ACC Programma 3
.
Trasferimento delle conoscenze allo sviluppo di
interventi volti a prevenire, diagnosticare e
trattare il cancro.
Progetto Terapie Biologiche
combinate e personalizzate nei
tumori solidi
Coordinatore: Giorgio Parmiani,
Istituto Scientifico San Raffaele, Milano
Partecipanti
• Gruppi di Ricerca Afferenti (HSR):
• Unità di Immuno-Bioterapia del Melanoma
e dei Tumori Solidi (G. Parmiani);
• Unità di Medicina Nucleare (F. Fazio);
• Unità di Biologia dei Tumori e Targeting
Vascolare (A. Corti);
• Unità di Immunologia Sperimentale (P.
Dellabona).
Gruppi di Ricerca afferenti ad
altre Istituzioni di Ricerca
• Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani,
Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori
Milano (RS. Licia Rivoltini):
• UOC Immunoterapia Oncologica, Azienda
Ospedaliera Universitaria, Siena (R.S. Michele
Maio);
• Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale,
ISS, Roma (R.S. Maria Ferrantini);
• Laboratorio di Ricerche in Immunologia e
Infiammazione, Istituto Clinico Humanitas,
Milano (R.S. Cecilia Garlanda).
Destinatari Istituzionali
Partecipanti
• Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro
(Genova) IRCCS (R.S. Paola Queirolo);
• Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova (RS.
Paola Zanovello)
Obiettivi e Razionale
• Il progetto è basato sull’attivazione di studi
clinici di combinazione tra farmaci biologici
e vaccinazione con peptidi antigenici, oltre
a studi associati o paralleli di laboratorio
destinati: 1) a migliorare le conoscenze sui
meccanismi alla base della combinazione
proposta; 2) al monitoraggio
immuno/biologico dei pazienti; c) a
valutare polimorfismi di geni che possono
influire sulla risposta al trattamento.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Unità di Immunologia Sperimentale HSR
(P. Dellabona).
• Obbiettivi: a) identificazione di epitopi
della proteina survivina (SVV) riconosciuti
da linfociti T; b) l’utilizzo di questi peptidi
per lo studio della risposta in pazienti con
tumori esprimenti SVV; c) utilizzo di epitopi
SVV in protocolli di vaccinazione
antitumorale.
Risultati e conclusione del primo
anno di attività.Studi pre-clinici
• Sono state identificate 9 sequenze di SVV e
sintetizzati i peptidi sintetici corrispondenti.
• I peptidi sono stati utilizzati in vitro per stimolare,
in colture a breve termine, linfociti T CD4+ isolati
dal sangue di 7 soggetti normali e 7 pazienti
con melanoma metastatico.
• Linfociti CD4 di 2/7 pazienti e 4/7 donatori hanno
risposto. Nel caso dei pazienti con melanoma la
reattività anti-SVV dei linfociti T CD4+ appare
quindi ridotta rispetto a quella dei soggetti sani.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Unità di Biologia dei Tumori e Targeting
Vascolare HSR (A. Corti);
• Obbiettivo: Verificare se la combinazione
di NGR-TNF con vaccinazione può
indurre, in modelli animali, una più forte e
duratura risposta immune e una migliore
risposta clinica in confronto alla sola
vaccinazione .
Targeted delivery of TNF to tumor vasculature
by coupling with the NGR-peptide
(a ligand of CD13 expressed by angiogenic vessel)
NGR-TNF
TNF
CNGRCG peptide
The antitumor activity of NGR-TNF is >10 times greater than that of TNF
in several mouse models
Curnis et al., Nat. Biotechnol., 2000
Sacchi et al., Clin. Cancer Res. 2006
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• I risultati del primo anno indicano che
basse dosi di NGR-TNF possono indurre,
in maniera più efficiente e persistente del
solo TNF, il rilascio di varie citochine e
chemochine (IL-2, IL-6, IP-10,
lymphotactin, MCP-1, MIP-1beta,
oncostatin M, TIMP-1).
• Esperimenti sono in corso in modelli
animali per testare in contesto terapeutico
la risposta alla combinazione tra NGRTNF+vaccino peptidico.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• UOC Immunoterapia Oncologica,
Azienda Ospedaliera Universitaria,
Siena (Michele Maio)
• Obbiettivo: verificare se cellule di
melanoma esprimono antigeni di tipo
Cancer Testis (CTA) quali MAGE e NYESO1, e se la loro espressione correla
con uno stato de-metilato dei rispettivi
promotori.
Regulation of CTA expression in human
melanoma xenografts by 5-AZA-CdR
Xenografts
Mel 275
Mel 313
Mel 195
5-AZA-CdR
-
-
-
MAGE-1
-
MAGE-2
+
-
MAGE-3
MAGE-4
-
-
MAGE-A10
GAGE 1-6
-
NY-ESO-1
-
PRAME
+
-
-
-
-
-
-
-
+
Recognition of Mel313 clones by a MAGE-3-specific
HLA-B37-restricted CTL clone
350
251,218
IFN (pg/ml)
250
218,05
124,688
150
50
B 37
8,292
B 37 5A ZA -CdR
-50
313#5
313#14
Conclusioni
• La valutazione degli effetti sinergici fra 5AZA-CdR sulla immuno-modulazione del
melanoma ha mostrato che il trattamento
in vitro e in vivo porta ad un aumento di 24 volte nei livelli di espressione di diversi
CTA (es. MAGE-3, NY-ESO-1).
• Indurre aumento di espressione di CTA nei
pazienti (?)
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Unità di Immunoterapia dei Tumori Umani,
Fondazione IRCCS Istituto Nazionale
Tumori Milano (Licia Rivoltini).
• Obbiettivo: Studio delle cellule
immunosoppressive (T regolatorie e
mieloidi) nei pazienti con melanoma.
% CD14+CD11b+HLA-DR-/lo
Myeloid suppressor cells are increased
in peripheral blood of stage II-III melanoma patients
20
N=30
p<0.01
15
p<0-01
N=40
10
5
N=40
0
HD
STAGE IIBIIIC
STAGE IV
MELANOMA
p= 0.0002
15
n.s.
10
p= 0.002
p=0.04
5
e
ag
II
IA
e
ag
St
St
-I
II
C
II
C
II
Be
ag
St
IV
0
H
D
+
%CD4 CD25
high
Foxp3
+
Increased frequency of CD4+CD25Foxp3+ Treg
is a late event in melanoma patients
10
10
(gated on lymphocytes)
% CD4+CD25highFoxP3+ cells
Monitoring T regs : no major effect of low-dose
cyclophosphamide on the frequency of CD4+CD25highFoxp3+
IIB-IIIC HIGH RISK MELANOMA PATIENTS
88
300mg/m2 3-5 days
before vaccination
cyclophosphamide
6
6
4
4
2
2
0
0
HD
P0
P1
VACCINATION ARM
P4
cyclophosphamide
Conclusioni
1. Myeloid suppressor cells are increased
in the peripheral blood of stage II-III
melanoma patients
2. Increased frequency of CD4+CD25FoxP3+
Tregs is a late event in melanoma patients
No major effect of low-dose
cyclophosphamide on the frequency of
CD4+CD25+Foxp3+
3.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Laboratorio di Ricerche in Immunologia e Infiammazione, Istituto
Clinico Humanitas, Milano (Cecilia Garlanda).
• Obbiettivo: Trasferimento clinico delle conoscenze sulle
molecole infiammatorie da utilizzarsi quali potenziali
biomarcatori diagnostici/prognostici delle terapie antitumorali.
• La pentraxina lunga PTX3, proteina di fase acuta, è
espressa nella risposta infiammatoria e svolge il duplice
ruolo di difesa contro i patogeni e di proteina strutturale
della matrice extra-cellulare.
• Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo stato
infiammatorio del paziente alla diagnosi e durante la
terapia, e come marcatore di rischio di infezioni
opportunistiche.
PTX3 expression of liposarcoma specimen and
corresponding normal fat tissue
Normal fat tissue
Pleomorphic liposarcoma
Potential role of PTX3 in the control of tumor growth and metastatic potential:
Increased tumor growth in absence of PTX3 in two different models of murine
fibrosarcoma
5
MCA203 (5x10 c/mice)
tumor volume (cm3)
MCA203:
immunogenic
and non
metastasic
fibrosarcoma
4
*
3
2
*
1
* **
*
*
WT
*
PTX3-/-
0
10
15
20
25
30
35
40
days post injection
MN/MCA1 (105cell/mice)
**
tumor volume
(cm3)
MN/MCA1: non
immunogenic
and metastasic
fibrosarcoma
10
8
6
4
2
0
**
*
*
10
12
14
16
18
20
*
**
*
22
WT
24
days post injection
PTX3 -/-
26
28
30
32
34
Conclusione
• Identificazione di forme tumorali
producenti PTX3: liposarcomi,
condrosarcomi, gliomi.
• Ruolo potenziale di PTX3 nel controllo
della crescita tumorale e della
metastatizzazione.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Laboratorio di Immunoterapia Sperimentale, ISS
(Roma) (Maria Ferrantini )
• Obiettivo: Identificazione di biomarcatori genetici
predittivi della risposta biologica e clinica ai diversi
protocolli di vaccinazione sperimentati nel corso degli
studi clinici di questo progetto.
• Metodica: Strategie basate sul microarray verranno
utilizzate per valutare l’esistenza di possibili correlazioni
tra la risposta clinica e/o immunologica indotta dai
vaccini e la presenza nel DNA dei pazienti di specifici
polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in geni
codificanti citochine e proteine ad esse correlate.
Risultati del primo anno di attività.
Studi pre-clinici
• Istituto Oncologico Veneto IRCCS, Padova
(Paola Zanovello)
• Obbiettivo: Studio pre-clinico della immunogenicità
di hTERT, un antigene da utilizzarsi in studi clinici.
• E’ stata valutata la immunogenicità di diversi epitopi di hTERT presentati in associazione alla molecola HLAA*0201, e la generazione di linee e/o cloni di linfociti T
CD8 specifici per questo antigene.
• A tale scopo sono stati immunizzati topi transgenici HLAA*0201 (topi HHD) con hTERT impiegando diversi
protocolli. Per ciascuna delle modalità di immunizzazione
è stata condotta una valutazione ex vivo mediante
ELISPOT.
CD8+ T cells induced by im DNA vaccination and
electroporation in HHD-mice
DNA
14 days
DNA
250
KILLED
Vaccinated with
h-TERT
14days
No Vaccianted
control
HHD mice showed
strong reactivity
against epitopes R30
and R865
Number of Spots of 0.5x106 CD8+
200
150
100
50
0
0
u
5
-30
-54
86 e-Ne
e
de
e
i
d
t
d
d
p
pti
pti
pti
pe
pe
pe
pe
0
u
0
5
-54
86 e-Ne
e-3
e
d
e
i
d
d
d
pt
pti
pti
pti
pe
pe
pe
pe
Cytotoxic activity of T cells obtained after several cycles of in
vitro re-stimulation was measured against a panel of HLA-A2
human tumor cell lines
MLPC from HHD mice vaccinated with hTERT
stimulated with peptide-865
MLPC from HHD mice vaccinated with hTERT
stimulated with peptide-30
100
100
80
% Cr51 relesed
% Cr51 relesed
80
293A2-p865
293A2-p30
293A2-pNeu
SW480
SK-OV-3
U266
LnCap
60
40
60
40
20
20
0
0
100:1
33:1
11:1
Effector : Target cells ratio
3:1
100:1
33:1
11:1
3:1
Effector : Target cells ratio
nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with irradiated and peptide pulsed splenocytes
Conclusioni
I risultati ottenuti non hanno dimostrato
significative differenze fra i diversi
protocolli utilizzati per immunizzare.
La fase di valutazione pre-clinica è stata
completata studiando la capacità di
riconoscere in vivo in topi Rag2(-/-) una
linea tumorale umana di ca della prostata
da parte delle linee T CD8 specifiche per
l'epitopo R865 o per l'epitopo R30.
Obiettivi clinici
Tre studi clinici sono proposti:
Uno coordinato dall’Unità di IST di Genova: Studio di
fase I-II di vaccinazione con oncolisato cellulare di
melanoma autologo associato ad IFN-α2b in
pazienti con melanoma metastatico;
Due coordinati da HSR (Milano) e comprendenti, a)
Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad alte dosi
per un mese in combinazione con vaccino peptidico
in pazienti con melanoma metastatico (M1a/b); b)
Studio di fase I-II di combinazione di NGR/TNF (antiangiogenico MolMed) e vaccino peptidico in pazienti
con melanoma o carcinoma del colon.
Risultati del primo anno di attività.
Studi clinici
• Istituto per lo Studio e la Cura dei Tumori
IRCCS Genova (Paola Queirolo)
• Obbiettivo: Attivare il protocollo clinico. Nel
corso del primo anno l’Oncologia Medica A e il
Laboratorio di Terapia Immunologica dell’IST si
sono occupati della stesura del protocollo dello
studio clinico.
• La preparazione del vaccino avverrà in regime di
GMP presso il centro di biotecnologie avanzate
dell’IST.
•
Risultati del primo anno di attività.
Studi clinici
• Il documento riassuntivo di tale protocollo era stato
oggetto di una pre-audizione presso l’ISS/AIFA che ha
suggerito alcune revisioni. Attualmente è stata redatta
una versione rivista del protocollo che è in fase di
sottomissione all’ISS.
• Inoltre sono state preparate le istruzioni operative
inerenti al processo di preparazione del vaccino ed è
stata ultimata la stesura del Technology Transfer Report.
• Il ritardo nella ri-sottomissione del protocollo è legato alla
necessità di eseguire adeguamenti strutturali del
laboratorio GMP dell’IST, sulla base della normativa
vigente. Infatti tale struttura non è ancora stata
approvata e verrà valutata nel corso della site-visit
ministeriale per questo protocollo.
Conclusione
• Nel corso del primo anno i gruppi IST
hanno svolto una preziosa attività di
preparazione della struttura GMP che si
intende utilizzare, ridefinito il protocollo e
iniziato uno studio delle possibili reazioni
allergiche che possono comparire in
pazienti trattati con alte dosi di IFNα2a.
Risultati del primo anno di attività.
Studi clinici
Unità di Immuno-Bioterapia dei Tumori Solidi, HSR
(G. Parmiani)
Obbiettivo: Iniziare le procedure per attivare due
studi clinici.
1. Studio di fase II randomizzato di IFN-α2b ad
alte dosi in combinazione con vaccino
peptidico in pazienti con melanoma
metastatico (M1a/b);
2. Studio di fase I-II di combinazione di
NGR/TNF (anti-angiogenico MolMed) e
vaccino peptidico in pazienti con
melanoma o carcinoma del colon.
Risultati del primo anno di attività.
Studi clinici
• L’attivazione degli studi è stata bloccata
dalla repentina impossibilità di utilizzare
peptidi per questi protocolli in Europa
(gennaio 2008).
• Dopo un anno di discussione con diverse
industrie Biotech e i colleghi europei
interessati, si è finalmente arrivati a poter
utilizzare nuovi peptidi, acquistati in forma
consortile per renderne il costo compatibile
con i finanziamenti. I peptidi saranno
disponibili entro aprile 2009.
• .
Risultati del primo anno di attività.
Studi clinici
• Tuttavia il costo costringe a ridurre da 4 a 2 il
numero di peptidi vaccinali che verranno
inoculati nei pazienti. Le due industrie
interessate agli studi (ma non sponsors)
confermano la possibilità di fornire gratuitamente
i farmaci da combinare col vaccino (IFN-α2b e
NGR/TNF).
• Ciò ha costretto a rivedere in parte i protocolli
che verranno presentati alle autorità regolatorie
entro marzo/aprile 2009.
Conclusioni generali dopo il
primo anno di attività
• Due incontri si sono tenuti per l’avvio e la verifica
dei programmi in corso con la partecipazione
delle Unità coinvolte.
• Nuove informazioni sono state ottenute a
livellopre-clinico per migliorare il disegno degli
studi clinici di combinazione immuno-bioterapia.
• I protocolli clinici previsti potranno iniziare il
reclutamento dei pazienti entro giugno 2009.
Adoptive-Transfer of mTERT-specific CTLs in TRAMP mice
causes reduction of peripheral blood lymphocytes
Autoimmunity side effect ?
8
5
7
4
**
6
β-Gal T cells
5
mTERT T cells
β-Gal T cells
3
mTERT T cells
4
3
2
*
2
1
1
0
0
WBC x10E03/µL
*Student t test P=0.0002
RBC 10E06/µL
NEUT10E03/µL
LYM 10E03/µL
**Student t test P=0.00002
MONO 10E03/µL
Effects of low dose cyclophosphamide and IL-2 on
CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells in PBMC
% FoxP3+CD25+ in CD4+ T cells
CTX1
IL-2
Surgery
CTX2
V1
V0
V2
V3
V5
Ex vivo recognition of Mart-1 peptide (by IFNγ ELISpot) and
2
50
follow-up (12m)
follow-up (6m)
p6
p4
p2
0
1
p1
p6
0
p4
0
p2
2
p1
10
p0
4
0
+
20
3
100
Foxp3
6
4
150
high
30
5
INT-004
p0
8
N. IFN Spots 2x10 5 CD8 +
INT-001
200
+
40
10
%CD4 CD25
50
%CD4+CD25highFoxp3+
N. IFN Spots 2x105 CD8+
Treg frequency in vaccinated melanoma patients
Low frequency of Treg cells in prostate carcinoma
patients with biochemical recurrence:
Tregs frequency may depend on tumor burden
p<0.01
%CD4+CD25highFoxp3+ in G1
7
6
5
4
n.s.
3
2
1
0
HD
N=10
Prostate
carcinoma
with
biochemical
recurrence
N=22
Metastatic
prostate
carcinoma
N=6
Potenziale diagnostico di PTX3 in
patologia neoplastica
Cecilia Garlanda
Laboratorio di Ricerche di Immunologia
Istituto Clinico Humanitas, Rozzano, Milano.
PTX3: a multifunctional soluble Pattern Recognition Receptor
(Garlanda C. et al. Ann. Rev. Immunol. 2005)
Diagnostic potential of PTX3 in
human pathology
• Hischemic heart disease and heart failure
(Circulation 2000, 2004)
• Sepsis (Mueller et al. Crit. Care Med. 2001)
• Small vessel vasculitis (Arthritis Rheum 2001, 2006)
• Atherosclerosis (Rolph et al. Arterioscler.Thromb.Vasc. Biol.2002)
• RA (Lucchetti et al. Clin. Exp. Immunol. 2000)
• Infections: TBC, Dengue (Microbes Infect. 2005, J med
virol.2005)
• Preeclampsia (Am J Obstet Gynecol. 2006;194:1347-53; Obstet Gynecol.
2006;108: 148-55)
• Preterm delivery (B.J.Ob.Gy. 2007)
Functional characterization of hTERT 865 and hTERT30-specific
CD8 T cells obtained from HHD vaccinated mice
IFN- released (pg/ml)
20000
18000
T cells
hTERT 865-CTLs
16000
T cells
hTERT 30-CTLs
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
293A2 293A2
p865
p30
293A2
pNeu
SW480 SK-OV-3 U266
LnCap
nine restimulations of CD8 T cells from hTERT immunized HHD mice with irradiated and peptide pulsed splenocytes
MAGE-3 mol/b-actin mol (x10-3)
Levels of MAGE-3 mRNA expressed by
different single cell clones from Mel 313
melanoma cell line
7
5
3
1
Mel 313
cell line
1
2
3
4
5
6
7
Clone
8
9
10
11
12
13
14
MAGE-3 mol/b-actin mol
Up-regulation of MAGE-3 expression in single cell clones
from Mel 313 cells by 5-AZA-CdR
1,6x10-2
3x10-3
1,2x10-2
2x10-3
8x10-3
1x10-3
0
4x10-3
Clone 5
0
Clone 14
NY-ESO-1 mol/b-actin mol
Persistency of 5-AZA-CdR-induced CTA expression in
human melanoma xenografts
1,2E-03
9,0E-04
6,0E-04
3,0E-04
0,0E+00
5
10
20
30
CELLULAR SOURCES OF PTX3
TLR AGONISTS
(e.g. LPS)
PMN
Mø
PRIMARY INFLAMMATORY
CYTOKINES (IL-1, TNF)
myeloid
DC
IL-10
fibroblasts adipocytes
mesangial
cells
SMC
MATRIX
DEPOSITION
OXIDIZED
LDL
endothelium
GDF9
FSH, cAMP, EGF
(+ oocyte)
granulosa
cells
FERTILITY
PTX3
INNATE
IMMUNITY
Resistance to A. fumigatus,
P. brasiliensis,
P. aeruginosa,
K. pneumoniae,
CMV
…
Tuning
inflammation
(Garlanda Bottazzi and Mantovani
Annu Rev Immunol 2005; Bottazzi
Curr Op Immunol 2006)
Valutazione dei livelli serici di PTX3 in diverse forme
tumorali
-Trovata in liposarcoma, condrosarcoma, glioma, carcinoma ovarico,
polmonare e mammario, AML, ALL (Willeke et al. Eur J Cancer, 2006)
SCOPO:
Valutare le potenzialità diagnostiche di PTX3 sullo
stato infiammatorio del paziente alla diagnosi e
durante la terapia, e come marcatore di rischio di
infezioni opportuniste.
Obiettivi (1)
Sulla base di studi pre-clinici già condotti o
da condurre nell’ambito del programma,
identificare i potenziali meccanismi di
sinergia anti-tumorale per combinare due
o più agenti terapeutici di cui almeno uno
di tipo biologico in protocolli clinici di fase
I-II.
PTX3 deficiency is associated with increased tumor growth
and metastatic potential
Primary tumor weight
Number of lung metastasis
75
15.0
n°of lung metastasis
tumor weight (gr)
17.5
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
WT
PTX3 -/-
P value
50
0.0106 **
25
0
3
WT
PTX3 -/-
Lung metastasis volume (mm )
3
metastasis volume (mm )
250
P value 0.0224
*
200
150
100
50
0
WT
PTX3 -/-
Mice were sacrificed at 32 days after s.c.
injection with MN/MCA1 fibrosarcoma (10*5
cell/mice)
Conclusioni
• Al momento, oltre a numerosi ulteriori
tentativi di messa a punto di un
protocollo efficace per l’utilizzo dei
vetrini di microarray prodotti “in
house”, il gruppo sta valutando la
possibilità di procedere con l’acquisto
di una diversa piattaforma di
microarray commercialmente
disponibile.