste evidenze è possibile affermare
che i parametri in vivo (MRT) e in vitro (MPI) sono
coerenti tra loro nell’indicare una mucoadesività
delle miscele superiore a quella dei polimeri da soli.
Un’interazione sinergica tra TSP e HA appare dunque responsabile dell’aumento della mucoadesività
ed è in particolare la miscela TSP/HA 3:2 ad avere i
valori massimi di MRT e MPI.
2. Determinazione della cinetica
di eliminazione dei farmaci in vivo
Figura 1. Confronto dei risultati ottenuti in vitro e in vivo
– Comparison between in vitro and in vivo results.
È stato inoltre valutato l’effetto dei polisaccaridi sull’MRT e sul tempo di residenza massimo (RTmax) di
due farmaci nel fluido lacrimale del coniglio, diclofenac sodico (DS) e ketotifene fumarato (KF). Come
si vede nella Figura 2, la miscela TSP/HA forniva in
entrambi i casi i valori massimi sia di MRT sia di RTmax. Occorre sottolineare che i due farmaci sono
molto diversi tra loro (ketotifene è una base, mentre diclofenac è un acido), eppure i rispettivi valori
di MRT e RTmax hanno andamenti simili: ciò indica
che un veicolo mucoadesivo è in grado di aumentare il tempo di residenza dei farmaci nell’area precorneale a prescindere dalla natura chimica dei farmaci
stessi, grazie alla sua capacità di stabilizzare il film
lacrimale e non attraverso interazioni chimiche.
Ketotifene fumarato
MRT, min
Diclofenac sodico
RTmax, min
MRT, min
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
RTmax, min
0
Co
ntr
oll
o
TS
P/
HA
4:1
(4,
6)
TS
P/
HA
TS
P/
HA
3:2
(6,
4)
TS
P/
HA
1:4
(8,
5)
2:3
(9,
6)
Co
ntr
oll
o
TS
P/
HA
4:1
(4,
6)
TS
P/
HA
TS
P/
HA
3:2
(6,
4)
TS
P/
HA
1:4
(8,
5)
2:3
(9,
6)
Le miscele polimeriche sono ordinate in base alla viscosità (mPas); * p < 0,05.
Figura 2. Determinazione della cinetica di eliminazione dei farmaci in vivo – Determination of drug elimination kinetics in vivo.
7
U. Benelli, et al.
Conclusioni
In virtù della loro mucoadesività, le miscele di TSP e HA
(Xiloial) mostrano una maggiore resistenza all’eliminazione dal fluido lacrimale rispetto ai singoli polimeri,
indipendentemente dalla viscosità della soluzione.
Le miscele TSP/HA hanno mostrato la capacità di
stabilizzare il film lacrimale, massimamente nel rapporto 3:2.
In prospettiva, gocce oftalmiche a base di TSP/HA, medicate con farmaci, hanno la potenzialità di consentire
la diminuzione della frequenza delle instillazioni.
Aims
Results
In a previous study, we demonstrated that polysaccharides of natural origin, such as TS-polysaccharide (TSP)
and hyaluronic acid (HA), are mucoadhesive at the ocular
surface.
Herein, we investigated the possibility that there is an interpolymer interaction between TSP and HA that would
render a tear substitute formulation more mucoadhesive
than either individual polymer alone.
1. Comparison of in vitro and in vivo results
Materials and methods
Three types of ophthalmic drops were prepared:
1. non-medicated, containing 0.5% w/v of a TSP/HA
mixture in a 4:1, 3:2, 2:3 or 1:4 wt ratio, dissolved
in isotonic phosphate buffered saline pH 7.4 (0.0375
M), labelled with fluorescein isothiocyanate;
2. medicated, containing the above TSP/HA mixtures,
not fluorescein-labelled, with 0.7 mg/ml ketotifen fumarate;
3. medicated, containing the above TSP/HA mixtures,
not fluorescein-labelled, and 1 mg/ml sodium diclofenac .
The study involved both in vivo and in vitro tests. Firstly,
the TSP/HA mixtures were compared for their mean residence time (MRT) in the tear fluid of rabbits. Following
instillation of one drop (50 μl) into the lower conjunctival
sac of the eye, 1 μl tear fluid samples were collected at
pre-established time intervals using disposable glass capillaries. The polymer concentration in tear fluid was determined by fluorimetric analysis. Next, curves of polymer
elimination from tear fluid (CTF vs. time, polymer concentration in tear fluid vs. time) were obtained. From each
curve, the MRT (mean precorneal residence time) was calculated. Subsequently, the rank order of MRT values was
compared with that of the mucin-polymers interactivity
(MPI) values, which were obtained in vitro by measuring
the polymer effects on the viscosity of porcine gastric mucin dispersions containing each of the polymer mixtures
under study.
8
Figure 1 clearly shows that the values of MRT of polysaccharides in rabbit tear fluid and the values of mucin-polymers interactivity (MPI) for the mixtures are much higher
than those of the polymers alone.
These results cannot be ascribed to differences in viscosity. As can be seen in Figure 1, HA alone has the highest
viscosity, whereas the relevant parameters MPI and MRT
are clearly lower than those for the mixtures. Based on
this, it can be surmised that the in vivo (MRT) and in vitro
(MPI) parameters indicate the mixtures are more mucoadhesive than the polymers alone.
Additionally, a synergistic interaction between TSP and HA
appears to be responsible for the increased mucoadhesivity, and the TSP/HA mixture 3:2, in particular, showed the
greatest MRT and MPI values.
2. Determination of drug elimination kinetics
in vivo
The polysaccharide effects on the MRT and the maximum
residence time (Rtmax) in the rabbit tear fluid of two drugs,
i.e., diclofenac sodium (DS) and ketotifen fumarate (KF)
were also determined. As shown in Figure 2, the TSP/HA
mixture 3:2 produced the largest values of either MRT or
RTmax. It should be stressed that the two drugs are chemically quite different, as ketotifen is a base and diclofenac
an acid, yet the respective MRT and RTmax values show
similar trends. This indicates that a mucoadhesive vehicle is
able to increase the drug residence time in the precorneal
area irrespective of the chemical nature of the drug, in virtue of the vehicle’s ability to stabilize the tear film, which
does not take place through chemical interactions.
Conclusions
As a consequence of their mucoadhesivity, mixtures of
TSP and HA (Xiloial) have a stronger resistance to elimination from tear fluid compared to either individual polymer
alone, independently of the viscosity of the solution.
TSP/HA mixtures, especially in a 3:2 ratio, have the ability
to stabilize tear film. Medicated ophthalmic drops based
on TSP/HA have the potential to decrease the frequency
of instillations.