DIPARTIMENTO DI FISIOPATOLOGIA CLINICA
PROGETTO
Determinazione quantitativa di piccole molecole in Spettrometria di Massa
RESPONSABILE SCIENTIFICO: Dr.ssa Giovanna Danza
COLLABORATORI: M. Serio, M. Mannelli, A. Pieri
L’endocrinologia clinica, così come la ricerca in campo endocrinologico, non può
prescindere dal dosaggio quantitativo degli ormoni. E’ per questo motivo che i
metodi quantitativi in spettrometria di massa in diluizione isotopica (MS-ID), cioè
con l’utilizzo di standard interni deuterati,
sono da sempre uno strumento
indispensabile per questa disciplina. Questi metodi hanno caratteristiche di
sensibilità, specificità, precisione ed accuratezza tali da renderli metodi definitivi o
di riferimento per il dosaggio di molte piccole molecole come ad esempio gli
ormoni steroidei ed altri ormoni non peptidici. Ancora oggi, nonostante il continuo
progredire e la sempre maggiore standardizzazione dei metodi di dosaggio
immunologici, i metodi MS-ID rimangono insostituibili non solo per il controllo delle
metodiche di routine ma anche per il dosaggio di quegli ormoni presenti a basse
concentrazioni nel plasma che possono presentare, con i metodi immunologici,
problemi di cross-reattività. Ne è un esempio il diidrotestosterone (DHT) il cui
dosaggio immunologico, a causa delle interferenze dovute al testosterone, fornisce
risultati poco attendibili quando confrontati con quelli ottenuti con il metodo
GC/MS-ID.
Sulla base di queste considerazioni nella sezione di Endocrinologia del
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica stiamo
sviluppando un progetto per la
messa a punto e la successiva applicazione alla diagnostica clinica di metodi
GC/MS-ID o LC/MS-ID per il dosaggio degli ormoni correlati alle patologie
ipertensive di tipo endocrino. L’ipertensione arteriosa costituisce uno dei problemi
principali di salute pubblica nel mondo occidentale, rappresentando un fattore di
rischio maggiore per la malattia cerebrovascolare, per la cardiopatia ischemica e
per l’insufficienza renale. La sua prevalenza si aggira intorno al 25% dei soggetti
adulti e raggiunge valori del 60% nella popolazione sopra i 60 anni. Le ipertensioni
secondarie (IS) sono presenti in circa il 10-15% dei pazienti ipertesi ed una loro
corretta e precoce identificazione, in particolare delle forme endocrine, permette di
instaurare la specifica terapia medica. Le IS comprendono principalmente le
ipertensioni endocrine a bassa renina, che hanno nell’iperaldosteronismo primitivo
(IP) e nella sindrome da apparente eccesso di mineralcorticoidi (AME) gli esempi
prototipici, ed i tumori cromaffini quali il feocromocitoma (Feo) ed i paragangliomi
(PGL). Esistono tuttavia ancora notevoli difficoltà diagnostiche dovute a
problematiche metodologiche dei tests biochimici utilizzati per la diagnosi. Per
quanto riguarda l’ IP è nostra intenzione mettere a punto una metodica per il
dosaggio quantitativo del tetraidroaldosterone 3-alfa glucuronide urinario; la
valutazione in MS-ID del rapporto cortisolo/cortisone liberi urinari sarà invece
utilizzata sia per la diagnosi di AME sia per una valutazione dell’ utilità di questo
parametro nell’indirizzare la terapia dei pazienti ipertesi essenziali a bassa renina e
con elevata sodio-sensibilità dei valori pressori. Infine intendiamo sviluppare e
portare in routine clinica un metodo LC/MS-ID per il dosaggio delle metanefrine
plasmatiche che costituiscono un parametro essenziale nella diagnosi dei tumori
cromaffini.
Un esempio di utilizzo di metodi quantitativi in spettrometria di massa in un
progetto non finalizzato direttamente alla clinica
è invece quello del dosaggio
quantitativo del colesterolo cellulare nell’ambito dello studio dell’attività enzimatica
di seladin-1 in relazione al suo effetto neuroprotettivo.
Seladin-1 è un gene
recentemente scoperto come down-regolato in quelle zone celebrali maggiormente
colpite dalla patologia di Alzheimer. Si prospetta come un gene multifunzionale in
quanto la proteina da esso codificata è anche l’enzima finale della cascata
biosintetica del colesterolo. Lo studio da noi intrapreso è volto a delucidare la
regolazione ormonale di questo gene e il possibile legame tra la sua funzione
neuroprotettiva e la sua attività enzimatica. Nell’ambito di questo studio era
necessario servirsi di un metodo per il dosaggio del colesterolo cellulare che
garantisse particolari caratteristiche di precisione ed accuratezza per essere in
grado di valutare anche piccole variazioni della concentrazione di questa molecola
in sistemi cellulari che sono caratterizzati da potenti meccanismi per il
mantenimento dell’omeostasi di questo lipide. Il metodo GC/MS da noi messo a
punto ci ha permesso di rilevare con sufficiente accuratezza le variazioni di
concentrazione del colesterolo cellulare e di correlarle con le variazioni di
espressione di seladin-1. La prospettiva futura è quella di sviluppare un metodo
per la determinazione dell’attività enzimatica di questo enzima mediante l’utilizzo di
un substrato marcato con deuterio.
Università degli studi di Firenze
Dipartimento di Fisiopatologia Clinica
Sezione di Endocrinologia
Determinazione quantitativa di piccole
molecole in Spettrometria di Massa
Giovanna Danza
Endocrinologia e Spettrometria di Massa:
le basi storiche di un connubio
L’endocrinologia clinica non può prescindere dalla misura quantitativa
degli ormoni
La GC/MS/ID è divenuta la tecnica elettiva per lo sviluppo di metodi
quantitativi di dosaggio degli steroidi
GC/MS/ID
SPECIFICITA’
ACCURATEZZA
PRECISIONE
SENSIBILITA’
GC/MS/ID
SPECIFICITA’
ACCURATEZZA
PRECISIONE
SENSIBILITA’
METODI
IMMUNOLOGICI
COMPETITIVI
NON COMPETITIVI
Costi elevati
Personale
specializzato
Complessità dei
metodi
METODI
DEFINITIVI
METODI
DI RIFERIMENTO
Costi contenuti
Semplicità di
utilizzo
Rapidità
METODI
DI ROUTINE
European Male Ageing Study
E.M.A.S.
Testosterone
26
r = 0.95
24
22
20
Testosterone nmol/L
immunologico
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Testosterone nmol/L
GC/MS/ID
18
20
22
24
26
European Male Ageing Study
E.M.A.S.
Diidrotestosterone
2600
r = 0,19
2400
2200
2200
2000
2000
Diidrotestosterone pg/mL
immunologico
Diidrotestosterone pg/mL
immunologico
2600
r = 0.31
2400
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Diidrotestosterone pg/mL
GC/MS/ID
400
450
500
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Diidrotestosterone pg/mL
GC/MS/ID
Sviluppo di metodi non immunologici per la
diagnostica dell’ipertensione endocrina
G. Danza, G. Parenti, M. Serio, M. Mannelli
L’ipertensione arteriosa costituisce uno dei problemi principali di salute
pubblica nel mondo occidentale, rappresentando un fattore di rischio maggiore
per la malattia cerebrovascolare, per la cardiopatia ischemica e per
l’insufficienza renale. La sua prevalenza si aggira intorno al 25% dei soggetti
adulti e raggiunge valori del 60% nella popolazione sopra i 60 anni.
ipertensione arteriosa essenziale
90-95%
ipertensioni endocrine a bassa renina
ipertensione secondaria
5-10%
iperaldosteronismo primitivo
sindrome da apparente
eccesso di mineralcorticoidi
Tumori cromaffini
feocromocitoma
paraganglioma
Tetraidroaldosterone
3-α glucuronide urinario
ipertensioni endocrine a bassa renina
iperaldosteronismo primitivo
sindrome da apparente
eccesso di mineralcorticoidi
Tumori cromaffini
Rapporto cortisolo/cortisone
liberi urinari
feocromocitoma
paraganglioma
Catecolamine e Metanefrine
plasmatiche
Studio della funzionalità enzimatica di
SELADIN-1/DHCR24
in modelli cellulari neuronali
G. Danza, F. Rosati, S. Benvenuti, P. Luciani, M. Serio,
A.Peri
Seladin-1:
una proteina “multifunzionale”
Ha una funzione neuroprotettiva ed antiapoptotica
in modelli cellulari neuronali
‰
E’ un enzima del tratto post-squalenico della biosintesi
del colesterolo che, con attività ∆24 riduttasica,
trasforma il desmosterolo in colesterolo
‰
‰ Sembra
avere un ruolo oncosoppresivo perchè è
coinvolto nella risposta cellulare allo stimolo
oncogenico di Ras.
Benvenuti et al.
J Clin Endocrinol Metab.
2005 ;90(3):1775-82.
1,6
*
*
p = 0.0274
*
p = 0.0443
E-9
E-8
E-7
p = 0.0347
1,4
ng/µl colesterolo
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
CTRL
E-10
[E ]
2